全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(3): 397−404 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由河北省农林科学院科技发展计划项目资助(A09110301)资助。
第一作者联系方式: E-mail: zhym63@sohu.com
Received(收稿日期): 2010-08-09; Accepted(接受日期): 2010-12-06.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.00397
转 BADH基因苜蓿 T-DNA侧翼序列分析及转化事件特异性分析
张艳敏 1 张红梅 1 相金英 2 郭秀林 1 刘子会 1 李国良 1 陈受宜 3
1 河北省农林科学院遗传生理研究所 / 河北省植物转基因中心, 河北石家庄 050051; 2 河北省农林科学院谷子研究所, 河北石家庄
050031; 3 中国科学院遗传与发育生物学研究所, 北京 100101
摘 要: 为了从分子水平上鉴别不同的转基因株系, 以转 BADH基因苜蓿的 T0代基因组DNA为模板, 采用热不对称
交错 PCR(TAIL-PCR)方法分离其外源基因插入位点的侧翼序列 , 获得了 B127 株系的左翼序列和右翼序列, 以及
B125、B138、B295和 B196株系的左翼序列。侧翼序列特征分析表明, 有的 T-DNA边界序列被删除, 有的边界序列
被保留, 并填充了一段未知来源的核苷酸序列。根据侧翼序列中插入载体序列和紧邻插入序列的基因组序列特征, 分
别设计 PCR扩增的上、下游引物, 并对获得的 42个转 BADH株系分别进行左、右翼序列的扩增, 结果表明, 转基因
植株 B106、B125、B138、B157、B158、B289、B295、B305 和 B127 具有相同的扩增条带, B203、B220、B223 和
B196具有相同的扩增条带, 说明这些株系可能仅来源于 2个转化事件。本研究建立的事件特异性检测方法可以准确
地将不同的转化株系区别开来。
关键词: 转基因苜蓿; BADH; T-DNA; 侧翼序列; 事件特异性检测
Analysis of T-DNA Flanking Sequences and Event Specific Detection of Trans-
genic Alfalfa with Gene BADH
ZHANG Yan-Min1, ZHANG Hong-Mei1, XIANG Jin-Ying2, GUO Xiu-Lin1, LIU Zi-Hui1, LI Guo-Liang1,
and CHEN Shou-Yi3
1 Institute of Genetics and Physiology, Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences / Plant Genetic Engineering Center of Hebei Province,
Shijiazhuang 050051, China; 2 Institute of Millet Research, Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Shijiazhuang 050031, China;
3 Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China
Abstract: The gene encoding betaine aldehyde dehydrogenase (BADH), an important osmoregulation gene, has been transformed
into many crops, including wheat (Triticum aestivum L.), rice (Oryza sativa L.), maize (Zea mays L.), rape (Brassica campestris
L.), and potato (Solanum tuberosum L.). Transgenic crops carring BADH gene enhances tolerance to salinity and drought stresses.
Gene badh had been integrated into the most important forage crop alfalfa (Medicago sativa L.) in our previous work, and 42
transgenic plants with improved salt tolerance were obtained. Since they were derived from the same transformant vector, these
plants were not able to be distinguished from each other by commonly used methods, such as screening detection, gene specific
detection, and vector specific detection. To differentiate these transformants in molecular level, we performed the thermal asym-
metric interlaced PCR (Tail-PCR) to separate the T-DNA flanking sequences for identification of the transgenic plants in event
specific detection. A total of six sequences flanking either the left or the right borders of the T-DNA were obtained, which in-
cluded the flanking sequences at both left and right borders of plant B127, and the left border flanking sequences of plants B125,
B138, B295, and B196. The left border sequence of T-DNA was completely deleted from the vector and was thus not integrated
into the genome of alfalfa in the transgenic plant B196. Although the left border flanking sequence in the transgenic plant B127
was not changed, it was filled with a DNA sequence of unknown origin. The forward and backward primers for PCR were de-
signed based on the characteristics of the flanking sequences originating from the vector sequence and the alfalfa genomic se-
quence adjacent to the integrated vector sequence, respectively. The results of amplification in 42 BADH-transgenic alfalfa plants
showed that plants B106, B125, B127, B138, B157, B158, B289, B295, and B305 presented the same amplification banding pat-
terns. Plants B196, B203, B220, and B223 produced the same banding pattern which was different from that in other plants. These
results indicated that the plants with identical amplification banding pattern may come from the same transformation event. Based
398 作 物 学 报 第 37卷

