全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(4): 612619 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家自然科学基金项目(30570990), 国家转基因生物新品种培育重大专项(2008ZX08004), 黑龙江省重大科技攻关项目(GA06B103)和
东北农业大学创新团队项目(CXT004)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 朱延明, E-mail: ymzhu2001@neau.edu.cn
Received(收稿日期): 2010-06-25; Accepted(接受日期): 2011-01-06.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.00612
拟南芥 bZIP1转录因子通过与 ABRE元件结合调节 ABA信号传导
孙晓丽 李 勇 才 华 柏 锡 纪 巍 季佐军 朱延明*
东北农业大学生命科学学院植物生物工程研究室, 黑龙江哈尔滨 150030
摘 要: ABA 作为一种重要的植物激素和生长调节剂, 介导了高等植物在营养生长阶段对各种外界环境的响应和适
应。bZIP类转录因子可以通过 ABA依赖途径和 ABA非依赖途径调节植物的生长发育和对非生物胁迫的耐性。本研
究通过 AtbZIP1 T-DNA插入突变的拟南芥植株 ko-1 (SALK_059343)和 ko-2 (SALK_069489C)在 ABA处理后的表型实
验, 验证了 AtbZIP1 参与 ABA 依赖的信号传导通路。采用“三引物法”, 分别在 DNA 水平和 RNA 水平通过 PCR
和 RT-PCR验证了 AtbZIP1基因在拟南芥突变体中的沉默效果。定量分析数据表明, 在种子萌发阶段, 经过 0.6 μmol
L–1 ABA和 0.8 μmol L–1 ABA处理后, AtbZIP1缺失突变体拟南芥植株萌发率和叶片展开/绿色率比野生型植株高, 在
幼苗生长阶段, 经过 50 μmol L–1 ABA 处理后, AtbZIP1 缺失突变体拟南芥植株根长比野生型植株长。为了确定
AtbZIP1基因参与 ABA信号传导是否依赖于 ABRE元件, 在大肠杆菌中表达了 AtbZIP1 HIS6融合蛋白, 并设计了核
心序列为 CACGTG 的 ABRE 元件。凝胶阻滞电泳结果表明 AtbZIP1 融合蛋白可以与 ABRE 元件特异性结合。半定
量 RT-PCR 分析表明, AtbZIP1 基因的缺失改变了下游的 ABA 响应基因的表达。该结果表明, AtbZIP1 可以通过与
ABRE元件结合调节植物对 ABA处理的敏感性和下游 ABA响应基因的表达, 从而参与植物的 ABA信号传导通路。
关键词: bZIP; 转录因子; ABA信号传导; ABRE元件; ABA响应基因
Arabidopsis bZIP1 Transcription Factor Binding to the ABRE Cis-Element
Regulates Abscisic Acid Signal Transduction
SUN Xiao-Li, LI Yong, CAI Hua, BAI Xi, JI Wei, JI Zuo-Jun, and ZHU Yan-Ming*
Plant Bioengineering Laboratory, College of Life Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China
Abstract: Abscisic acid (ABA) is a phytohormone and mediates the response and adaptation of higher plants to various environ-
mental stresses during vegetative growth. The basic leucine zipper (bZIP) transcription factors are also important regulators of
plant development and abiotic resistance, acting through either ABA-dependent or ABA-independent pathways. In this study, we
investigated and characterized the involvement of the AtbZIP1 gene in plant responsiveness to ABA. As confirmed by PCR and
RT-PCR, AtbZIP1 has been silenced in mutant Arabidopsis ko-1 (SALK_059343) and ko-2 (SALK_069489C). The AtbZIP1
knockout plants demonstrated reduced sensitivity to ABA both at the seed germination and seedling stage with improvements in
rates of germination, leaf opening/greening, and primary root length. In order to investigate whether the regulation of AtbZIP1-
mediated ABA responsiveness depended on the ABA-responsive elements (ABRE), we expressed the AtbZIP1 HIS6 fusion pro-
tein in E. coli and found that the AtbZIP1 HIS6 specifically bound to the ABRE cis-elements. Semi-quantitive RT PCR showed
that AtbZIP1 disruption altered expressions of some ABA responsive genes, such as NCED3, RD22, KIN1, and RD29A. Our re-
sults indicated that AtbZIP1 regulates abscisic acid signal transduction by binding to the ABREs and altered the expressions of the
ABA responsive genes.
