全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(10): 1856−1863 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由山东省花生良种产业化工程项目, 山东省现代农业产业技术体系花生创新团队建设项目, 国家现代农业产业技术体系建设
专项资金项目(CARS-14)和国家“十二五”科技支撑计划项目(2011BAD35B04)资助。
∗ 通讯作者(Corresponding authors): 万勇善, E-mail: yswan@sdau.edu.cn, Tel: 0538-8241540; 刘风珍, E-mail: liufz@sdau.edu.cn, Tel:
0538-8241540
第一作者联系方式: E-mail: lishuanzhu913@126.com
Received(收稿日期): 2012-02-15; Accepted(接受日期): 2012-06-10; Published online(网络出版日期): 2012-07-27.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20120727.0845.014.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.01856
花生 γ-生育酚甲基转移酶基因(γ-TMT)的克隆及序列分析
李拴柱 万勇善* 刘风珍*
山东农业大学 / 作物生物学国家重点实验室 / 山东省作物生物学重点实验室, 山东泰安 271018
摘 要: γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)催化 γ-生育酚转变为生物活性最高的 α-生育酚, 是决定植物中维生素 E成分和
活性的关键酶。本研究采用电子克隆与 PCR相结合的方法获得了花生６个栽培品种(A. hypogaea L.)和花生区组 4个
二倍体野生种中 γ-TMT的全长 DNA序列, 定名为 AhgTMT; 从栽培品种丰花 2号中获得 γ-TMT的 cDNA序列, 定名
为 AhrTMT。同一栽培品种的 AhgTMT与 AhrTMT的序列完全对应, 说明该基因无内含子。AhrTMT编码区长 1 059 bp,
编码 352个氨基酸残基的 AhTMT蛋白。AhTMT分子量为 39.09 kD, 等电点 6.72, 总平均亲水性–0.12; 预测的二级
结构中 α-螺旋占 55.40%, β-折叠占 10.51%, 无规则卷曲占 34.09%; 被定位于叶绿体, 含有甲基转移酶保守的 SAM结
构域。AhTMT与已报道植物 γ-TMT氨基酸序列的相似性为 61.75%~72.80%。栽培品种的 AhgTMT与 A. ipaensis (BB)、
A. batizocoi (BB)、A. duranensis (AA)、A. kuhlmannii (AA)4个野生种的核苷酸序列同源性分别是 100%、99.91%、
99.74%和 95.63%。
关键词: 花生; 维生素 E; γ-生育酚甲基转移酶; 基因克隆; 序列分析
Cloning and Bioinformatic Analysis of γ-Tocopherol Methyltransferase Gene
(γ-TMT) in Peanut
LI Shuan-Zhu, WAN Yong-Shan*, and LIU Feng-Zhen*
State Key Laboratory of Crop Biology / Shandong Key Laboratory of Crop Biology / Shandong Agricultural University, Tai’an 271018, China
Abstract: γ-tocopherol methyltransferase(γ-TMT) is one of the critical enzymes that determine the composition and activity of
vitamin E in plant. γ-TMT catalyzes the biological reaction from γ-tocopherol to α-tocopherol, is the most bioactive component of
vitamin E. In this study, DNA sequence of γ-TMT in peanut (designated as AhgTMT ) was cloned by using in silico cloning com-
bined with PCR from six cultivars and four diploid wild species that belong to Arachis section. cDNA sequence of γ-TMT (desig-
nated as AhrTMT) was cloned from Fenghua 2. Nucleotide sequences of AhgTMT are identical with AhrTMT, which means no
intron in this gene. AhrTMT has a 1 059 bp open reading frame encoding a protein (AhTMT) of 352 amino acid residues with a
molecular weight of 39.094 kD. The isoelectric points of AhTMT is 6.72 and its grand average of hydropathy is –0.12. Secondary
structure prediction of AhTMT indicated that 55.40% of the protein sequence is alpha helixes, 10.51% beta turn and 34.09% ran-
dom coil. AhTMT has a conserved SAM domain and is localized in chloroplasts. The similarity between AhTMT and γ-TMTs
reported in other species is from 61.75% to 72.80%. Alignment analysis of AhgTMT nucleotide sequences indicated that the ho-
mology of AhgTMT from cultivars and those from A. ipaensis (BB), A. batizocoi (BB), A. duranensis (AA) and A. kuhlmannii
(AA) was 100%, 99.91%, 99.74%, and 95.63%, respectively.
Keywords: Peanut (Arachis hypogaea L.); Vitamin E; γ-tocopherol methyltransferase; Gene cloning; Sequence analysis
天然维生素E是由光合生物合成的各种生育酚
的总称, 是一种脂溶性的天然抗氧化成分, 根据侧
链基团是否饱和分为生育酚(tocopherol)和三烯生育
酚(tocotrienol)两类, 每类又根据苯环上甲基位置和
数目的不同各分为α、β、γ和δ形式, 4种维生素E的生
物活性依次降低。在植物体内, 维生素E不仅能够提
第 10期 李拴柱等: 花生 γ-生育酚甲基转移酶基因(γ-TMT)的克隆及序列分析 1857