on the findings in the present study, we successfully used the flanking sequences separated by TAIL-PCR analysis in developing
event specific detection method, which can be used not only to differentiate the origins of various transformants, but also to dis-
tinguish the transformants from each other. It is useful in protection of transgenic crops and labeling of transgenic products.
Keywords: Transgenic alfalfa; BADH; T-DNA; Flanking sequence; Event specific detection
甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因是重要的渗透胁
迫抗性基因, 在植物的抗逆性分子育种方面具有重
要作用 , 近年来很多学者利用基因工程手段 , 把
BADH 基因转入作物中使其表达, 以达到增强作物
抗旱、抗盐能力的目的。把 BADH 基因转入小麦、
水稻、油菜、马铃薯、玉米等作物之后, 耐旱性和
耐盐性都得到不同程度的提高[1-4]。笔者利用农杆菌
介导法将 BADH 基因导入苜蓿品种三得利中, 获得
了一批耐盐性明显提高的转化株系, 但不同株系间
的抗盐性存在一定差异。这些株系来源于同一个转
化载体 , 带有相同的目的基因和调控元件 , 如
BADH、CaMV35S 启动子、Nos 终止子、Npt II 标
记等。因此, 采用目前常用的转基因检测技术, 如筛
选检测、基因特异性检测和载体特异性检测方法都
无法把这些转化株系区别开来。由于外源基因插入
植物基因组的行为具有随机性, 因此每一个转化事
件的外源基因与植物基因组 DNA 整合位点处的核
苷酸序列均存在差异。即使用相同的载体进行多次
转化 , 整合的位置及整合位点的特征也难以重复 ,
借此可以区分不同的转基因事件。因此, 分离外源
基因插入的侧翼序列可作为从分子水平上鉴别转基
因株系的突破口。
根据转基因作物的侧翼序列设计引物, 扩增包
括部分 T-DNA 序列和部分受体基因组序列的融合
序列, 即事件特异性检测, 可以准确地识别不同的
转基因作物品种, 成为目前转基因检测研究的重要
方法 , 已经被用于许多转基因作物的检测中 , 如
Roundup Ready大豆[5-7], MON810、MON863和 Bt11
玉米[8-10], 以及 GT73油菜[11]。
侧翼序列的获得多采用以 PCR技术为基础的染
色体步移法, 依据原理可分为反向 PCR 法、连接
PCR 法、以及特殊引物的 PCR 法 [12], 其中 , Liu
等[13-14]发明的热不对称交错 PCR (Tail-PCR, thermal
asymmetric interlaced PCR), 因其简便、高效、高特
异性、高灵敏度等特点在分子生物学研究的各领域
得到广泛应用[15-18]。
本研究以转 BADH基因苜蓿(Medicago sativa L.)
为材料 , 通过 Tail-PCR 扩增获得转基因苜蓿的
T-DNA 侧翼序列, 并根据侧翼序列特征, 设计 PCR
引物, 建立转化事件特异性的 PCR 检测方法, 在分
子水平上鉴别不同的转 BADH基因苜蓿株系。
1 材料与方法
1.1 实验材料
42个转 BADH基因苜蓿株系的 T0代植株, 是本
实验室以苜蓿品种三得利为受体, 用携带 pBIN438-
BADH 质粒的农杆菌株 EHA105 转化子叶获得的。
用 CTAB 法提取苜蓿叶片基因组总 DNA 用于 PCR
扩增。
1.2 T-DNA侧翼序列的 Tail-PCR扩增
依据 Liu 等[13-14]发明的 Tail-PCR 技术原理, 根
据植物表达载体 pBIN438-BADH 的 T-DNA 边界附
近的核酸序列特征, 设计嵌套的高退火温度的特异
性 PCR引物, 左边界特异引物为 L1: 5′-TCCCTTCC
TTTCTCGCCACG-3′, L2: 5′-CGGAACCACCATCAA
ACAGG-3′, L3: 5′-GCTGTTGCCCGTCTCACTGG-
3′。右边界特异引物序列为 R1: 5′-GCAGATTATT
TGGATTGAGA-3′, R2: 5′-TGATAGTGACCTTAGGC
GAC-3′, R3: 5′-GTCATCGGCGGGGGTCATAA-3′。
参照方进等[17]的报导设计任意兼并引物AD1~AD10。
引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成
(图 1)。
共进行 3 次 Tail-PCR 反应, 每次反应分别用
AD/L1(R1)、AD/L2(R2)和 AD/L3(R3)引物组合进行扩
增。反应体系中兼并引物与特异引物的摩尔浓度比
为 4~10∶1。第一次反应的模板为基因组 DNA, 后
两次反应均用稀释 1 000 倍的上一级反应产物做模
板。Tail-PCR 的循环体系参照 Liu 等[13]的报导, 略
有改动(表 1)。
1.3 扩增产物的回收、克隆与测序
用1.0%的琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物, 通过比
较各级反应产物的电泳分离图谱, 切下次级或三级反
应的特异性条带, 用通用 DNA 回收试剂盒(北京天根
生化试剂公司)纯化回收 , 并克隆到 pGEM-T Easy
Vector上, 挑选阳性克隆送上海生工进行测序。
1.4 侧翼序列特征分析与事件特异性 PCR检测
用 DNAMAN 软件比较侧翼序列与载体序列的
同源性, 分析判断转基因株系的 T-DNA侧翼序列特
第 3期 张艳敏等: 转 BADH基因苜蓿 T-DNA侧翼序列分析及转化事件特异性分析 399