Keywords: AtbZIP1; Transcription factor; ABA signal transduction; ABRE; ABA responsive genes
脱落酸(ABA)是一种重要的植物激素 , 参与多
种重要的生物过程和反应, 如种子成熟和萌发、根
和茎的生长、生物和非生物胁迫等[1-2]。ABA调节植
物对多种不同的外界环境的反应, 如低温、干旱和
高盐等[3-4]。该调节作用是通过控制气孔开关和调节
下游基因的表达来实现的[5]。
第 4期 孙晓丽等: 拟南芥 bZIP1转录因子通过与 ABRE元件结合调节 ABA信号传导 613
当植物遭遇盐、干旱或低温等非生物胁迫时 ,
会同时激活 ABA依赖途径和 ABA非依赖途径两种
信号传导通路[3,6]。参与 ABA 依赖途径的基因不仅
诱导 ABA 的生物合成, 而且调节含有 ABA 响应元
件(ABRE 元件)的基因的表达[7-8]。bZIP 转录因子家
族可以与 ABRE元件结合, 被称为 ABA响应元件结
合因子(AREB)或 ABRE 结合因子(ABF)[9-10]。迄今
为止, 很多植物的转录因子, 如拟南芥、水稻、小麦、
大麦等, 都可以参与 ABA和胁迫信号传导[11-14]。
根据已经公布的拟南芥转录组数据 AtGen
Express, AtbZIP1转录因子基因在根中的表达受盐和
冷胁迫诱导, 在叶中则受盐和冷胁迫的抑制[15-16]。
研究表明, 蔗糖可抑制 AtbZIP1 转录因子基因的表
达, 可能参与蔗糖信号通路[16-17]。除此之外, 已有研
究证明 AtbZIP1基因的表达在一定程度上受 ABA诱
导[18]。然而, AtbZIP1参与盐胁迫或低温胁迫是否依
赖于 ABA, 还需要进一步的研究。本研究中, 我们
利用 AtbZIP1 基因 T-DNA 插入突变体拟南芥 ko-1
(SALK_059343)和 ko-2 (SALK_069489C)研究 AtbZIP1
是否参与以及如何参与 ABA依赖的信号传导通路。
1 材料与方法
1.1 植物材料
哥伦比亚野生型拟南芥植株, 由本研究室保存,
在含有 0.8%琼脂的 1/2 MS培养基上生长, 或在 1∶
1∶1 混合的蛭石∶草炭∶营养土的圆钵中生长, 培
养条件为 22℃、100 μmol Photons m–2 s–1、60%湿度、
16 h光照和 8 h黑暗。AtbZIP1 T-DNA插入突变体株
系 ko-1 (SALK_059343)和 ko-2 (SALK_069489C)购
自欧洲拟南芥原种中心 (NASC, http://arabidopsis.
org.uk/)。突变体株系 ko-1和 ko-2的 T-DNA都插入
在 AtbZIP1基因的 CDS 区, ko-1插入在起始密码子
下游 300 bp处, 而 ko-2插入在起始密码子下游 343
bp处。
1.2 AtbZIP1 T-DNA插入突变体拟南芥 PCR鉴定
采用 CTAB法提取 21 d龄的 ko-1和 ko-2突变
体株系的成熟叶片 DNA。采用引物对 1 (5′-TCTTGA
TCCTCGCAAAATCACAG-3′和 5′-GTACGTCTACA
ATCTCCAACCGCTA-3′, 都与 AtbZIP1 基因序列匹
配并且跨 T-DNA插入位点)鉴定 T-DNA插入是否纯
合。采用引物对 2 (5′-GGAACAACACTCAACCCTA
TCTCG-3′与T-DNA插入位点前的AtbZIP1基因序列
匹配, 5′-GTACGTCTACAATCTCCAACCGCTA-3′与
T-DNA 插入片段的序列匹配)用来鉴定 T-DNA 是否
插入到 AtbZIP1基因内部。
1.3 RT-PCR鉴定
采用Tiangen的RNA提取试剂盒RNAprep Plant
Kit (Beijing, China)提取 21 d 龄的拟南芥植株总
RNA, 并用 DNase I (TaKaRa, Shiga, Japan)消化去除
基因组 DNA污染。以 2 μg总 RNA为模板, 采用反
转录酶 Reverse Transcriptase M-MLV and RNase H–
(TaKaRa)进行 cDNA第一链的合成。以 1 μL cDNA
为模板, 采用基因特异引物(5′-ATCGATGAAAAGA
CAATGGACAGAGTT-3′和 5′-GGATCCGCAATTGT
ATCAGAATTCAG-3′)进行 RT-PCR 扩增 AtbZIP1 基
因的全长 CDS区域共 670 bp。PCR反应条件如下: 94
℃预变性 10 min, 94℃变性 30 s, 60℃退火 30 s, 72℃
