全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(12): 21912195 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由现代农业产业技术体系建设专项(nycytx-23)资金资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 成浩, E-mail: chenghao@mail.tricaas.com
第一作者联系方式: E-mail: nestle78@163.com, Tel: 0571-86650575
Received(收稿日期): 2010-05-18; Accepted(接受日期): 2010-08-02.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.02191
利用 SSR分子标记分析茶树地方品种的遗传多样性
王丽鸳 1 姜燕华 1 段云裳 2 成 浩 1,* 周 健 1 曾建明 1 韦 康 1
1中国农业科学院茶叶研究所 / 国家茶树改良中心, 浙江杭州 310008; 2南京农业大学, 江苏南京 210095
摘 要: 正确评价茶树地方品种的遗传多样性是有效保护和利用茶树地方品种的前提条件。本研究从西湖龙井群体
种中选取 91个单株, 用 SSR分子标记分析其遗传多样性。采用计算机模拟方法, 探讨了抽样群体样本量、SSR引物
等位基因数影响茶树地方品种的主要遗传多样性参数值的变化规律。结果表明, 样本量对茶树地方品种的遗传多样
性参数值有不同程度的影响, 当样本量达到 15 个单株时, 各遗传参数值趋于稳定; SSR 引物等位基因数对茶树地方
品种各遗传多样性参数值的影响很大, 而且达到总体遗传多样性 90%所需的样本量也很不一样。当 SSR引物等位基
因数为 5时, 24个茶树单株才能达到茶树地方品种总体 90%以上的遗传变异。本研究为茶树地方品种遗传多样性的
评价和采用合理的保护策略提供了科学依据。
关键词: SSR标记; 茶树地方品种; 遗传多样性; 取样策略
Genetic Diversity of Tea Landraces Using SSR Markers
WANG Li-Yuan1, JIANG Yan-Hua1, DUAN Yun-Shang2, CHENG Hao1,*, ZHOU Jian1, ZENG Jian-Ming1,
and WEI Kang1
1 Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences / National Center for Tea Improvement, Hangzhou 310008, China; 2 Nanjing
Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: Appropriate assessment of genetic diversity in tea landraces is the prerequisite of conservation and utilization of these
valuable genetic resources. Ninety-one individual tea plants, from Longjing tea landrace population, were used in this study. Com-
puter simulation was utilized to study the changes of genetic diversity parameters influenced by the number of samples and alleles
per SSR locus. The results showed that the sampling number differentially affected the genetic diversity parameters. Only when the
sample number was higher than 15, the parameters tended to be stable. There were also large effects of the number of alleles per SSR
locus on the genetic diversity, which was closely associated with the sample number. It was found when the number of alleles per
SSR locus was five, at least 24 individual tea plants were needed for reaching to 90% of the total genetic diversity of tea landraces.
The results are useful for providing scientific basis for the assessment of genetic diversity and appropriate conservation strategies of
tea landraces.
Keywords: SSR; Tea landraces; Genetic diversity; Sampling strategy
茶树地方品种指在长期的自然或人为选择下所形成
的品种, 又称农家品种, 多为群体种, 对所处环境具有较
强的适应性 , 且适宜加工特种茶类 , 在茶叶生产上历来
起着重要作用[1]。作为一个物种的遗传基础, 这种自然状
态下存在的茶树有性群体, 是进一步进行品种改良的非
常珍贵的基因库, 如龙井 43[2]、龙井长叶[3]都是从龙井群
体种中通过系统选育获得的。无性系良种具有性状统一、
品质稳定等优点 , 正在逐步地得到推广 , 其面积与比例
越来越大。随着无性系良种的逐步发展和原有的群体种茶
园的不断衰老, 有性群体种的生存空间不断地受到挤压。
因此 , 在这种无性系良种替换有性群体的趋势中 , 应该
对这种宝贵的基因库资源采取必要的保护措施, 为茶树
育种提供丰富的物质基础。
精确地估计茶树群体种资源遗传多样性是保存基因
资源的先决条件。对于茶树群体种资源, 从遗传角度来看,
某遗传位点在一个群体中各个体间必定存在不同的等位
基因。在植物居群遗传多样性的研究中, 存在着遗传多样
性的准确衡量和比较方面的问题。例如, 用于估算居群遗
传多样性参数种类的确定, 样本大小是否代表居群的总
体遗传多样性水平等。在遗传多样性研究和比较中, 选择
2192 作 物 学 报 第 36卷