图 1 各引物在转化载体上的相对位置示意图
Fig. 1 Map sketching for the relative position of specific primers and degenerate primer in the vector structure

表 1 分离苜蓿 T-DNA侧翼序列的 Tail-PCR循环参数
Table 1 Amplification parameters for Tail-PCR analysis
第一次反应 Primary reaction 第二次反应 Secondary reaction 第三次反应 Tertiary reaction 反应步骤
Protocol Temperature
(℃)
Time
(minute:second)
Temperature
(℃)
Time
(minute:second)
Temperature
(℃)
Time
(minute:second)
1 94 2:00 94 2:00 94 2:00
2 95 1:00 94 0:30 94 0:30
3 94 0:30 55 1:00 55 1:00
4 60 1:00 72 2:00 72 2:00
5 72 2:00 94 0:30 94 0:30
6 Go to step 3 5 times 55 1:00 55 1:00
7 94 0:30 72 2:00 72 2:00
8 25 3:00 94 0:30 94 0:30
9 72 2:00 44 1:00 44 1:00
10 94 0:30 72 2:00 72 2:00
11 60 1:00 Go to step 2 15 times Go to step 2 15 times
12 72 2:00 72 7:00 72 7:00
13 94 0:30
14 60 1:00
15 72 2:00
16 94 0:30
17 44 1:00
18 72 2:00
19 Go to step 10 15 times
20 72 10:00

征。根据侧翼序列中插入载体的序列特征设计 PCR
的上游引物, 根据紧邻插入序列的基因组序列特征,
设计 PCR下游引物, 建立事件特异性的 PCR检测方
法。PCR体系为 25 μL, 含 1× buffer, 200 μmol L−1
dNTP, 200 nmol L−1引物, 0.5 U Taq酶。循环体系为
96℃ 3 min, 96℃ 20 s, 57℃ 30 s, 72℃ 45 s, 35循环
后再 72℃延伸 7 min, 以 1.2%琼脂糖凝胶电泳分离
扩增产物。
2 结果与分析
2.1 侧翼序列的扩增与获得
电泳结果表明, 初级扩增产物特异性不高, 呈
比较弱的多条带型, 不需进行电泳分离(图 2), 二级
和三级扩增产物条带清晰, 特异性高, 适合进行电
泳分离(图 3)。转化株系的二级和三级扩增产物呈分
子量大小有别的特异带型, 借此可判断回收条带的
特异性。对二级或三级反应的特异性条带进行序列
分析, 获得 1个右边界侧翼序列(B127R株系)和 5个
左边界侧翼序列(B127L、B125L、B138L、B295L

图 2 转 BADH基因苜蓿 T-DNA右边界侧翼序列的扩增
Fig. 2 Amplification profile of sequences flanking the right
borders of T-DNA in transgenic alfalfa plants
1~3: B127株系; 4~6: B196株系; 7~9: 受体苜蓿三得利的一、二
和三级扩增产物; M: 100 bp DNA分子量标准。
1–3: the primary, secondary, and tertiary reactions of line B127;
4–6: the primary, secondary, and tertiary reactions of line B196;
7–9: the primary, secondary, and tertiary reactions of the recipient
line Sandeli, respectively; M: 100 bp DNA ladder.
400 作 物 学 报 第 37卷