延伸 25 s (共 30个循环), 72℃终延伸 10 min。拟南
芥的 Actin 基因作为内参基因 , 采用特异引物(5′-
CCTCCGTCTTGACCTTGC-3′和 5′-AGCGATACCT
GAGAACATAGTG-3′)进行 RT-PCR 扩增, 反应条件
同上, 26个循环。PCR产物通过 2%琼脂糖凝胶进行
电泳检测。
1.4 野生型和 ko突变体拟南芥 ABA敏感性实验
为了进行种子萌发和展叶率实验, 将野生型和
ko 突变体拟南芥种子用 5%次氯酸钠消毒, 播种至
含有 3%(W/V)蔗糖和 0.8%(W/V)琼脂的 1/2MS 培养
基上, 不含或含有 0.6 μmol L–1 ABA或 0.8 μmol L–1
ABA。当胚根突破种皮 1 mm时视为种子萌发, 分别
记录播种 2、4、6、8和 10 d的种子萌发率, 并在第
14天进行拍照。在根长实验中, 首先将野生型和 ko
突变体拟南芥种子播种在 1/2MS 培养基上生长, 将
7 d龄的幼苗转移到不含或含有 50 μmol L–1 ABA的
培养基上垂直培养 12 d, 拍照并统计根长。所有的
实验均重复 3次, 并采用 SPSS数据分析软件分析数
据(SPSS Inc., http://www.spss.com/)。
1.5 AtbZIP1全长基因原核表达
为了获得 AtbZIP1 HIS6标签融合蛋白, 采用特
异引物 (5′-TTTCCATGGTTATGGCAAACG-3′和 5′-
AAAGAGCTCCTTGTCTTAAAGGACG-3′)进行 PCR
扩增, 获得 AtbZIP1 基因全长, 并将 PCR 产物进行
Nco I和 Sac I酶切处理, 连接至 pET-32b原核表达
载体(Novagen, EMD Chemicals, NJ, USA), 融合与
HIS6标签上游。将载体转化至大肠杆菌 BL21 (DE3)
感受态细胞获得阳性转化子 , 并采用 1 mmol L–1
isopropyl 1-thio-β-D-galactopyranoside (IPTG)在 37
℃诱导蛋白表达 6 h, 最后通过 ProBond Purification
System (Invitrogen, CA, USA)纯化系统纯化目的蛋白。
614 作 物 学 报 第 37卷
1.6 凝胶阻滞实验
将 ABRE 元件及其突变体在含有 10 mmol L–1
Tris-HCl, pH 8.0和 100 mmol L–1 NaCl的缓冲液, 95
℃条件下变性 10 min, 并逐渐冷却至室温。将 10
pmol 的 ABRE 元件及其突变体采用末端转移酶和
DIG-11-dUTP (Roche, IN, USA)进行标记, 并检测标
记效率。根据 DIG Gel Shift Kit 2nd Generation凝胶
阻滞试剂盒说明书进行结合反应, 即将 AtbZIP1 纯
化蛋白与标记的探针(终浓度 0.2~0.5 nmol L–1)在标
准结合缓冲液[20 mmol L–1 Tris-HCl, pH 7.5, 10
mmol L–1 KCl, 1 mmol L–1 EDTA, 1 mmol L–1 dithio-
threitol, 0.2% (W/V) Tween-20, 10 mmol L–1
(NH4)2SO4]中 30℃温育 30min。DNA-蛋白复合体通
过 5%聚丙烯酰胺凝胶电泳于 42 V电泳 3 h, 然后将
DNA-蛋白复合体转移至尼龙膜, 并采用 DIG DNA
Labeling and Detection kit (Roche)检测信号。
1.7 ABA响应标记基因的表达特性分析
为了分析 ABA响应标记基因的表达特性, 将野
生型和突变体的种子播种在浸有 1/2MS 培养液的
Whatman 3MM 滤纸上, 培养 21 d 后, 将幼苗进行
100 μmol L–1 ABA处理 3 h或 6 h。采用 RNA提取
试剂盒 RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA,
USA)提取总 RNA, 并采用 Superscript III Kit (Invi-
trogen, Carlsbad, CA, USA), 通过 Oligo d(T)18引物
进行反转录。
RT-PCR反应条件如下: 94℃预变性 7 min, 94℃
变性 20 s, 60℃退火 20 s, 72℃延伸 15 s (AtbZIP1和
标记基因 28 循环, 内参基因 25 循环), 72℃终延伸
10 min。PCR产物通过 2%的琼脂糖凝胶进行电泳检
