全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(2): 313−320 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2008AA10Z408, 2006 AA10Z1B4)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 程备久, E-mail: cbj@ahau.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail:wjmmjw2000@163.com
Received(收稿日期): 2009-06-11; Accepted(接受日期): 2009-08-31.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.00313
RNA 干扰水稻 SBE3 基因的表达对籽粒淀粉合成及其关键酶活性的
影响
汪结明 张 建 江海洋 朱苏文 范 军 程备久*
安徽农业大学作物生物学安徽省重点实验室, 安徽合肥 230036
摘 要: 为探讨 RNA干扰水稻 SBE3基因的表达对籽粒淀粉合成及其关键酶活性的影响, 以水稻品种中花 11及以其
为受体的转基因株系为材料, 分别检测水稻 SBE3基因的表达、籽粒发育各时期淀粉合成关键酶活性变化及直链、支
链淀粉相对含量。结果表明, 导入的 SBE3 基因 RNA 干扰结构成功地降低了目的基因的表达, 并使其酶活性在籽粒
发育各时期均显著降低并提前 3 d 达高峰期, 且不同株系间具有差异。同时也使不同发育时期籽粒的 ADPG-PPase
和 SSS及 DBE活性均不同程度地显著降低, 尤其以 SSS和 ADPG-PPase活性峰值降幅最大。此外, 两个转基因水稻
株系各时期籽粒直链淀粉含量均显著高于对照, 而其成熟籽粒千粒重却显著降低, 直链淀粉含量越高, 千粒重越低。
关键词: 水稻; RNA干扰; 淀粉分支酶 3; 淀粉合成; 酶活
Effects of RNA Interference of SBE3 Gene Expression on Starch Accumulation
and Key Enzymes Activities Involved in Starch Synthesis in Transgenic Rice
Grain
WANG Jie-Ming, ZHANG Jian, JIANG Hai-Yang, ZHU Su-Wen, FAN Jun, and CHENG Bei-Jiu*
Anhui Agricultural University, Anhui Provincial Key Laboratory of Crop Biology, Hefei 230036, China
Abstract: Rice cultivar “Zhonghua 11” (control) and its transgenic line were used as the experimental materials. The expression
level of SBE3 gene, some related key enzymes activities, and the contents of amylose and amylopectin at different developmental
stages of rice grain were measured. Results showed that the SBE3 gene expression level and the SBE activity were distinctly re-
duced by RNA interference (RNAi), but a little difference was observed between the two transgenic lines. The peak values of SBE
activity reached three days earlier in transgenic rice than in non-transgenic control. RNAi of the SBE3 gene expression level also
obviously reduced the enzyme activities of ADPG-PPase, SSS and DBE during different grain developmental stages, especially,
the peak values of activities of ADPG-PPase and SSS decreased to the largest extent. In addition, the content of amylose was sig-
nificantly higher at different developmental stages in transgenic rice grain than that in the control, while thousand-grain weight
was significantly reduced in mature grain, the general trend was that the higher the amylose content, the smaller the grain weight.
Keywords: Rice; RNA interference; Starch branching enzyme 3; Starch accumulation; Enzyme activity
水稻(Oryza sativa L.)籽粒中主要的能量贮藏物
质是淀粉, 它约占糙米干重的 90%。籽粒的灌浆过
程主要是淀粉合成和积累的过程[1]。茎、叶等源器
官制造的光合产物以蔗糖形式运输到库器官籽粒中,
在一系列酶的催化作用下形成淀粉 [2], 该过程淀粉
合成主要涉及四类酶, 即 ADP 葡萄糖焦磷酸化酶
(ADP-glucose pyrophosphorylase, ADPG-PPase, EC
2.7.7.27)、淀粉合成酶 (starch synthase, SS, EC
2.4.1.21)、淀粉分支酶或 Q-酶(starch branching en-
zyme, SBE or Q-enzyme, EC 2.4.1.18)和去分支酶
(debranching enzyme, DBE, EC 3.2.1.70)[3]。
ADPG-PPase 是淀粉合成中第一个酶, 它催化
1-磷酸葡萄糖和 ATP 生成 ADP-葡萄糖(ADPG), 是
淀粉合成的限速酶[4]。SBE的主要作用是剪切 α-1,4
糖苷键转化为 α-1,6 糖苷键而形成葡聚糖链的分支
点, 它的一个同工型酶 SBE3 被认为在形成支链淀
314 作 物 学 报 第 36卷