高植物对高温[1]、干旱[2]、盐碱[3-4]、重金属[4]等非
生物胁迫的抵抗力, 在细胞信号转导 [5]以及碳水化
合物的代谢[6]等方面也发挥着重要的作用。维生素E
是人和动物的必需营养, 能够增强人体免疫力、延
缓衰老、降低心血管疾病和癌症的发病率。天然维
生素E主要存在于植物油中 , 尤其富含于谷物种子
的胚芽油及大豆油等油脂中。世界四大食用植物油
中除葵花籽油维生素E以α-生育酚为主外, 大豆、花
生和菜籽油中维生素E均以活性低的γ-生育酚为
主[7], 降低了维生素E的吸收利用率, 影响了其保健
功能。
维生素E在生物合成时首先在不同酶的催化下
生成γ、δ两种类型 , 然后在γ-生育酚甲基转移酶
(γ-TMT)的催化下分别生成α、β型[8-9]。γ-TMT是决
定植物中生育酚成分和活性的关键酶, 其基因已经
在多种植物中被克隆得到, 并进行了一系列功能验
证和转基因研究。Yusuf等 [10]用CaMV35S启动子驱
动γ-TMT过量表达使芥菜型油菜中α-生育酚含量提
高6倍。Li等[11]研究表明, 当拟南芥的γ-TMT过量表
达时, 可使叶片维生素E中α-生育酚比例从87.5%增
加到97.1%。花生是我国主要油料作物之一, 花生油
中虽然含有丰富维生素E (24.64~65.04 mg 100 g–1),
但主要以活性低的γ-生育酚为主(51%), 影响了人体
的吸收利用。因此, 克隆和分离花生的γ-TMT对花生
维生素E品质性状的改良具有十分重要的意义。
花生栽培种是异源四倍体植物 , 起源于2个二
倍体野生种, 分为普通型、龙生型、多粒型、珍珠
豆型和中间型。栽培花生野生种亲本的确定, 一直
是许多学者关注的焦点。多年来他们从不同角度 ,
采用不同的技术和方法进行了研究, 但结果不一。
近些年来, 随着技术的快速发展、方法的不断改进
和研究的日益深入, 多数学者认为A. duranensis和A.
ipaensis是栽培花生的二倍体野生亲本[12]。
本研究采用电子克隆与RT-PCR相结合的方法
克隆花生γ-TMT的cDNA序列, 分析其序列特征, 为
进一步利用该基因改良花生营养品质奠定基础。同
时, 通过6个不同类型花生栽培品种和花生区组4个
二倍体野生种中γ-TMT DNA序列比对及同源分析,
探讨花生栽培种中γ-TMT的分子起源。
1 材料与方法
1.1 试验材料
花生栽培品种丰花2号(珍珠豆型)、山花7号(中
间型)、兰娜1号(普通型)、荔浦大花生(龙生型)、
ICGV86699 (普通型)和ICG6848 (多粒型)由山东农
业大学花生研究所提供。含AA染色体组的二倍体野
生种A. duranensis、A. kuhlmannii和含BB染色体组的
二倍体野生种A. ipaensis、A. batizocoi由中国农业科
学院油料作物研究所提供。
TIANgel胶回收试剂盒购自天根生化科技有限
公司; pEASY-T1 Vector, 大肠杆菌菌株DH5α、Trizol
Reagent Kit、EasyScript First-Strand cDNA Synthesis
Kit购自北京全式金生物技术有限公司。引物由生工
生物工程(上海)股份有限公司合成。
1.2 花生 γ-TMT的电子克隆
以大豆 γ-TMT 的 cDNA 序列为探针, 在 NCBI
数据库中Blast搜索花生属与其同源的EST序列, 利
用DNAman软件拼接重叠片段, 形成延长的新序列,
以新序列为探针继续 Blast搜索, 拼接新的重叠片段,
重复搜索和拼接, 直到新序列不能继续延伸, 得到
最终拼接结果。利用 DNAman软件比对拼接序列与
其他物种同源基因序列的相似性, 搜索其开放阅读
框并推测其编码的氨基酸序列。
1.3 花生 DNA 和 RNA 的提取及 cDNA 链的合
成
取花生栽培种及野生种未展开的嫩叶, 液氮速
冻研磨后用CTAB法提取DNA。丰花2号花生果针入
土约35 d, 取幼果, 液氮速冻, –80℃保存, 用于提取
总RNA, 提取方法参照Trizol Reagent Kit说明书。利
用NanoDrop2000进行含量测定和1%琼脂糖凝胶电
泳检测。利用EasyScript First-Strand cDNA Synthesis
Kit, 按其说明书将花生的RNA反转录为第一链互补
链DNA (cDNA)。
1.4 花生 γ-TMT的 PCR扩增
分别以丰花2号花生的cDNA、DNA以及４个野
生种的DNA为模板 , 按如下反应体系扩增 : 50 ng
μL–1 cDNA/DNA模板5 μL, 10 μmol L–1引物1 μL,
10×buffer II (含Mg2+) 5 μL, 2.5 mmol L–1 dNTPs 4 μL,
TransStart Taq 0.5 μL, ddH2O 33.5 μL, 总体积50 μL。
扩增程序为94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72℃
1.5 min, 35个循环; 72℃延伸10 min, 4℃保温。以1%
的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
1.5 花生 γ-TMT的克隆和测序
切胶回收目的条带 , 将产物连接到克隆载体
pEASY-T1上 , 然后转化大肠杆菌DH5α, 涂板过夜
培养, 挑取单菌落PCR鉴定后, 每个品种选6个阳性
1858 作 物 学 报 第 38卷

