全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(3): 395−402 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2006AA10Z156)，广东省自然科学基金项目(06025389和 07117967)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 梁炫强，E-mail: Liang804@yahoo.com
第一作者联系方式: E-mail: hongyanbin1979@yahoo.com.cn
Received(收稿日期): 2008-05-16; Accepted(接受日期): 2008-09-11.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.00395
花生栽培种 SSR遗传图谱的构建
洪彦彬 梁炫强* 陈小平 刘海燕 周桂元 李少雄 温世杰
广东省农业科学院作物研究所, 广东广州 510640
摘 要: 花生栽培种品种间分子多态性相对缺乏, 至今未构建出较完整的分子遗传图谱。本研究以粤油 13和阜 95-5
为亲本, 通过杂交构建包含 184个 F6重组自交系的遗传作图群体。采用 652对 genomic-SSR引物和 392对 EST-SSR
引物对亲本进行多态性检测, 从中筛选出 121对多态性引物, 在亲本中共检测到 123个多态性位点。利用作图群体对
多态性 SSR 位点进行遗传连锁分析, 获得包含 108个 SSR 标记(102 个 genomic-SSR 标记和 6个 EST-SSR标记), 涉
及 20个连锁群, 总长 568 cM, 平均图距为 6.45 cM的花生栽培种遗传图谱。与前人构建的花生野生种(A. duranensis ×
A. stenosperma, AA genome) SSR遗传图谱比较, 初步确定本研究构建的遗传图谱中有 11个连锁群与野生种遗传图谱
的 6个连锁群存在同源关系。
关键词: 花生; SSR; 遗传图谱
Construction of Genetic Linkage Map in Peanut (Arachis hypogaea L.) Culti-
vars
HONG Yan-Bin, LIANG Xuan-Qiang*, CHEN Xiao-Ping, LIU Hai-Yan, ZHOU Gui-Yuan, LI Shao-Xiong,
and WEN Shi-Jie
Crops Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China
Abstract: Molecular genetic map is a fundamental organizational tool for genomic research. However, a comprehensive genetic
linkage map for peanut cultivars has not yet been developed due to extremely low levels of DNA polymorphisms in cultivated
peanut. In this study, 184 recombinant inbred lines (RIL), derived from a cross between two Spanish type peanut cultivars
(Yueyou 13 × Fu95-5), were used as mapping population. A total of 652 pairs of genomic-SSR primers and 392 pairs of EST-SSR
primers were used to detect the polymorphisms between the parental cultivars. Of them, 121 SSR primer pairs amplified 123 seg-
regating loci and were selected to analyze the RIL population. A genetic linkage map consisting of 108 SSR loci (102 ge-
nomic-SSR and 6 EST-SSR) in 20 linkage groups and covers 568 cM with an average distance of 6.45 cM of intermaker was con-
structed. By comparing the SSR genetic map of Arachis (A. duranensis × A. stenosperma) with AA genome, 11 linkage groups in
the linkage map constructed in this study were confirmed to have homology with 6 linkage groups of wild peanut species.
Keywords: Peanut (Arachis hypogaea L.); SSR; Genetic linkage map
分子遗传图谱是植物基因组结构分析和比较的
有力工具, 已被广泛应用于基因定位、图位克隆、
比较基因组学和分子标记辅助育种等研究。花生栽
培种(Arachis hypogaea L.)属落花生属(Arachis)花生
区组(Arachis section), 异源四倍体(2n = 4x = 40,
AABB), 是国际上重要的油料作物之一。一直以来,
花生栽培种分子遗传图谱的构建备受各国学者重
视。但早期研究发现 RFLP、RAPD和 AFLP在花生
栽培种间缺乏多态性[1-3], 致使遗传图谱构建进展缓
慢。基于上述标记构建的花生栽培种遗传图谱鲜见
报道。虽然 Herselman等[4]曾利用 AFLP标记在栽培
种上构建了部分连锁图, 但该连锁图只包含 12个标
记。近年来, 系列研究表明 SSR 在花生栽培种间具
有较丰富的多态性[5-6], 使利用 SSR标记构建花生栽
培种遗传图谱成为可能。然而, 现有的花生 SSR 引
物数量仍不能满足图谱构建的需求。姜慧芳等[7]曾
396 作 物 学 报 第 35卷