恰当的遗传多样性参数和有代表性的样本量, 使检测到
的遗传多样性及其估算的参数均具有较高的可比性, 对
物种和居群间遗传多样性的研究及其保护对策的确定均
至关重要[4-6]。如赵茹等[5]采用计算机模拟的方法对野生
大豆居群遗传多样性估算与取样策略的研究表明, 不同
分子标记检测到同一野生大豆居群的各种遗传差数值不
同; 同一居群中的不同样本量对遗传多样性参数的估算
值有较大的影响, 当选用多态位点百分率(P)时, 30~45个
植株才能代表总体 90%以上的遗传变异。
茶树是高度异交的物种, 许多研究表明茶树种群内
的变异高于种群间的变异[7-9], 在茶树遗传进化分析和分
子系统学的亲缘关系分析时, 特别是涉及到有性系种群
时, 不能用 1 个个体代表 1 个种。2001 年, 沈程文[8]用
RAPD 方法对茶树安化云台山种 27 个有性单株的遗传多
样性研究表明, 安化云台山种的种群内遗传多样性平均
达到 79.3%, 这说明茶树安化云台山种的种群内仍然存在
丰富的遗传多样性。2008年, Ohsako等[10]用 SSR分子标
记对日本京都的 8个茶树地方品种内及品种间的遗传变
异进行了分析, 结果表明在品种(系)中检测到的 SSR平均
等位基因数高于地方品种内检测到的位点数。而茶树地方
品种的遗传多样性取样策略尚未见报道。
微卫星 (microsatellite), 也称简单重复序列 (simple
sequence repeat, SSR), 是一类由 2~6 个核苷酸为重复单
元组成的简单重复序列。Powell 等[11]对 SSR 的优点做了
很好的综述, 如共显性、多态性相对丰富、基因组覆盖较
多等。由于该技术具有简便、快速、稳定性高和等位基因
多样性高等特点, 在基因组研究中作为一种主要的分子
标记技术, 已经广泛地应用于遗传图谱的构建、遗传多样
性分析和系统学研究[12-13]。
本研究以浙江省地方品种龙井种为研究材料, 从西
湖龙井种居群中选取 91个个体进行 SSR分子标记, 采用
计算机模拟方法对茶树地方品种的主要遗传多样性参数
随抽样群体样本量的变化规律进行系统研究, 为评价茶
树有性群体遗传多样性和采用合理的保护取样策略提供
科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
2009 年春, 分别从西湖龙井茶一级保护区内灵隐、
双峰、龙井村、杨梅岭、满觉陇 5 个不同地理位置的群
体种茶园中, 共采集 91 个龙井单株的一芽二叶新梢, 液
氮速冻处理后, 将其保存在–70℃冰箱中备用。
1.2 DNA的提取
采用改良的 CTAB法提取供试材料的基因组 DNA[14],
1%琼脂糖电泳检测 DNA 的质量, 用 NanoDrop ND-1000
分光光度计(Thermo Fisher Scientific, USA)测定 DNA的
浓度和纯度, 将其稀释到约 20~50 ng μL1, 4℃保存备用。
1.3 SSR引物的来源
48对 SSR引物用于供试材料的扩增, 其中实验室自
主开发的 EST-SSR 引物 47 对[15], 基因组 SSR 引物 1
对[16]。所有引物均由上海生工生物工程技术服务有限公
司合成。