粉过程中起最关键的作用[5-6]。颗粒结合型淀粉合酶
I (granule-bound starch synthase I, GBSS I或 Waxy)
与可溶性淀粉合酶(soluble starch synthase, SSS)同属
于 SS 酶类, 都是将 ADPG 的葡萄糖基转移至(1,4)
葡聚糖链的非还原末端, 但前者只有结合在淀粉粒
上才能起催化作用, 而后者主要存在于质体的基质
中[7-8]。淀粉去分支酶(DBE)主要是剪切各分支链到
适当长度, 并再次作为淀粉合酶的底物[9]。研究发现
直链淀粉是由 GBSS I直接催化的, 而支链淀粉则是
SBE、SSS和 DBE共同作用的产物[10]。
直链淀粉和支链淀粉的比例决定着淀粉的用
途。高支链、低直链的淀粉主要用于食品业, 而高
直链、低支链的淀粉则在工业上有着更为广阔的应
用前景[11]。本课题组利用农杆菌介导的水稻高效转
化体系, 将 SBE3基因 RNA干扰表达载体(下文有时
简称 RNA 干扰)成功导入水稻基因组, 获得了可稳
定遗传的直链淀粉含量显著提高的转基因品系[12]。
为深入研究 SBE基因在水稻籽粒淀粉合成中的作用
提供了良好的试验材料。
本文以 SBE3基因 RNA干扰转基因水稻 T3代及
其亲本中花 11 为材料, 研究 SBE3 基因表达水平降
低后对水稻籽粒发育过程中淀粉的积累及相关酶活
性的影响, 旨在探讨籽粒中淀粉积累的机理, 并为
稻米品质和产量的遗传改良提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 植物材料
试验于 2008 年 5~12 月在安徽农业大学农萃园
作物繁育基地进行。供试材料为典型粳稻品种
(Oryza sativa L. subsp japonica)中花 11 (直链淀粉含
量 14.2%, 用作对照)及以其为受体的 SBE3 基因
RNA 干扰转基因水稻 CI 和 C2 株系(直链淀粉含量
分别为 33.4%和 22.3%)。于 5月 26日播种, 湿润育
秧, 6月 29日移栽, 按常规方法进行田间管理。
1.2 试验方法
1.2.1 不同发育天数籽粒的采集 选取待测品系
始穗期、穗型大小基本一致的穗子挂牌标记开花日
期, 分别取花后 5、8、11、14、17、20、23、26、
29、32、35、38、41 d的籽粒进行酶活性及淀粉含
量的测定[13]。
1.2.2 半定量 RT-PCR检测转基因株系 SBE3基因的
表达 采用 Trizol法[14]分别提取中花 11和转基因
株系未成熟种子(花后 2 周)的总 RNA, 根据已发表
的水稻 Actin1 基因序列 (GenBank 登录号为
AY212324)设计引物 , 5端引物 Act-F 为 5-CCC
TTGTGTGTGACAATGGAACT-3, 3端引物 Act-R
为 5-GACACGGAGCTCGTTGTAGAAGG-3, PCR
产物为 269 bp; 根据水稻 SBE3 基因序列(GenBank
登录号为 D16201)设计 RT-PCR 引物, 5端引物 SB
E3-F为 5-ATGAGTTCGGACATCCTGAATGG-3, 3
端引物 SBE3-R 为 5-CATTCCGCTGGAGCATAG
ACAAC-3。PCR产物应为 511 bp。反转录试剂盒为
上海申能博彩生物科技有限公司生产。以 Actin1 基
因作为内参, PCR程序为 94℃预变性 2 min; 94℃变
性 30 s、60℃退火 30 s、72℃延伸 30 s, 共 25个循
环; 最后 72℃延伸 10 min, 用凝胶成像分析系统对
扩增产物琼脂糖电泳谱带进行半定量分析。
1.2.3 酶活性的测定 参考 Douglas 等[15]和张智
猛等 [16]的方法检测 ADPGPPase 活性 ; 参考
Nakamura 等[17-18]和程方民等[19]的方法测定 SSS 及
GBSS 的活性; 参照李太贵等[20]的方法检测 SBE 的
活性。参考 Kubo 等[21]和吕冰等[22]的方法测定 DBE
中异淀粉酶(isoamylase, ISA)和普鲁兰酶(pullulanase,
PA)的活性。以上酶活的测定均重复 3~4次。
1.2.4 籽粒直链淀粉相对含量的测定 利用
Sigma 公司的直链和支链淀粉, 按比例稀释成不同
梯度浓度 , 采用张永凤等 [23]的方法制作标准曲线 ,
计算样品直链淀粉含量。
2 结果与分析
2.1 RNA干扰对转基因水稻 SBE3基因的表达及
其酶活性的影响
为检验 SBE3 基因 RNA 干扰效果, 通过半定量
RT-PCR法检测了该基因的表达量。结果显示, 籽粒
中 SBE3 基因的表达量均较对照明显降低(图 1), 且
株系间存在差异。说明 RNA干扰已抑制了 SBE3基
因的表达, 且可能是因为外源基因插入基因组后的
“位置效应”导致了株系间的表达差异[24]。
由图 2 可知, 转基因株系和对照的 SBE 活性变
化趋势都呈单峰曲线 , 在灌浆前期活性很快升高 ,
在达到高峰后很快下降, 至花后 26 d后下降速率明
显变缓, 但转基因水稻在第 14天左右 SBE酶活性即
达最大值(对照为第 17 天), 活性高峰期提前到达。
这可能是由于 SBE基因被 RNA干扰后, 表达量降低,
其酶活性难以持续升高至第 17天。此外, 两个转基
第 2期 汪结明等: RNA干扰水稻 SBE3基因的表达对籽粒淀粉合成及其关键酶活性的影响 315