利用 SSR 标记构建花生栽培种分子遗传图谱, 但由
于当时花生上可利用的 SSR 引物数量不多, 只获得
包含 29个标记的部分连锁图。近期, 大量快速增长
的 EST数据成为 SSR的重要来源, 并为 SSR标记的
开发提供了一条新的途径[8]。本文利用 392 对 EST-
SSR 引物和 652 对 genomic-SSR 引物开展花生栽培
种分子遗传图谱构建研究, 并通过与前人构建的花
生野生种 SSR 遗传图谱的比较, 探讨栽培种和野生
种图谱间连锁群的对应关系, 为将来花生属遗传图
谱的整合与利用打下基础。
1 材料与方法
1.1 作图群体的构建
以粤油 13为母本, 阜 95-5为父本进行杂交, 经
过多代自交获得包含184个单株的F6重组自交系(RIL)
作图群体。粤油 13是广东省农业科学院作物研究所
育成并通过国家花生品种审定的高产品种, 属珍珠
豆型, 阜 95-5同属珍珠豆型, 是高油品种。
1.2 花生基因组 DNA提取
选取苗期的花生嫩叶, 采用 CTAB 法提取基因
组 DNA[9], 用 0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 质
量, 并根据对照 DNA 的亮度估计花生基因组 DNA
的浓度。
1.3 SSR分析
共 1 044对 SSR (652 genomic-SSR和 392 EST-
SSR)引物用于本研究分析, 其中 290对 EST-SSR引
物由本课题组开发, 用 EM和 EE表示, 其余 754对
引物来自已发表的文献[10-17]。PCR 在 PE9700 热循
环仪(美国 ABI 公司生产)上进行。首先在亲本间筛
选多态性引物, 将其用于下一步的作图群体分析。
PCR体系(20 μL)含 1×PCR buffer (50 mmol L−1
KCl, 10 mmol L−1 Tris-HCl, pH 8.3, 1.5 mmol L−1
MgCl2, 0.1%明胶), 1 U Taq DNA聚合酶, 50~100 ng
模板 DNA, 0.15 μmol L−1引物, 0.2 mmol L−1 dNTP。
反应程序为 94℃ 5 min; 94℃ 1 min, 55℃ 30 s, 72℃
1 min; 35个循环, 72℃ 5 min。扩增产物在 6.0%非变
性聚丙烯酰胺凝胶中电泳(电泳缓冲液 1×TBE, 电压
150 V, 时间 1 h), 0.1% AgNO3染色, BIORAD凝胶成
像系统下观察、照相、读带。
1.4 数据记载及连锁分析
作图群体各株系中带型与母本相同的记为 a,
与父本相同的记为 b, 带型不清或者缺失者记为 n。
运用 JoinMap 3.0 构建遗传图谱, 先用 New project
命令创建一个新的文件夹, Load data命令导入标记
数据, 再用命令 Individual genot freq排除缺失数据
过多的单株, 用 Locus genot freq命令分析标记的偏
分离情况, 然后用 Group 命令进行分组, 最后 Map
命令构建连锁图谱, 采用 Kosambi函数计算图距。
1.5 EST-SSR标记的功能注释
利用 Blastx (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)
将整合在遗传图谱上的 EST-SSR 标记与 GenBank
蛋白质数据库比对, 并对其功能进行注释。
2 结果与分析
2.1 亲本遗传多态性的 SSR分析
1 044 对用于双亲(粤油 13 和阜 95-5)多态性检
测的 SSR引物中有 901对扩增带型清晰, 重复性好,
其余 143对(97 genomic-SSR和 46 EST-SSR)无扩增
产物或者扩增带型模糊。扩增带型清晰的 901 对引
物中有 121对(113 genomic-SSR和 8 EST-SSR)在亲
本间具多态性, 共检测出多态性位点 123 个, 多态率
为 13.7%。其中引物 pPGPseq3E10和 pPGSseq15B4
各检测出两个多态性位点。
2.2 遗传图谱构建
采用 123 个多态性标记对作图群体 187 个单株
进行扩增(图 1)，利用 JoinMap软件对扩增结果进行
遗传连锁分析。在 LOD≥3.0的条件下, 共有 108个
标记(102 genomic-SSR 和 6 EST-SSR)进入连锁群,
其余 15个标记未能归入连锁群。所构建的分子遗传
图谱涉及 20 个连锁群(图 2), 总长 568 cM, 连锁群
长度介于 7.0~56.8 cM, 标记间的平均图距为 6.45
cM, 连锁群标记数 2~11个(表 1)。
图谱上的 SSR标记并不平均分布在各个连锁群
上。不同连锁群上标记数差异大, 其中标记数超过
10的连锁群有 3个, 标记数介于 5~10个的连锁群有
7 个, 其余 10 个连锁群标记数只有 2~4 个。由于图
谱的标记数相对较少, 10 cM 以上的空隙普遍存在,
其中有 7个距离超过 20 cM。
2.3 偏分离分析
在 184 个株系的 RIL 群体中, 共统计了 123 个
位点的基因型分布。后代具有母本粤油 13基因型的
平均频率为 48.9%, 基因型频率分布范围在 28.6%~
69.0%。后代具有父本阜 95-5 基因型的平均频率为
51.1%。基因型频率介于 31.0%~71.4%。双亲基因型在
第 3期 洪彦彬等: 花生栽培种 SSR遗传图谱的构建 397