1.4 PCR扩增和产物检测
PCR 在 Bio-Rad DNA Engine Dyad PCR 仪上进行,
参照刘振等 [17]的反应体系及反应程序。对扩增产物用
10%的聚丙烯酰胺凝胶在 MGV-210-33 型电泳仪(C.B.S.
Scientific Company, Inc., USA)上进行电泳, 电压 170 V,
时间 120 min, 参照 Wilkinson 的方法银染显色 [13]。用
Flurochem型凝胶成像仪(Alpha Innotech Corporation, San
Leandro, CA, USA)拍照记录。
1.5 数据处理
采用人工读带的方法, 将电泳图上可重复的、清晰的
条带记为“1”, 同一位置无带或不易分辨的弱带计为“0”
建立原始数据矩阵。分别从总样本 91 个个体中随机抽取
5、10、15、25、30、35、40、60个个体组成的抽样群体,
计算其遗传多样性参数。从总样本中随机抽取各个抽样群
体各 10次, 将得到的数据在 POPGENE 2.0软件中进行分
析, 计算不同抽样群体的各遗传多样性参数的平均值[5]。
将各抽样群体的上述遗传多样性参数的平均值与样本个
体数进行相关分析, 用 Microsoft Excel 统计软件对遗传
多样性参数值随抽样样本量的变化规律进行拟合分析。
2 结果与分析
2.1 样本量对茶树地方品种遗传多样性参数的影响
48对具有多态性位点的 SSR引物在 91份茶树品种
(系)中共扩增出 171 个等位基因, 285 个基因型, 每对引
物可检测到等位基因 2~5 个, 平均 3.56 个; 每对引物可
检测到基因型 2~12个, 平均 5.94 个。Shannon多样性指
数(I)为 0.8713, 观察杂合度为 0.4409。说明所选用的 48
对 SSR引物在茶树上具有较高水平的多态性。
从表 1 可以看出, 平均等位基因数(average number
of alleles, Na)、有效等位基因数(number of effective alleles,
Ne)、Shannon 多样性指数(I)随着抽样样本量的增加而增
加, 但是变化的幅度有所区别, 其中平均等位基因数 Na
的变幅为 20.28%, 而有效等位位点数 Ne、Shannon 多样
性指数 I 变幅都小于 10%。观测杂合度(observed hete-
rozygosity, Ho)、预期杂合度(expected heterozygosity, He)、
平均杂合度(average heterozygosity, H), 在抽样样本量小
于 15 时, 参数值变化较大, 表现出先增后减的趋势; 当
样本量大于 15 时, 参数值变化不大, 观测杂合度的变幅
最大为 60%, 其次是预期杂合度为 31%, 而平均杂合度变
幅小于 10%。Nei’s遗传距离(Nei’s genetic distance, Nei),
在抽样样本量小于 15 时, 也表现出先减后增的趋势, 但
是参数值变化不大。
用 Microsoft Excel对 SSR分子标记检测茶树地方品
第 12期 王丽鸳等: 利用 SSR分子标记分析茶树地方品种的遗传多样性 2193