因水稻株系籽粒的 SBE活性在胚乳发育的各个时期
均显著低于对照, 且 C2 株系酶活高于 C1 株系, 这
表明 RNA 干扰已显著降低了 SBE3 基因的表达, 且
在不同株系间存在差异。

图 1 籽粒 SBE3 基因的半定量 RT-PCR
Fig. 1 Semi RT-PCR of SBE3 gene expression
M: DNA marker DL 2000; 1: 中花 11; 2: 转基因株系 C1; 3: 转基
因株系 C2。
M: DNA marker DL 2000; lane 1: untransformed line (control);
lane 2: transgenic line C1; lane 3: transgenic line C2.
2.2 RNA 干扰对转基因水稻籽粒淀粉合成动态
的影响
水稻籽粒中直链淀粉和支链淀粉的含量是淀粉
结构和组成的重要指标[25]。从图 3 可以看出, 转基
因水稻在灌浆初期直链淀粉相对含量随发育进程迅
速升高, 而支链淀粉相对含量迅速下降, 花后 20 d
后上升或下降的速率明显变缓并维持较稳定的水
平。说明 RNA干扰 SBE3基因后使其表达水平降低,
支链淀粉合成受抑, 支链淀粉相对含量降低, 直链
淀粉相对含量增加 , 这一效果在灌浆初期最为明
显。对于直链淀粉灌浆速率, C1株系显著高于 C2株
系。此外, 对照中花 11在籽粒发育的各个时期其直
链和支链淀粉相对含量始终维持较稳定的比值, 变
化不显著 , 说明这两种淀粉的合成基本上是同步
的。

图 2 SBE3 基因 RNA 干扰的转基因水稻籽粒中 SBE 活性的变化
Fig. 2 Changes of SBE activity in transgenic rice grain with RNA interference of SBE3 gene

图 3 SBE3 基因 RNA 干扰的转基因水稻籽粒支链淀粉、直链淀粉含量变化
Fig. 3 Changes of apparent content of amylopectin and amylose in transgenic rice grain with RNA interference of SBE3 gene