图 3 转 BADH基因苜蓿 T-DNA左边界侧翼序列的扩增
Fig. 3 Amplification profile of sequence flanking the left bor-
der of T-DNA in transgenic alfalfa plants
1~2: B295株系; 3~4: B125株系; 5~6: B138株系; 7~8: B196株系; 9~10:
B127株系的二级和三级扩增产物; M: 100 bp DNA分子量标准。
1–2: the secondary and tertiary reactions of line B295; 3–4: the
secondary and tertiary reactions of line B125; 5–6: the secondary
and tertiary reactions of line B138; 7–8: the secondary and tertiary
reactions of line B196; 9–10: the secondary and tertiary reactions of
line B127, respectively; M: 100 bp DNA ladder.

和 B196L株系)。
2.2 侧翼序列特征分析
与载体序列比较, 获得的侧翼序列具有如下几
种情况: (1)左边界序列, 连同其前面的 14个碱基一
起完全缺失 , 如 B196L(图 4); (2)左边界序列保留,
但整个左边界序列被一段核苷酸序列所填充, 因此,
左边界序列被分割成两部分, 如 B138L(图 5); (3)右
边界序列完全缺失, 与右边界序列紧邻的 T-DNA区
载体序列完整地被精确保留下来 , 如 B127R(图 6);
(4)不同的株系具有几乎相同的 T-DNA 边界序列 ,
仅有个别碱基的差异, 如 B125L、B127L、B138L和
B295L(图 7)。因此 , 这几个株系来源于同一个转化
细胞的增殖再生。

图 4 转 BADH苜蓿 B196株系左边界侧翼序列与载体序列比较
Fig. 4 Comparison of the T-DNA left border flanking se-
quences between BADH transgenic alfalfa line B196 and the
vector sequence
图中黑色背景表示相比较序列的碱基相同, 灰色背景表示序列
碱基不一致, 方框内为 T-DNA左边界序列。
Identical nucleotides are shaded with black color. The nucleotides
shaded with grey color are different in the two sequences. The
conserved left border sequences of T-DNA are indicated by rectan-
gular box.

2.3 事件特异性检测
根据侧翼序列中来源于载体的插入序列特征 ,

图 5 转 BADH苜蓿 B138株系左边界侧翼序列与载体序列比较
Fig. 5 Comparison of T-DNA left border flanking sequences
between BADH transgenic alfalfa line B138 and vector sequence
图中黑色背景表示相比较序列的碱基相同, 灰色背景表示序列
碱基不一致, 方框内为 T-DNA 左边界序列。
Identical nucleotides are shaded with black color. The nucleotides
shaded with grey color are different in the two sequences. The
conserved left border sequences of T-DNA are indicated by rectan-
gular box.

图 6 转 BADH苜蓿 B127株系右边界侧翼序列与载体序列比较
Fig. 6 Comparison of the T-DNA right border flanking se-
quences between BADH transgenic alfalfa line B127 and vector
sequence
图中黑色背景表示相比较序列的碱基相同, 灰色背景表示序列
碱基不一致, 方框内为 T-DNA 右边界序列。
Identical nucleotides are shaded with black color. The nucleotides
shaded with grey color are different in the two sequences. The
conserved left border sequences of T-DNA are indicated by rectan-
gular box.

设计事件特异性 PCR检测的上游引物, 根据紧邻插
入序列的苜蓿基因组序列特征设计事件特异性检测
的下游引物(表 2)。
为了验证所设计引物的应用效果, 以 B127 和
B196 株系的基因组 DNA 为模板, 用 BADHLF1 与
不同的下游引物组合进行左翼序列的 PCR扩增。当
BADHLF1与 B127LB1或 B127LB2引物组合时, 只
能在 B127株系扩增出特异性条带, 而同是转 BADH
的 B196株系不能扩增出条带。反之, BADHLF1与
B196LB1 或 B196LB2 引物组合时, 只能在 B196 株
系扩增出特异性条带(图 8)。
分别用 BADHLF1+B127LB1 和 BADHRF1+
B127RB 引物组合对 42 个转 BADH 株系分别进行
第 3期 张艳敏等: 转 BADH基因苜蓿 T-DNA侧翼序列分析及转化事件特异性分析 401



图 7 转 BADH苜蓿 B127、B125、B295和 B138株系左边界侧翼序列比较
Fig. 7 Comparison of T-DNA left border flanking sequences among BADH transgenic alfalfa lines B127, B125, B295, and B138
图中黑色背景表示相比较序列的碱基相同, 灰色背景表示序列碱基不一致。
Identical nucleotides are shaded with black color. The nucleotides shaded with grey color are different in the two sequences.