图 1 SSR引物 EM-87和 TC1D02在作图群体中的扩增结果
Fig. 1 Amplification of SSR primer pairs EM-87 and TC1D02 in mapping populations
M: marker, 1~20: 作图群体单株编号，P1: 粤油 13，P2: 阜 95-5。
20个单株中只有 2个单株(3和 7)出现重组，由此可判断两个引物扩增的位点存在连锁关系。
M: marker, 1–20: Number of individuals in mapping population, P1: Yueyou 13, P2: Fu 95-5. In 20 individuals,
only 2 individuals (3 and 7) show recombination, from which we can deduce that there is a genetic linkage between the two loci.


群体中的分离比相近, 符合 1︰1的分离比例。
遗传图谱上 108个位点的基因型中, 有 93个位
点经 χ2检验符合 1︰1 分离比。其余 15 个(13.89%)
位点出现偏分离, 其中 11个偏向母本基因型, 4个偏
向父本基因型。偏分离标记分布在 8个连锁群上, 5
个在 Lg1, 3个在 Lg8, 2个在 Lg7, 其余 5个分别落
在 Lg5、Lg10、Lg13、Lg14和 Lg16上(图 1)。
2.4 EST-SSR位点的假定功能分析
与 genomic-SSR不同, 来自基因/EST的 SSR代
表一类有功能的分子标记[18], 在物种间具有很高的
可转移性, 通过它们可揭示花生不同遗传背景下标
记所对应基因的功能, 从而有可能阐明花生属重要
形态学和生理学性状的发生机制。本研究利用
Blastx 工具将遗传图谱上 6 个 EST-SSR 标记与
GenBank 蛋白质数据库进行比对, 结果发现 6 个标
记均能找到与之匹配的蛋白质(表 2)。其中 4个标记
(RI1F06、EM-87、EE-16和 EM-31)与数据库的蛋白
质高度同源, 根据功能注释结果推断 EM-87、EE-16
和 EM-31分别参与了代谢、翻译和抗逆等生命过程。
另外 2个标记(RN0x615和 EM-152)同源性很低, 可
能是花生栽培种所特有的。
2.5 与野生种遗传图谱的比较分析
Moretzsohn等[15]等利用 SSR构建了花生野生种
(A. duranensis × A. stenosperma, AA genome)遗传图
谱, 该图谱是当前国际上唯一的花生野生种 SSR 遗
传图谱。为研究花生栽培种和野生种遗传图谱间连
锁群的对应关系, 本研究对两张图谱进行比较, 结
果表明, 11 个标记为两图谱所共有, 位于栽培种 11
个连锁群, 但在野生种上却只分布在 6 个连锁群(表
3)。SSR 标记属于特异性标记, 在花生区组 A 和 B
基因组中具有很高的可转移性 [6], 同时相关研究证
明花生区组 A和 B基因组间连锁群同源性高[19]。因
此根据连锁群上的公共标记可以判断栽培种和野生
种之间连锁群是否同源。通过比较初步判断连锁群
Lg1、Lg2 和 Lg3 与 Group2、Lg5 与 Group3、Lg9
和 Lg11 与 Group5、Lg19 与 Group6、Lg7 和 Lg14
与 Group7、Lg4 和 Lg6 与 Group8 存在一定的同源
性。本研究发现栽培种多个(2或 3)连锁群与野生种
单个连锁群同源。这些栽培种连锁群可能分别来自
A 和 B 基因组的同源染色体, 也可能来自同一条染
色体。由于本图谱的标记数尚少, 连锁分析时可能
会因为标记间空隙太大而将来自同一染色体的标记
归到两个连锁群上。但如果两个公共标记在野生种
图谱上的距离小, 就可以判断栽培种对应的连锁群
并非来自同一染色体, 而是来自 A和 B基因组的同
源染色体。观察野生种图谱上的公共标记 , 发现
Group2上标记 PM32与 TC4F12的距离为 14.6 cM,
与 TC7H11的距离为 110.4 cM, TC4F12与 TC7H11
的距离为 95.8 cM。Group5上 PM36与 AH4-26的距
离为 2.5 cM, Group7上 PM204与 TC4G10的距离为
26.5 cM, Group8上 PM188和 TC9F10的距离为 2.2
cM。根据标记间的距离推断 Lg1 和 Lg2、Lg7 和
Lg14、Lg4 和 Lg6 来自不同基因组的同源染色体。
而 Lg3可能与 Lg1或 Lg2来自同一条染色体。
398 作 物 学 报 第 35卷