2.3 RNA干扰 SBE3基因对籽粒发育各时期其他
淀粉合成关键酶活性的影响
2.3.1 对 ADPG-PPase 活性的影响 籽粒发育
过程中 ADPG-PPase 活性的变化明显 , 初期较低 ,
然后迅速升高 , 大约在花后 17 d 左右达高峰 , 随
后又逐渐降低 , 各种材料的变化趋势相似 , 均呈
单峰曲线。从图 4 可以看出 , 两个转基因株系籽粒
发育中期 ADPG-PPase 活性都显著低于对照(P<0.05),
且 C1 株系下降幅度大于 C2 株系。说明 RNA 干扰
SBE3基因不仅抑制了 SBE的活性 , 同时也部分抑
制了 ADPG-PPase 活性。由于 ADPG-PPase 催化
1-磷酸葡萄糖和 ATP 生成 ADP-葡萄糖 (ADPG),
而 ADPG 是淀粉合酶的底物 , 因此导致淀粉积累
量降低。
316 作 物 学 报 第 36卷


图 4 SBE3 基因 RNA 干扰的转基因水稻籽粒中 ADPG-PPase 活性的变化
Fig. 4 Changes of ADPG-PPase activity in transgenic rice grain with RNA interference of SBE3 gene

2.3.2 对 GBSS 活性的影响 由图 5 可知, 转基因
植株和对照的 GBSS 活性变化都呈单峰曲线, 酶活性
最大值都出现在花后 20 d左右, 在籽粒发育整个过程
中两个转基因水稻株系酶活均稍高于同时期的对照,
且 C1稍大于 C2, 但差异均不显著(P>0.05)。说明 RNA
干扰 SBE3基因并不能显著地改变 GBSS活性水平。

图 5 SBE3 基因 RNA 干扰的转基因水稻籽粒中 GBSS 活性的
变化
Fig. 5 Changes of GBSS activity in transgenic rice grain with
RNA interference of SBE3 gene

2.3.3 对 SSS 活性变化的影响 由图 6 可知, 转
基因株系和对照籽粒中的 SSS 活性在灌浆前期均上
升较快, 花后 11 d 即达高峰, 灌浆中后期下降速度
又均明显变慢, 说明 SBE活性降低并未影响 SSS在
籽粒发育整个过程中的活性变化规律。此外, 两个
转基因水稻籽粒发育初期至中后期(约花后 5~26 d)

图 6 SBE3 基因 RNA 干扰的转基因水稻籽粒中 SSS 活性的变化
Fig. 6 Changes of SSS activity in transgenic rice grain with
RNA interference of SBE3 gene
SSS的活性均显著低于同时期的对照, 且 C1株系下
降的幅度显著高于 C2 株系, 说明 RNA 干扰 SBE3
基因在导致其自身酶活性显著降低的同时 ,也不同
程度地抑制了 SSS 活性, 而 SSS 是合成支链淀粉的
关键酶, 因此可能会导致支链淀粉积累量的降低。
2.3.4 对 DBE 活性的影响 分别检测了水稻籽
粒发育过程中两类淀粉脱支酶的活性变化, 一类是
以普鲁兰糖为底物的普鲁兰酶(PA), 另一类是催化
支链淀粉反应的异淀粉酶(ISA)。由图 7可知, PA和
ISA活性的变化不同, PA活性在灌浆前期迅速增加,
在花后 14 d 左右达到最大值, 此后急剧下降, 成熟
期籽粒的 PA活性都很低, 而 ISA活性是在花后 20 d
才达到最大值。此外, 从转基因水稻与对照比较的
结果可以看出, 前者两个株系的 PA和 ISA活性均显
著小于后者, 且不同株系间具有差异, 说明水稻中
SBE活性与 DBE相关, 前者降低可导致后者不同程
度的下降。

图 7 SBE3 基因 RNA 干扰的转基因水稻籽粒中 PA 和 ISA 活
性的变化
Fig. 7 Changes of PA and ISA activities in transgenic rice
grain with RNA interference of SBE3 gene

2.4 RNA干扰水稻 SBE3基因对淀粉合成各关键
酶活性峰值的影响
由表 1可知, RNA干扰水稻 SBE3基因对其自身
酶活性峰值的影响最大, 其中C1株系下降了 71.1%,
第 2期 汪结明等: RNA干扰水稻 SBE3基因的表达对籽粒淀粉合成及其关键酶活性的影响 317


且株系间存在差异。由于 SBE3基因在淀粉合成中不
是孤立地发挥作用, 其酶活性下降的同时, ADPG-
PPase、SSS 和 DBE的活性也显著降低, GBSS活性
稍有提高但差异不显著。就其影响程度而言, C1 株
系的SSS和ADPG-PPase活性降幅最大, 分别为14.7%
和 13.9%。