测。半定量 RT-PCR 中所采用的基因特异引物如下:
AtbZIP1 (5′-ACAAGTTCAGGTGCCGACATAG-3′和
5′-TTCGTCGTTCAGGACTGGAGAT-3′); NCED3
(5′-GAGATTTACCAGTGGGATGC-3′和 5′-ACTTCT
CATTACGATGAACAATAAG-3′); RD22 (5′-GGTTC
GGAAGAAGCGGAG-3′和 5′-GAAACAGCCCTGAC
GTGATAT-3′); KIN1 (5′-AACAAGAATGCCTTCCAA
GC-3′和 5′-CGCATCCGATACACTCTTTCC-3′); RD29A
(5′-ATGATGACGAGCTAGAACCTGAA-3′和 5′-GTA
ATCGGAAGACACGACAGG-3′); Actin (5′-GAAGA
TGGCAGACGCTGAGGAT-3′和 5′-ACGACCTACA
ATGCTGGGTAACAC-3′)。
2 结果与分析
2.1 AtbZIP1 T-DNA插入突变体鉴定
我们利用 AtbZIP1 T-DNA插入突变体拟南芥植
株 ko-1 (SALK_059343)和 ko-2 (SALK_069489C)分
析 AtbZIP1是否参与 ABA依赖的信号转导途径。我
们采用“三引物法”确定 T-DNA插入是否纯合, 采
用 RT-PCR分析 AtbZIP1基因在 T-DNA插入突变体
植株中是否被沉默。RT-PCR结果说明 AtbZIP1基因
的表达在突变体 ko-1 和 ko-2 中都受到抑制(图 1 和
图 2)。ko-1 突变体 1#株系和 ko-2 突变体 1#株系用
于进一步研究。
图 1 突变体拟南芥 ko-1 (SALK_059343)和 ko-2
(SALK_069489C)的 PCR和 RT-PCR鉴定
Fig. 1 PCR and RT-PCR analysis of ko-1 (SALK_059343) and
ko-2 (SALK_069489C) mutant Arabidopsis
Homo: PCR鉴定 T-DNA插入是否纯合。如果纯合, 不会检测到
任何条带; 但是野生型植株中由于没有 T-DNA 插入, 会检测到
一条清晰的条带。 Inser: PCR 鉴定突变体拟南芥中是否存在
T-DNA插入。如果有插入, 则会检测到一条清晰的条带; 而野生
型植株中不会有任何条带。RT: RT-PCR 鉴定突变体拟南芥中
AtbZIP1 基因是否被沉默。如果沉默, 不会检测到任何条带; 而
野生型植株中由于 AtbZIP1基因的内源表达, 会检测到一条明显
的条带。1: 水对照; 2: 野生型植株对照; 3~5: 拟南芥突变体株系。
Homo: PCR to identify if the T-DNA insertion was homozygous. If
homozygous, no band would be detected. One clear band would be
detected for the WT plant because of no T-DNA insertion. Inser:
PCR to identify if the T-DNA was inserted in the mutant Arabidop-
sis. If inserted, one clear band would be detected. No band would be
observed for the WT plant. RT: RT-PCR analysis to verify if
AtbZIP1 was silenced in the mutant Arabidopsis. If silenced, no
band would be detected. One clear band would be detected for the
WT plant because of the original expression of the AtbZIP1 gene in
the wild-type Arabidopsis. 1: Negative control with H2O as tem-
plate; 2: Control with DNA or cDNA from the wild-type Arabidop-
sis as template; 3–5: PCR amplication with DNA or cDNA from the
Arabidopsis mutant as template.