左、右翼序列的扩增。结果表明, B106、B125、B138、
B157、B158、B289、B295、B305 和 B127 具有相
同的扩增条带(图 9)。用 BADHLF1+B196LB2 引物
组合进行扩增, 发现 B203、B220、B223和 B196具
有相同的扩增条带(图 10), 说明这些株系可能仅来
源于 2个转化细胞。
3 讨论
本研究表明, 建立的事件特异性检测方法可以
准确地将不同的转化株系区别开来。原初获得的 42
个转 BADH基因苜蓿株系, 在用事件特异性 PCR方
法检测时, 若干株系扩增出相同的条带。具有相同

402 作 物 学 报 第 37卷

表 2 转 BADH基因苜蓿事件特异性检测的 PCR引物
Table 2 Primers designed for event specific detection of BADH transgenic alfalfa
引物
Primer
引物序列
Primer sequence (5′−3′)
备注
Note
BADHLF1 CGGAACCACCATCAAACAGG PBIN438-BADH 载体来源转化植株左翼序列扩增的上游引物
Forward primer for amplifying the T-DNA left border flanking sequence in the
transgenic alfalfa transformed with PBIN438-BADH vector
BADHLF2 GCTGTTGCCCGTCTCACTG PBIN438-BADH 载体来源转化植株左翼序列扩增的上游引物
Forward primer for amplifying the T-DNA left border flanking sequence in the
transgenic alfalfa transformed with PBIN438-BADH vector
BADHRF1 TGATAGTGACCTTAGGCGAC PBIN438-BADH 载体来源转化植株右翼序列扩增的上游引物
Forward primer for amplifying the T-DNA right border flanking sequence in the
transgenic alfalfa transformed with PBIN438-BADH vector
BADHRF2 GTCATCGGCGGGGGTCATAA PBIN438-BADH 载体来源转化植株右翼序列扩增的上游引物
Forward primer for amplifying the T-DNA right border flanking sequence in the
transgenic alfalfa transformed with PBIN438-BADH vector
B127LB1 ACACCAATCAGGGTCTATCT 转 BADH基因株系 B127左翼序列扩增的下游引物
Backward primer for amplifying the T-DNA left border flanking sequence in the
transgenic alfalfa plant B127
B127LB2 TAGGTCGTCTAGTTCTCATCTT 转 BADH基因株系 B127左翼序列扩增的下游引物
Backward primer for amplifying the T-DNA left border flanking sequence in the
transgenic alfalfa plant B127
B127RB GGAACCACCATCAAACAGGA 转 BADH基因株系 B127右翼序列扩增的下游引物
Backward primer for amplifying the T-DNA right border flanking sequence in
transgenic alfalfa plant B127
B196LB1 ATTATCCAGTAGCCAAAGGT 转 BADH基因株系 B196左翼序列扩增的下游引物
Backward primer for amplifying the T-DNA left border flanking sequence in the
transgenic alfalfa plant B196
B196LB2 GTCCCAATGTCAAACTTCATCACT 转 BADH基因株系 B196左翼序列扩增的下游引物
Backward primer for amplifying the T-DNA left border flanking sequence in the
transgenic alfalfa plant B196


图 8 转化事件特异的左翼序列扩增
Fig. 8 Event specific amplification of sequence flanking the
left border of T-DNA in transgenic alfalfa lines
1: B127/BADHLF1+B127LB1; 2: B196/BADHLF1+B127LB1,
3: B127/BADHLF1+B127LB2; 4: B196/BADHLF1+B127LB2;
5: B196/BADHLF1+B196LB1; 6: B127/BADHLF1+B196LB1;
7: B196/BADHLF1+B196LB2; 8: B127/BADHLF1+B196LB2;
M: 100 bp DNA ladder.