克隆送北京六合华大基因科技有限公司测序。
1.6 花生 γ-TMT序列分析
采用在线工具Protparam (http://www.expasy.ch/
tools/protparam.html)预测基因编码蛋白(AhTMT)的
理化性质 ; 利用在线工具SinalP 4.0 Server (http://
www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、TargetP 1.1 server
(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)、THMM server
2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TM-HMM/)分别
对AhTMT蛋白进行信号肽预测、亚细胞定位和跨膜
区域预测; 利用NCBI链接的CDD对AhTMT蛋白进
行保守结构域预测 ; 利用SWISS-MODEL的 inter-
proscan和Automated Mode进行蛋白质的二级结构分
析和结构域的三维建模 ; 用NCBI的Blast程序分析
序列的同源性, 用DNAMAN和ClustalW软件比对基
因序列及氨基酸序列并构建进化树。
2 结果与分析
2.1 花生 γ-TMT的电子克隆
花生中与大豆 γ-TMT同源的EST序列拼接后 ,
得到一条1 400 bp的序列。利用DNAMAN软件对拼
接结果进行开放阅读框搜索, 找到一个1 059 bp, 编
码352个氨基酸的完整阅读框。并且在5′端非翻译区
中有连续的同框终止密码子, 起始密码子AUG处符
合“A/GNNAUG”的Kozak规则 , 在3′非翻译区终止
密码子下游25 bp处有加尾信号AATAAA。该阅读框
与大豆γ-TMT的阅读框序列相似性为74.56%, 编码
的氨基酸序列相似性为72.8%, 可确定电子克隆结
果为花生的γ-TMT, 定名为AhTMT。根据AhTMT的电
子拼接结果设计PCR扩增引物F: 5′-TACAGGGGGC
ATGGCTTTATTGG-3′和 R: 5′-GCACGGCAGCTT
CTATGTCTTACT-3′。
2.2 AhTMT的克隆
以丰花 2 号 cDNA 为模板, 用 F/R 引物进行
PCR 扩增 , 用 1%琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物 ,
得到一条 1 000 bp左右的条带, 回收测序得到一条
1 167 bp的序列 , 经 DNAMAN软件分析 , 克隆得
到的序列同样具有 1 059 bp的开放阅读框, 编码具
有 352 个氨基酸残基的蛋白(AhTMT)(图 1), 与电
子克隆结果一致, 定名为 AhrTMT。以 6 个栽培种
和 4 个野生种的 DNA 为模板进行的扩增同样得到
1 000 bp左右的条带, 测序结果显示和 cDNA序列
一致, 说明该基因的 DNA 序列不存在内含子, 定
名为 AhgTMT。


图1 AhrTMT测序结果及编码的氨基酸序列
Fig. 1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of
AhrTMT
* 表示终止密码子。The termination codon is marked with *.