2.2 AtbZIP1缺失降低植株在种子萌发期对ABA
的响应
为了确定在种子萌发阶段, AtbZIP1 是否参与
ABA 依赖的信号途径 , 分别将野生型和纯合的
T-DNA 插入突变体(ko-1 和 ko-2)种子播种在不含或
含有 0.6 μmol L–1或 0.8 μmol L–1 ABA的 1/2MS培
养基上。突变体种子(ko-1 和 ko-2)与野生型种子一
样, 可以在不含有 ABA的培养基上正常萌发(图 2)。
然而, 在含有 0.6 μmol L–1或 0.8 μmol L–1 ABA的培
养基上, 与野生型相比, ko-1 和 ko-2 突变体植株生
长状况更好, 具有更高的萌发率和更多的展叶率(图
2)。另外, 在 ABA 存在的情况下, 所有的突变体植
第 4期 孙晓丽等: 拟南芥 bZIP1转录因子通过与 ABRE元件结合调节 ABA信号传导 615
株都比野生型植株生长得快, 具有更高的萌发率(图
3-B)。在 14 d 时, 对萌发率和展叶率的定量分析表
明 AtbZIP1缺失降低了种子萌发期植株对 ABA的响
应(图 3-B, C)。
2.3 AtbZIP1 基因缺失降低幼苗期植株对 ABA
的敏感性
为了鉴定 ABA处理条件下, AtbZIP1对幼苗生长
的影响, 我们进行了根长实验。当幼苗在 50 μmol L–1
ABA的培养基中垂直生长 10 d后, 突变体植株 ko-1
和 ko-2 的根比野生型更长(图 4)。根长定量分析进
一步确定了在 ABA处理条件下, 突变体植株根的生
长能力比野生型更强(图 5)。
2.4 AtbZIP1与 ABRE顺式作用元件结合
研究表明, 许多 bZIP转录因子可以通过与非生
物胁迫响应基因 , 如 RD29A 和 RD29B, 上游的
ABRE 元件相结合, 参与 ABA 依赖的信号传导通
路。为了验证 AtbZIP1 是否结合 ABRE 元件, 我们
设计了 ABRE (GGACACGTGGCG)元件或 ABRE的
突变体(GGACTTGTGGCG, 即 mABRE) 4次重复、
44 bp 的探针。我们构建了包含 AtbZIP1 全长 CDS
区且与 HIS6融合的原核表达载体(图 6)。
我们通过凝胶阻滞实验 EMSA 在体外检测了
DNA-蛋白的结合能力。纯化的 AtbZIP1 蛋白与
ABRE 元件或突变体 mABRE 在结合反应液中结合,
并通过 PAGE 胶电泳。地高辛检测结果表明 , 在
ABRE-AtbZIP1 同时存在时, 出现了一条滞后的条
带 , 而在仅含有 ABRE 元件、mABRE 元件或
mABRE-AtbZIP1时, 没有滞后的条带产生。当存在
过量的未标记的 ABRE 元件时, 滞后条带消失, 表
明 AtbZIP1 可以在体外与 ABRE 元件特异性结合。
为了排除 pET-32b 对照蛋白与 ABRE 元件结合的可
能性, 我们同时检测了 pET-32b 对照蛋白与 ABRE
元件的结合活性。如图 7-B所示, 在 ABRE-AtbZIP1
存在时, 可以检测到滞后条带, 而在 ABRE-pET-32b
存在时无条带出现, 表明 AtbZIP1 蛋白与 ABRE 元
件结合。
图 2 AtbZIP1基因缺失导致植株对 ABA不敏感
Fig. 2 Loss-of-function mutation in the AtbZIP1 gene results in ABA-insensitive phenotypes
616 作 物 学 报 第 37卷
图 3 ko突变体拟南芥植株在种子萌发期对 ABA的响应
Fig. 3 Seed germination in response to ABA in ko mutant Arabidopsis plants
A: 野生型和突变体拟南芥植株的种子萌发率统计。野生型和突变体拟南芥种子分别在不含有或含有 0.6 μmol L–1 ABA或 0.8 μmol L–1
ABA的 1/2MS培养基上萌发; 从播种第 2天开始, 每隔一天统计一次萌发率。数据代表 3次独立重复的平均值(每次重复 90粒种子)。
B: 野生型和突变体拟南芥植株在 0.6 μmol L–1 ABA或 0.8 μmol L–1 ABA处理 6 d时的种子萌发率统计。* P <0.05。C: ABA处理对展
叶率的影响。野生型和突变体种子分别在不含有或含有 0.6 μmol L–1 ABA或 0.8 μmol L–1 ABA的 1/2MS培养基上萌发。数据代表 3
次独立重复的平均值, * P <0.05。
A: time course seed germination ratio of WT, mutant ko-1 and ko-2 Arabidopsis. WT and ko seeds were germinated on 1/2MS solid medium
agar plates (controls) or supplemented with 0.6 μmol L–1 ABA or 0.8 μmol L–1 ABA. Germination was visually scored every two days for up
to 10 days after seed plates were placed at room temperature. Data shown represents the means (±SE) of three independent replicates (90
seeds in each); B: Germination rate of WT and mutant ko-1 and ko-2 Arabidopsis in the presence of 0.6 μmol L–1 ABA or 0.8 μmol L–1 ABA
on day 6. * P <0.05 by Student’s t-test; C: Effect of ABA on leaf opening and greening in WT, mutant ko-1 and ko-2 Arabidopsis, grown on
1/2MS media supplemented with 0.6 μmol L–1 ABA or 0.8 μmol L–1 ABA or no ABA. Data are means (±SE) of three replicates.
* P <0.05 by Student’s t-test.