扩增条带的株系可能来源于同一个转化事件, 原因
在于转化体筛选过程中转化细胞经过了由少聚多的
扩繁, 并分化成多个小植株; 另一个可能的原因是
外源基因具有一定的插入热点, 使得这些非同一转
化体来源的株系具有相同的侧翼序列, 但这需要更
多的实验数据来支持。事件特异性检测方法已被成
功应用于许多转基因作物的检测中, 如大豆[5-7]、玉
米[8-10]和油菜[11]等。
另外, 本研究中没有发现载体骨架序列的整合
问题, 理论上, 也只有 T-DNA 区域内的核酸序列才
有可能被整合进植物基因组, 但是越来越多的研究
表明, 边界外的载体骨架序列也有可能被整合入宿
主基因组[19], 而且载体骨架序列的整合频率还相当
高。Kononov等[20]发现, 75%的转基因烟草中有载体
骨架序列整合, 常常有整个载体骨架序列全部整合
的情况发生。Maria 等 [21]有针对性地构建了 2个双
元表达载体, 载体的 T-DNA区均构建有 NOS-NPT II,

图 9 与 B127株系同源的左翼序列(左)和右翼序列(右)扩增
Fig. 9 Amplification of the sequences flanking the left borders (left panel) and the right border (right panel) of T-DNA in the trans-
genic alfalfa lines with the primers specifically designed for line B127
1~10: B127、B106、B125、B138、B157、B158、B289、B295、B305和受体品种三得利; M: 100 bp DNA分子量标准。
1–10: B127, B106, B125, B138, B157, B158, B289, B295, B305, and the recipient variety Sandeli, respectively; M: 100 bp DNA ladder.
第 3期 张艳敏等: 转 BADH基因苜蓿 T-DNA侧翼序列分析及转化事件特异性分析 403



图 10 与 B196株系同源的左翼序列扩增
Fig. 10 Amplification of sequence flanking the left border of
T-DNA in transgenic alfalfa lines with the primers specifically
designed for line B196
1~6: B196、B203、B220、B223、B253、B279和受体三得利;
M: 100 bp DNA分子量标准。
1–6: B196, B203, B220, B253, B279 and the receiver line Sandeli,
respectively; M: 100 bp DNA ladder.

在紧邻 T-DNA 的边界外构建有 mas2’-gusA, 载体
pBSG-1的 mas2’-gusA紧邻左边界, 载体 pBSG-2的
mas2’-gusA 紧邻右边界。用携带这种载体的农杆菌
转化烟草, 结果具有卡那霉素抗性的转基因烟草中,
约有 75%的植株可以通过 PCR 检测到 gusA 基因。
T-DNA 区外 gusA 在植物基因组的整合与其是否处
在 T-DNA 边界的左边或右边关系不大。进一步的
Southern 杂交分析表明, 载体骨架序列可以通过与
T-DNA 的左边界或右边界相连 , 也可以不依赖
T-DNA 而独立地整合进植物基因组。由于 T-DNA
整合机制的复杂性, 只有获得大量的测序信息才可
对其整合特性进行比较准确的分析。
Forsbach 等[22]发现, T-DNA 在插入时, 绝大多数
插入位点处的染色体 DNA都有缺失, 21%的插入位点
处的染色体 DNA 发生了大范围的重排和缺失, 其中
有 2个插入位点处的染色体 DNA发生了置换。另外,
在插入位点处往往还会有冗余 DNA 的插入[23]。在本
研究中, B138株系的左边界保守序列被一段未知的核
苷酸序列所分割填充, 该填充序列与载体序列没有同
源性。由于没有可利用的紫花苜蓿基因组测序资料,
用与紫花苜蓿具有高度同源性的二倍体蒺藜苜蓿(M.
truncatula)的基因组序列信息进行 Blast 分析, 结果该
填充序列与蒺藜苜蓿也没有同源片段。依据该株系左
翼序列和右翼序列中来源于苜蓿基因组的序列特征,
设计 PCR扩增的上游和下游引物, 对转化受体苜蓿三
得利基因组 DNA进行 PCR扩增, 对 PCR产物进行测
序得到外源基因整合前的基因组序列, 将其与外源基
因整合后的左、右翼序列进行比较, 获得外源基因插
入位点附近整合前后的核苷酸序列变化信息, 有可能
揭示该填充序列的来源。
4 结论
用 Tail-PCR方法分离获得了转 BADH基因苜蓿
B127 株系的左翼序列和右翼序列 , 以及 B125、
B138、B295和 B196株系的左翼序列。载体骨架序
列没有被整合, T-DNA 边界序列有的被删除, 有的
被保留且被一段未知来源的核苷酸序列所填充。据
侧翼序列特征设计了针对 B127和 B196株系的事件
特异性检测的 PCR引物, 并建立了检测方法。用该
方法可以准确地将不同的转化株系区别开来, 也可
追踪不同转化株系是否来自同一转化体。
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