2.3 AhTMT的氨基酸序列分析
2.3.1 AhTMT的基本性质 AhTMT含352个氨
基酸, 预测其理论分子量为39.09 kD, pI=6.72, 为不
稳定蛋白和疏水性蛋白。
2.3.2 AhTMT的二级结构及结构域 在线预测
二级结构结果显示 , AhTMT蛋白中α-螺旋结构占
55.40%, β-折叠占10.51%, 无规则卷曲占34.09% (图
2)。
利用CDD和interproscan分析表明, AhTMT蛋白
含有2个保守的S-腺苷甲硫氨酸结合位点, 74~351位
是生育酚甲基转移酶的特征序列, 可能具有多个结
构域(图3)。AhTMT蛋白保守结构域的三维建模型见
图4。
第 10期 李拴柱等: 花生 γ-生育酚甲基转移酶基因(γ-TMT)的克隆及序列分析 1859



图2 SWISS-MODEL预测的AhTMT的二级结构
Fig. 2 Secondary structure prediction of AhTMT using SWISS-MODEL
H: α-helix; E: β-sheet; C: random coil.


图3 AhTMT蛋白保守结构域预测
Fig. 3 Prediction of conserved domain in AhTMT protein

图4 AhTMT蛋白的保守结构域三维模型
Fig. 4 Three-dimensional structure for the conserved domain of AhTMT

2.3.3 AhTMT的信号肽、跨膜区预测及亚细胞定位
预测AhTMT没有信号肽和跨膜区, 为非分泌蛋
白; 亚细胞定位分析结果显示该蛋白在N端有48个
氨基酸的导肽, 定位于叶绿体的可能性达92.2%。
2.4 氨基酸序列比对与系统进化分析
用DNAMAN软件将AhTMT的氨基酸序列与紫
苏、大豆、番茄、马铃薯、甘蓝、拟南芥、玉米、
小麦8个物种的γ-TMT氨基酸序列进行比对, γ-TMT
1860 作 物 学 报 第 38卷

在不同物种中的相似性较高, 除N端有一段保守性
较弱外, 功能结构区域均相对保守。花生与大豆相
似性最高 , 为72.8%, 与其他7种植物的相似性为
61.75%~67.49% (表1和图5)。对AhTMT氨基酸序列构
建的系统进化树表明, 同为豆科的花生与大豆为一
组亲缘关系最近; 十字花科的甘蓝型油菜和拟南芥
为一组; 茄科的番茄和马铃薯为一组; 单子叶的小
麦和玉米为一组(图6), 这与传统的植物学分类结果
一致。

表 1 AhTMT与其他物种 γ-TMT氨基酸序列的相似性
Table 1 Similarity of amino acid sequences of γ-TMT in
Arachis hypogasa and some other species
物种
Species
登录号
Accession
No.
相似性
Similarity
(%)
大豆 Glycine max AY960126 72.80
番茄 Lycopersicum esculentum DQ456876 67.49
拟南芥 Arabidopsis thaliana At1g6497 64.12
小麦 Triticum aestivum At1g64970 61.75
紫苏 Perilla frutescens AF213481 62.06
马铃薯 Solanum tuberosum DQ456877 64.50
甘蓝 Brassica oleracea AF381248 62.43
玉米 Zea mays DQ456879 62.08
2.5 花生栽培种与野生种中 AhgTMT 及其推测
的氨基酸序列比对
6 个栽培种的 AhgTMT 序列完全相同; 与栽培
种序列相比, 野生种A. kuhlmannii (AA)有 50个碱基
差异, A. duranensis (AA)有 3个碱基差异, A. batizo-
coi (BB)有 1个碱基的差异, A. ipaensis (BB)序列完
全相同(图 7)。由于 AhgTMT中不存在内含子, 利用
花生野生种的 AhgTMT序列推测 AhTMT编码的氨基
酸序列, 并与栽培种(丰花 2号)序列比对, 发现栽培
种 AhTMT 氨基酸序列与两个 B 基因组野生种完全
相同, 而与 A基因组的 A. duranensis和 A. kuhlmannii
分别有 3 个和 11 个氨基酸的差异(图 8), 说明花生栽
培种与 A. ipaensis亲缘关系最近, 与 A. batizocoi和 A.
duranensis比较近, 与 A. kuhlmannii最远。
3 讨论
花生油是我国的主要食用油之一。花生中维生
素 E尤其是 α-生育酚含量的提高不仅能够提高花生
的营养品质 , 还有利于增强花生抗逆境胁迫的能
力。γ-TMT 催化 γ-生育酚转变为 α-生育酚, 是提高
组织中 α-生育酚含量的关键酶。利用 γ-TMT提高 α-