2.5 AtbZIP1 缺失改变 ABA 响应标记基因的表
达特性
为了进一步确定 AtbZIP1基因在 ABA响应中的
作用, 我们检测了野生型和突变体(ko-1)植株在 100
μmol L–1 ABA处理后, 已知的ABA响应标记基因如
NCED3、RD22、KIN1、COR15A 和 RD29A 的表达
量变化。研究表明, 所有这些基因都受 ABA诱导。
半定量 RT-PCR 分析表明在野生型和突变体中, 所
有基因的表达都受 ABA 诱导。然而, AtbZIP1 缺失
导致了这些基因表达提前。并且正常情况下, RD22
基因在突变体中表达 , 但在野生型植株中没有表
达。ABA处理 3 h后, NCED3在突变体中表达量高
于野生型植株。当 ABA处理 6 h后, 所有基因在突
变体中的表达量均低于野生型(图 8)。因此, AtbZIP1
可能在植物的防御网络中与 NCED3、RD22、KIN1
和 RD29A存在密切关系。
3 讨论
随着反向遗传学和生物信息学的发展与高通量
筛选体系的建立, 已经鉴定了很多植物生长发育和
非生物胁迫反应过程中的关键调节基因[21]。如何在
相对较短的时间内完成这些基因的功能分析, 已经
成为下一步研究的重大挑战。超量表达技术、RNA
干扰技术和 T-DNA 插入突变体已经被广泛应用在
第 4期 孙晓丽等: 拟南芥 bZIP1转录因子通过与 ABRE元件结合调节 ABA信号传导 617
图 4 AtbZIP1基因缺失在幼苗期对 ABA的影响
Fig. 4 Loss-of-function mutation in the AtbZIP1 gene reduces
plant sensitivity to ABA during the seedling stage
图中所示为野生型和突变体拟南芥幼苗在不含或含有 50 μmol
L–1 ABA的 1/2MS培养基上的生长状况, 该图为垂直生长 12 d
后的生长状况。
Pictures show the phenotypes of WT, ko-1 and ko-2 mutant seed-
lings grown on either 1/2MS media or 1/2MS media with 50 μmol
L–1 ABA, respectively. Photographs were taken after vertical
growth occurred for 12 d.
图 5 野生型和突变体植株在 ABA处理后的根长比较
Fig. 5 Root length of WT and mutant plants in response to ABA
在幼苗垂直生长 12 d后测量根长并记录。所有的数据为 3次独
立生物学重复的平均值(每次 15株幼苗), * P<0.05。
The root length was measured on day 12 of vertical growth. All
values represent means (±SE) from three independent repeats (15
seedlings in each). * P<0.05 by Student’s t-test.
基因功能的研究中 [22-23]。本研究中 , 我们利用
T-DNA 插入突变体拟南芥, 通过种子萌发实验和根
长实验证明了 AtbZIP1基因负向调节 ABA信号传导
通路。
ABA 作为一个关键的调节子, 参与植物的各种
生物和生理过程[5]。通过 ABA调控基因的启动子研
究已经鉴定出很多 ABA响应元件[6]。很多 ABRE元
件包含 1 个 ACGT 核心序列, 如小麦 Em 基因上游
图 6 AtbZIP1-HIS6融合蛋白的原核表达
Fig. 6 Expression of the AtbZIP1-HIS6 fusion proteins in E. coli
M: 蛋白 marker; 1: 含有 pET-32b空载体的大肠杆菌未诱导的细胞
裂解物; 2: 含有 pET-32b空载体的大肠杆菌 IPTG诱导的细胞裂解
物; 3, 4: bZIP1未诱导的大肠杆菌细胞裂解物; 5, 6: bZIP1受 IPTG诱
导的大肠杆菌细胞裂解物。箭头所示为诱导后的特异蛋白条带。
M: Protein marker; 1: The cell lysate from E. coli carrying the
pET-32b empty vector not induced by IPTG; 2: The cell lysate from
E. coli carrying the pET-32b empty vector induced by IPTG; 3, 4:
The cell lysate from E. coli carrying the pET-32b-bZIP1 vector not
induced by IPTG; 5, 6: The cell lysate from E. coli carrying the
pET-32b-bZIP1 vector induced by IPTG. The arrows indicate the
band corresponding to the induction proteins.