图 2 基于 SSR标记构建的花生栽培种遗传图谱
Fig. 2 Genetic linkage map of peanut (Arachis hypogaea L.) based on SSR markers
偏分离标记用*表示, 标记扩增 2个位点分别在标记名后面用 1和 2表示。
*: significant distortions; 1 and 2 indicate two loci amplified.
第 3期 洪彦彬等: 花生栽培种 SSR遗传图谱的构建 399


表 1 花生栽培种分子遗传图谱的基本特征
Table 1 Main characteristis of genetic linkage map in peanut
(Arachis hypogaea L.)
连锁群
Linkage group
长度
Length (cM)
标记数
No. of
markers
平均距离
Average distance
(cM)
1 53.3 11 5.33
2 10.2 6 2.04
3 43.7 11 4.37
4 23.0 5 5.75
5 56.7 11 5.67
6 55.2 9 6.90
7 23.8 4 7.93
8 15.5 3 7.75
9 8.0 4 2.67
10 56.8 10 6.31
11 29.9 7 4.98
12 17.8 2 17.80
13 42.7 8 6.10
14 36.1 5 9.03
15 7.6 2 7.60
16 7.0 2 7.00
17 13.4 2 13.40
18 24.9 2 24.90
19 9.8 2 9.80
20 32.6 2 32.60
Total or
mean 568.0 108 6.45

3 讨论
本研究基于 SSR标记构建了一张包含 108个标
记, 涉及 20个连锁群的花生栽培种分子遗传图谱。
但相对于庞大的花生基因组, 该图谱尚未饱和。图
谱的总长度只有 568 cM, 远小于 Burow等[19]构建的
花生栽野杂交{[A. batizocoi × (A. cardenasii × A.
diogoi)]4x × A. hypogaea} RFLP遗传图谱(2 210 cM,
370 个标记), 甚至小于 Halward 等[20]构建的花生野
生种(A. stenosperma × A. cardenasii) RFLP 遗传图谱
(1 063 cM, 117个标记)和 Moretzsohn等[15]构建的花
生野生种(A. duranensis × A. stenosperma) SSR遗传
图谱(1 230.89 cM, 170个标记)。导致本图谱总长度
偏小的原因除与图谱包含的标记数少外, 也与所采
用的分析软件有关。利用 JoinMap 软件构建的图谱
长度通常比用 Mapmaker 和 OUTMAP 软件构建的
小[21-23]。根据本图谱上标记的顺序, 利用 Mapmaker
软件重新计算图谱的距离, 结果为 721 cM, 大于
JoinMap计算的长度。由于 Mapmaker采用的多基因
座概率函数算法, 假设染色体重组不存在交换干涉,
因此, 即使两个软件都使用 Kosami 函数, 当交换干
涉出现时, JoinMap软件绘制出的图谱长度通常都会
偏小[24]。

表 2 Blastx对遗传图谱上 6个 EST-SSR标记的功能注释
Table 2 Functional annotation of 6 EST-SSR markers located on the linkage map by Blastx
标记
Marker
阅读框架
ORF
期望值
E-value
序列号
Accession No.
功能
Function
物种
Species
RI1F06 5′ UTR 2.00 E−10 CAN84007 hypothetical protein Vitis vinifera
RN0x615 3′ UTR 9.10 E+00 XP_425714 Similar to Foxc1 protein Gallus gallus
EM-87 5′ UTR 1.00 E−21 CAC85667 Zeta-carotene desaturase Citrus sinensis
EM-152 Coding region 2.10 E+00 NP_199887 Metal ion binding Arabidopsis thaliana
EE-16 Coding region 3.00 E−25 Os03g0685500 CHCH Oryza sativa
EM-31 5′ UTR 1.00 E−36 AAT44927 Putative AP2/EREBP transcrip- tion factor Arabidopsis thaliana