图 5 不同物种中 γ-TMT氨基酸序列比对分析
Fig. 5 Alignments of γ-TMT sequences from different species
第 10期 李拴柱等: 花生 γ-生育酚甲基转移酶基因(γ-TMT)的克隆及序列分析 1861



图 6 不同物种中 γ-TMT序列的系统进化树
Fig. 6 Phylogenetic tree of different species based on γ-TMT sequences
生育酚含量、增强植物抗逆性已经在多种植物中进
行过研究 , 并取得一些成果。Tawa 等[13]将蓝藻的
γ-TMT 导入大豆, 转基因植株中 α-和 β-生育酚含量
分别是对照的 10.4倍和 14.9倍。Kumar等[14]发现利
用转基因使土党参中 γ-TMT 过量表达, 不仅能明显
增强抗氧化代谢能力, 还使光合速率提高了 48%。
本实验采用电子克隆与 RT-PCR 相结合的方法, 成
功克隆了花生的 AhrTMT 基因, 并分析该基因序列
及其蛋白质序列。克隆得到的 AhrTMT 与同为豆科
的大豆 γ-TMT 氨基酸同源性最高, 为 72.8%, 与其
他物种 γ-TMT的相似性也在 60%以上; AhTMT氨基

图 7 栽培种和野生种中 AhTMT DNA序列比对
Fig. 7 Alignments of AhTMT DNA sequences between A. hypogaea and wild species
1862 作 物 学 报 第 38卷


图 8 栽培种和野生种 AhTMT氨基酸序列比对
Fig. 8 Alignments of AhTMT sequences between A. hypogaea and wild species

酸序列N端有 48个氨基酸组成的叶绿体导肽, 同时
还含有 2 个保守的 S-SAM 结合结构域基序(“XXD
XGCGIG”和 “VXXPGGXXIX”), 这与已知的其他
γ-TMT 的结构特点一致 , 确定 AhrTMT 是花生的
γ-TMT 基因。为进一步利用该基因研究花生中维生
素 E 代谢、提高花生中 α-生育酚含量, 改善花生营
养品质、促进花生抗逆稳产奠定了基础。
花生栽培种的遗传学起源问题一直是许多学者
讨论的热点, 然而至今尚无确切定论。近些年来, 一
些学者通过种间杂交[15]、分子标记[16-18]以及基因序
列比对[19]、蛋白电泳[20]等多种技术对花生栽培种及
近缘野生种的亲缘关系进行了广泛研究, 比较一致
的观点是A. duranensis和A. ipaensis分别是花生栽培
种A和B染色体组的供体。本研究中A. ipaensis的
AhgTMT序列与A. hypogaea完全相同 , 从分子水平
上支持了A. ipaensis是花生栽培种B染色体组供体的
观点。另外, 从AhgTMT推测的氨基酸序列比对发现,
花生栽培种的AhTMT序列与B基因组的2个野生种
完全相同, 而与A基因组的两个野生种同源性分别
是95.63%和99.74%, 推测本实验所克隆得到的栽培
种AhgTMT可能来自B基因组。6个栽培品种所检测
的36个克隆中, 未测出与A染色体组完全同源的序
列, 推测A基因组的AhgTMT发生突变或丢失。以上
推测还需要进一步的实验验证。
4 结论
得到花生栽培种中 γ-TMT 基因的 cDNA 序列,
并构建了与紫苏、大豆、番茄、马铃薯、甘蓝、拟
南芥、玉米、小麦等物种中 γ-TMT的系统进化树, 为
深入研究 γ-TMT基因的功能和利用基因工程手段提
高花生维生素 E 的活性奠定了基础。同时, 克隆得
到花生 6个栽培种和 4个二倍体野生种中 γ-TMT的
DNA序列并进行了序列比对和同源分析, 为探讨花
生栽培中的野生亲本问题提供了分子生物学依据。
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