种的平均等位基因数 Na、平均有效基因数 Ne、Shannon
多样性指数 I 值随抽样群体样品量变化进行拟合(图 1),
结果遗传多样性参数值与样本量呈对数增加的关系。平均
有效基因数 Ne 的拟合方程的相关系数平方值(R2)最低为
0.8577, 平均等位基因数 Na 拟合方程的相关系数平方值
(R2)最高为 0.9688。
2.2 不同等位基因数的 SSR 引物对茶树地方品种遗传
多样性的影响
表2列出了在抽样样品量为60时, 不同等位基因数SSR
引物检测的茶树群体的各遗传多样性参数值的变化情况。

表 1 在不同抽样样本量下茶树地方品种的遗传多样性
Table 1 Genetic diversity of tea landrace under different sample numbers
样本量
Sample number
平均等位
基因数
Na
有效等位
基因数
Ne
Shannon
多样性指数
I
观测杂合度
Ho
预期杂合度
He
遗传距离
Nei
平均
杂合度
H
5 2.8426 2.0717 0.7970 0.5120 0.5484 0.4932 0.4484
10 2.9292 2.0579 0.7976 0.4483 0.4922 0.4663 0.4663
15 3.1188 2.0880 0.8261 0.4457 0.4954 0.4783 0.4783
25 3.3250 2.1225 0.8492 0.4397 0.4959 0.4856 0.4856
30 3.3354 2.1232 0.8517 0.4380 0.4950 0.4864 0.4864
35 3.3688 2.1323 0.8569 0.4450 0.4979 0.4905 0.4905
40 3.4229 2.1540 0.8664 0.4458 0.5010 0.4945 0.4945
60 3.5104 2.1463 0.8661 0.4402 0.4967 0.4924 0.4924
91a 3.5625 2.1547 0.8713 0.4409 0.4977 0.4949 0.4669
a取样 1次的计算结果。a Result from one sampling.


图 1 茶树地方品种不同样本量抽样群体的遗传多样性参数值随抽样群体样品量变化的拟合曲线及拟合方程
Fig. 1 Fitting curve and equation for the parameters of the genetic diversity of tea landrace under different sample numbers

表 2 不同等位基因数 SSR引物下茶树地方品种的遗传多样性
Table 2 Genetic diversity of tea landrace under different alleles numbers per SSR locus
SSR引物等位基因数
Number of alleles per SSR locus
平均等位
基因数
Na
有效等位
基因数
Ne
Shannon多
样性指数
I
观测杂合度
Ho
预期杂合度
He
遗传距离
Nei
平均杂合度
H
2 2.0000 1.5298 0.4864 0.3282 0.3236 0.3208 0.3208
3 2.9750 1.8040 0.7170 0.4230 0.4305 0.4268 0.4268
4 3.9526 2.2966 0.9760 0.4481 0.5460 0.5413 0.5413
5 4.8286 3.0489 1.2342 0.5537 0.6626 0.6569 0.6569
抽样样本为 60 个 , 10 次的平均值。
Average of 10 samplings with 60 plants for one sampling.
2194 作 物 学 报 第 36卷

试验结果表明, 用不同等位位点数 SSR 引物所计算
的遗传多样性参数值的变化很大。用 SPSS 软件对 SSR
等位位点数和各遗传多样性参数值进行 Pearson 相关性
分析, 也表明 SSR引物检测的等位位点数与茶树遗传多
样性参数值呈极显著的正相关。
用 Microsoft Excel, 对用不同等位位点数 SSR引物
(2~5 个)所检测到的茶树抽样群体的平均等位基因数(Na
值)随抽样群体样本量的变化进行拟合(图 2), 显示遗传多
样性参数值与样本量呈对数增加的关系。当所有 SSR 引
物等位位点数增加时, 拟合方程的相关系数增加明显。当
SSR 的等位位点等于 2 时, 拟合方程的相关系数平方值
(R2)最低为 0.7713, 当 SSR的等位位点等于 5时, 拟合方
程的相关系数平方值(R2)最高为 0.9784。
2.3 遗传多样性参数和 SSR引物等位基因数对占总体遗
传多样性 90%所需样本量的影响
从表 1 可以看出, 用不同的遗传多样性参数作为指标,
达到总体遗传多样性 90%, 所需的样本量很不一样。用平均
等位基因数作为指标, 需要的样本量大于 20 个, 用平均有
效等位基因数 Ne、Shannon 多样性指数 I、观测杂合度 Ho
等遗传多样性参数作指标, 需要的样本量都小于 5个。
当用平均等位基因数作为遗传多样性指标, 并用不
同等位基因数的 SSR 引物进行遗传多样性检测时, 达到
总体遗传多样性 90%所需的样本量很不一样(表 3)。当用
等位基因数为 2的 SSR引物时, 达到总体遗传多样性 90%
需要的样本量小于 5, 而用等位基因数为 5的 SSR引物时,
需要的样本量为 24。达到总体遗传多样性 90%所需的样