EST-SSR 作为一种新型标记, 近年来开始被用
于遗传作图。EST-SSR除具有一般 SSR分子标记特
点外, 还有以下特殊优势: (1) 信息量大。如果发现一
个 EST标记和某一性状连锁, 则该 EST就可能与控
制此性状的基因相关[25-26]; (2) 通用性好。由于 EST
来自转录区, 其保守性较高, 故具有较好的通用性,
这在亲缘物种之间校正基因组连锁图谱和比较作图
方面有很高的利用价值[27-29]; (3) 开发简单、快捷、
费用低, 利用公共数据库的 EST 序列可快速开发
EST-SSR。虽然如此, 从本研究结果看, EST-SSR同
时存在多态性低的缺点, 用于筛选的 352 对 EST-
SSR引物只有8对有多态性, 占2.3%, 远低于genomic-
SSR 的 20.3%。EST-SSR 多态性低的缺点也同样出
现在水稻、甘蔗、小麦等其他作物上[30-32]。SSR 位
点的多态性与该位点基序(motif)重复次数有关, 重
复次数越多, 多态性越高[32]。通常 EST-SSR基序的
重复次数比 genomic-SSR 的少, 因此相应的多态性
也低[33-35]。此外, 基因编码区内的二核苷酸重复基
序的增加或者删除容易导致致死性的移码突变, 长
期的自然选择压力抑制了编码区内的二核苷酸重复
400 作 物 学 报 第 35卷


表 3 公共标记在花生栽培种和野生种图谱上的分布
Table 3 Distribution of common markers on cultivars map
and wild species map
公共标记
Common
marker
野生种图谱连锁群
Linkage group in
wild species map
栽培种图谱连锁群
Linkage group in
cultivars map
PM32 Group2 Lg1
TC4F12 Group2 Lg2
TC7H11 Group2 Lg3
PM3 Group3 Lg5
PM36 Group5 Lg9
AH4-26 Group5 Lg11
AC2H11 Group6 Lg19
PM204 Group7 Lg7
TC4G10 Group7 Lg14
PM188 Group8 Lg4
TC9F10 Group8 Lg6

基序的变动可能也是 EST-SSR 多态性低的一个原
因。鉴于此, 今后在开发 EST-SSR 引物时应选择基
序重复次数高的 SSR-EST 序列, 同时避免二核苷酸
SSR落在编码区, 以提高 EST-SSR的多态性。
在许多植物遗传图谱构建中经常出现偏分离现
象, 其原因有生物学因素如染色体缺失及致死基因
的表达, 也有非生物学因素如读带错误或者样品错
误[36-39]。本研究中共有 13.89%的 SSR标记出现偏分
离, 明显小于之前的报道。Halward 等[20]和 Burow
等[19]分别构建的花生属 RFLP 遗传图谱标记的偏分
离比例均为 25%, Moretzsohn等[15]构建的花生属 AA
基因组遗传图谱标记的偏分离比例高达 51%。种间
杂交产生的偏分离比例往往比种内杂交高。这是由
于种间基因型差异大容易产生杂交不亲和, 从而导
致群体后代分离偏向某一亲本[40]。
早期的细胞学研究发现, 花生栽培种在减数分
裂时 88%~98%的细胞 20 对染色体以二价体形式配
对, 只有少数出现单价体、三价体和四价体, 表明 A
和 B基因组间同源配对能力差, 因此认为 A和 B基
因组间存在较大的差异[41-42]。但随后通过比较花生
栽野杂交四倍体和野生种二体遗传图谱上的连锁群
发现, 花生区组 A和 B基因组间具有很多相似之处,
其对应的连锁群上的多数公共标记排列顺序一
致[19]。鉴于花生区组 A 和 B 基因组的同源性以及
SSR 标记在栽野之间的高度可转移性, 今后可以通
过整合栽培种和野生种遗传图谱, 获得适用于栽培
种的遗传图谱。但由于本研究构建的图谱与野生种
图谱相同的标记太少, 目前尚未能将两个图谱进行
整合。
4 结论
构建了包含 20 个连锁群的花生栽培种分子遗传
图谱, 可作为花生重要性状的基因定位和 QTL分析
的框架。本研究所用的作图群体属稳定的重组自交
系群体, 通过该作图群体, 今后花生栽培种上新开
发的标记将可直接用于遗传图谱的加密。
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