图 7 AtbZIP1与 ABRE元件的结合特异性分析
Fig. 7 Analysis of AtbZIP1 binding specificity to the ABRE
cis-element
A: AtbZIP1蛋白与标记的 ABRE元件或标记的突变的 ABRE元
件(mABRE)反应并 PAGE 胶分离。在仅有 ABRE 元件、仅有
mABRE 元件或 mABRE-AtbZIP1 泳道中无滞后条带信号, 而在
ABRE-AtbZIP1泳道中有一条明显的滞后条带。当加入过量的未
标记的 ABRE 元件时 , 滞后条带消失。B: AtbZIP1 蛋白和
pET-32b蛋白分别与标记的 ABRE元件反应。
A: The AtbZIP1 protein was mixed with labeled ABRE or mutant
ABRE (mABRE) and resolved by PAGE gels. No signals were
detected in either ABRE only sample, mABRE only sample, or
mABRE-AtbZIP1 sample. While a strong band with hysteretic
mobility was present in ABRE-AtbZIP1 sample. When unlabeled
ABRE was added, the hysteretic band disappeared. B: The AtbZIP1
and pET-32b proteins (negative control) were mixed with the labled
ABRE and resolved by PAGE gels.
的 Em1a 元件(GGACACGTGGC), 而其他的 ABRE
元件则不包含 ACGT 核心序列, 如大麦 HVA1 基因
上游的 CE3 元件(ACGCGTGTCCTC), 水稻 rab16B
618 作 物 学 报 第 37卷
图 8 野生型和 ko-1突变体中 ABA响应基因的表达变化分析
Fig. 8 Expression of ABA-responsive genes in the WT and
ko-1 mutant plant
半定量 RT-PCR分析 ABA响应标记基因在野生型和 ko-1突变体
植株叶中的表达量变化。21 d龄的幼苗通过 100 μmol L–1 ABA
处理 3 h或 6 h。
Semi-quantitative PCR was conducted to analyze expressions of
ABA-responsive genes in the leaves of WT and ko-1 mutant plant.
The 21-day-old seedlings were treated with 100 μmol L–1 ABA for
3 h or 6 h. Expression of Actin was used as an internal control.
上游的“motif III”(GCCGCGTGGC)和人工合成元
件 hex-3 (GGACGCGTGGC)。ACGT核心序列中的
“A”在 bZIP 蛋白的结合特性中发挥重要的作用,
如 bZIPs 不能与“CGCGTG”元件结合[20]。本研究
中, 我们证明了 AtbZIP1可与ABRE元件相结合, 表
明 AtbZIP1参与 ABA依赖的信号传导通路。
植物对各种外界环境的反应和适应是一个复杂
的过程, 包括一系列生理反应、多种信号传导和基
因表达调控。转录因子, 作为调控蛋白, 在信号传导
通路和基因调控网路的上游发挥作用。因此, 转录
因子的功能分析成为研究植物抗非生物胁迫分子机
制的研究热点。本研究证明了 AtbZIP1 基因参与
ABA依赖的信号传导通路, 并且能够与 ABRE元件
相结合。该研究结果为金依序研究该转录因子基因
在不同的外界环境条件的作用奠定了基础。
4 结论
本研究表明碱性亮氨酸拉链转录因子基因
AtbZIP1参与 ABA依赖的信号传导通路。我们分别
通过 PCR和 RT-PCR分析鉴定了 AtbZIP1 T-DNA插
入的突变体拟南芥 ko-1 (SALK_059343)和 ko-2
(SALK_069489C)。AtbZIP1 基因缺失提高了种子萌
发期和幼苗期植株对 ABA的耐性, 表现在种子萌发
率、展叶率和根长方面的显著增长。除此之外 ,
AtbZIP1基因可以与已知的 ABA响应元件 ABRE元
件相结合, 并且 AtbZIP1基因的缺失提高了 ABA响
应标记基因的表达 , 如 NCED3、RD22、KIN1 和
RD29A。该结果表明 AtbZIP1 转录因子基因通过与
ABRE元件相结合, 参与 ABA信号传导通路。
References
[1] Leung J, Giraudat J. Abscisic acid signal transduction. J Annu
Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 1998, 49: 199–222
[2] Busk P K, Pagès M. Regulation of abscisic acid-induced tran-
scription. Plant Mol Biol, 1998, 37: 425–435
[3] Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. Molecular responses to
drought and cold stress. Curr Opin Biotech, 1996, 7: 161–167
[4] Thomashow M F. Role of cold-responsive genes in plant freezing
tolerance. Plant Physiol, 1998, 118: 1–7
[5] Verslues P E, Zhu J K. Before and beyond ABA: upstream sens-
ing and internal signals that determine ABA accumulation and
response under abiotic stress. Biochem Soc Trans, 2005, 33:
375–379
[6] Bray E A. Plant responses to water deficit. Trends Plant Sci, 1997,
2: 48–54
[7] Zhu J K. Salt and drought stress signal transduction in plants.
Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 2002, 53: 247–273
[8] Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. Gene networks involved
in drought stress response and tolerance. J Exp Bot, 2007, 58:
221–227
[9] Uno Y, Furuhata T, Abe H, Yoshida R, Shinozaki K, Yamagu-
chi-Shinozaki K. Arabidopsis basic leucine zipper transcription
factors involved in an abscisic acid-dependent signal transduction
pathway under drought and high-salinity conditions. Proc Natl
Acad Sci USA, 2000, 97: 11632–11637
[10] Choi H, Hong J, Ha J, Kang J, Kim S Y. ABFs, a family of
ABA-responsive element binding factors. J Biol Chem, 2000, 275:
1723–1730
[11] Fujita Y, Fujita M, Satoh R, Maruyama K, Parvez M M, Seki M,
Hiratsu K, Ohme-Takagi M, Shinosaki K, Yamaguchi-Shinosaki
K. AREB1 is a transcription activator of novel ABRE-dependent
ABA signaling that enhances drought stress tolerance in Arabi-
dopsis. Plant Cell, 2005, 17: 3470–3488
[12] Lu G, Gao C, Zheng X, Han B. Identification of OsbZIP72 as a
positive regulator of ABA response and drought tolerance in rice.
Planta, 2009, 229: 605–615
[13] Kobayashi F, Maeta E, Terashima A, Takumi S. Positive role of a
wheat HvABI5 ortholog in abiotic stress response of seedlings.
Physiol Plantarum, 2008, 134: 74–86
[14] Casaretto J A, Ho T H. The transcription factors HvABI5 and
HvVP1 are required for the ABA induction of gene expression in
barley aleurone cells. Plant Cell, 2003, 15: 271–284
[15] Kilian J, Whitehead D, Horak J, Wanke D, Weinl S, Batistic O,
D’Angelo C, Bornberg-Bauer E, Kudla J, Harter K. The AtGen-
express global stress expression data set: protocols, evaluation
and model data analysis of UV-B light, drought and cold stress
responses. Plant J, 2007, 50: 347–363
第 4期 孙晓丽等: 拟南芥 bZIP1转录因子通过与 ABRE元件结合调节 ABA信号传导 619
[16] Weltmeier F, Rahmani F, Ehlert A, Dietrich K, Wang X, Schutze
K, Chaban C, Hanson J, Teige M, Harter K, Vicente-Carbajosa J,
Smeekens S, Droge-Laser W. Expression patterns within the
Arabidopsis C/S1 bZIP transcription factor network: availability
of heterodimerization partners controls gene expression during
stress response and development. Plant Mol Biol, 2008, 69:
107–119
[17] Kang S G, Price J, Lin P C, Hong J C, Jang J C. The Arabidopsis
bZIP1 transcription factor is invovled in sugar signaling, protein
networking, and DNA binding. Mol Plant, 2010, 3: 361–373
[18] Zimmermann P, Hirsch-Hoffmann M, Hennig L, Gruissem W.
GENEVESTIGATOR. Arabidopsis microarray database and
analysis toolbox. Plant Physiol, 2004, 136: 2621–2632
[19] Guo J-P(郭金平), Pan D-R(潘大仁). PCR detection of nematode
resistance in sweet potato. Acta Agron Sin (作物学报), 2002,
28(2): 167–169 (in Chinese with English abstract)
[20] Ardie S W, Xie L, Takahashi R, Liu S, Takano T. Cloning of a
high-affinity K+ transporter gene PutHKT2;1 from Puccinellia
tenuiflora and its functional comparison with OsHKT2;1 from
rice in yeast and Arabidopsis. J Exp Bot, 2009, 60: 3491–3502
[21] Seki M, Narusaka M, Abe H, Kasuga M, Yamaguchi-Shinozaki K,
Carninci P, Hayashizaki Y, and Shinozaki K. Monitoring the
expression pattern of 1300 Arabidopsis genes under drought and
cold stresses by using a full-length cDNA microarray. Plant Cell,
2001, 13: 61–72
[22] Xiang Y, Tang N, Du H, Ye H Y, Xiong L Z. Characterization of
OsbZIP23 as a key player of the basic leucine zipper transcription
factor family for conferring abscisic acid sensitivity and salinity
and drought tolerance in rice. Plant Physiol, 2008, 148: 1938–
1952
[23] Yang O, Popova O V, Suthoff U, Luking I, Dietz K J, Golldack D.
The Arabidopsis basic leucine zipper transcription factor
AtbZIP24 regulates complex transcriptional networks involved in
abiotic stress resistance. Gene, 2009, 436: 45–55
[24] Izawa T, Foster R, Chua N H. Plant bZIP protein DNA binding
specificity. J Mol Biol, 1993, 230: 1131–1144