图 2 在不同 SSR等位基因数下, 平均等位基因数 Na值随抽样群体样品量变化的拟合曲线及拟合方程
Fig. 2 Curve and equation fitting for the changes of Na with the sample number under the different allele number per SSR locus

表 3 达到总体遗传多样性 90%所需要的样本量
Table 3 Sample number needed for reaching to 90% of the total
genetic diversity
SSR等位基因数
Allele number per SSR locus
2 3 4 5
样品量 Sample number a <5 15 20 24
a以平均等位基因数 Na为茶树地方品种遗传多样性参数。
a The average allele number (Na) considered as the parameter for
the genetic diversity of tea landrace.

本量与 SSR引物的等位基因数呈明显的正相关。
3 讨论
3.1 样本量对茶树地方品种遗传多样性参数的影响
在遗传多样性研究和比较中, 选择恰当的遗传多样
性参数和有代表性的样本量, 使检测到的遗传多样性及
其估算的参数具较高可比性, 对物种和居群间遗传多样
性的研究及其保护对策的确定均至关重要。本研究表明,
群体抽样的样本量对茶树群体种的遗传多样性参数值有
不同程度的影响, 但对各遗传多样性参数影响并不一致。
平均等位基因数 Na、有效等位基因数 Ne、Shannon多样
性指数 I 随抽样样本量增加而增加, 为对数拟合方程; 而
观测杂合度、预期杂合度、平均杂合度, 在抽样样本量小
于 15 时, 参数值变化较大, 表现出先增后减的趋势; 当
样本量大于 15 时, 参数值变化不大。这说明利用不同的
遗传多样性参数来衡量茶树群体种的遗传多样性水平并
较好地反应总体的多样性水平, 需 15个以上的样本量。
3.2 不同等位基因数的 SSR 引物对茶树地方品种遗传
多样性的影响
本研究表明在进行茶树有性群体遗传多样性分析
时, 实验中所采用 SSR引物可以对群体的遗传多样性参
第 12期 王丽鸳等: 利用 SSR分子标记分析茶树地方品种的遗传多样性 2195


数产生较大的影响。用等位基因数多的 SSR引物对群体
进行多样性分析 , 获得的遗传多样性较高 ; 反之 , 获得
的遗传多样性就低。当对不同茶树群体或居群的遗传多
样性水平进行比较时, 应对其检测手段和估算方法有所
了解, 只有在方法和手段相同或相似的前提下进行遗传
多样性的比较才具有科学意义。鉴于 SSR 引物对遗传多
样性参数值影响巨大, 进行茶树资源 SSR 遗传多样性评
价时, 有必要对所用 SSR引物进行统一。
3.3 遗传多样性参数和 SSR引物等位基因数对占总体遗
传多样性 90%所需样本量的影响
样本的大小会影响茶树群体或居群遗传多样性的代
表性, 这对于茶树地方品种遗传多样性的研究和保护都
具有重要的意义。本研究表明达到总体遗传多样性 90%
所需的样本量与 SSR引物的等位基因数呈明显的正相关。
而且用不同的遗传多样性参数作为指标, 达到总体遗传
多样性 90%所需的样本量也很不一样。当用平均等位基
因数 Na作参数, SSR引物等位位点数为 5时, 24个以上单
株才能达到总体 90%以上的遗传变异。这要小于遗传多
样性取样策略研究中提供的所需保护的样本量[4-6]。这可
能与茶树的高度杂合程度有关 , 因为杂合程度越高 , 等
位基因在个体间的分布越均匀, 较少的个体就能代表整
个居群的遗传变异。
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