表 1 转基因水稻淀粉合成各关键酶活性峰值的比较
Table 1 Comparison of maximal enzymes activities among several key enzymes involving in starch biosynthesis
酶
Enzyme
中花 11
Zhonghua 11
转基因株系 C1
Transgenic line C1
转基因株系 C2
Transgenic line C2
SBE 32.2±0.76 9.3±0.43 13.7±0.52
ADPG-PPase 125.1±3.51 107.6±3.09 113.3±3.31
GBSS 15.6±0.32 16.5±0.71 16.1±0.65
SSS 55.7±1.31 47.5±1.32 51.7±1.39
PA 42.5±1.12 37.9±1.02 39.1±1.09
ISA 19.5±0.72 17.2±0.71 17.9±0.59
除 SBE活性单位为 U 1000 seed−1 min−1外, 其余均为 nmol 1000 seed−1 min−1
The unit of SBE activity is “U 1000 seed−1 min-1”, others are “nmol 1000 seed−1 min−1”.

2.5 SBE3基因RNA干扰对转基因水稻成熟籽粒
淀粉组成及千粒重的影响
成熟籽粒淀粉构成的分析表明, C1和C2两个转
基因株系的直链淀粉含量均显著高于对照, 分别提
高了 133%和 56%。说明 RNA 干扰 SBE3 基因已显
著影响了直链淀粉的合成, 达到了预期效果。此外
还发现, 两个转基因株系与对照中花 11 相比, 成熟
籽粒小并皱缩, 透明度差(图 8)。为检测千粒重的变
化情况 , 分别随机选取两个转基因株系及对照的
500粒成熟籽粒进行检测。由表 2可看出, C1和 C2

图 8 籽粒外形
Fig. 8 Appearance of seeds
A: 未转化植株的籽粒; B: 转化株系 C2的籽粒; C: 转化株系 C1
的籽粒。
A: grain from untransformed plants; B: grain from transgenic line
C2; C: grain from transgenic line C1.

表 2 水稻成熟籽粒千粒重及淀粉构成
Table 2 Starch composition and thousand-grain weight in rice
品种
Variety
千粒重
1000-grain weight (g)
直链淀粉含量
Amylose content (%)
支链淀粉含量
Amylopectin content (%)
中花 11 Zhonghua 11 28.2±0.37 14.2±0.23 85.8±0.52
转基因株系 C1 Transgenic line C1 23.2±0.32 33.1±0.33 66.9±0.57
转基因株系 C2 Transgenic line C2 25.3±0.39 22.2±0.35 77.8±0.33

的千粒重均显著下降, 分别下降 17.7%和 10.3%, 且
直链淀粉含量上升幅度越大的株系, 千粒重下降越
明显。
综上分析可知, RNA干扰水稻 SBE3基因一方面
导致其自身活性的极显著降低, 使支链淀粉合成受
抑, 直链淀粉含量显著提高。另一方面, 导致其他淀
粉合成关键酶活性除 GBSS稍有提高外均显著降低,
这可能是水稻千粒重下降的一个重要原因。
3 讨论
淀粉是水稻胚乳中碳水化合物的主要贮存形式,
主要由线性的直链淀粉和高度分支的支链淀粉组
成[26-27]。直链淀粉和支链淀粉合成的先后关系一直是
研究的热点, 但也是争论的焦点。早期人们认为直链
淀粉的合成先于支链淀粉, 直链淀粉是支链淀粉合成
的前体, 前者在 SBE 的作用下分支形成后者[28]。而
Van等[29]和 Ball等[30]则认为支链淀粉的合成先于直
链淀粉。何祖华等[31]和何秀英等[32]认为, 糯性籽粒
发育初期直接合成支链淀粉, 没有经过直链淀粉至
支链淀粉的阶段。而本研究结果却显示, 非转基因
水稻在籽粒发育整个过程中直链淀粉和支链淀粉占
总淀粉的比值一直较为稳定, 说明二者的合成是同
步的 , 这与程方民等 [19]和陈刚等 [33]的研究结果一
致。
318 作 物 学 报 第 36卷

SBE基因主要包括 SBE1、SBE3和 SBE4几个类
型, 它与作物籽粒中支链淀粉的合成密切相关, 其
中 SBE1、SBE3起主导作用, 分别调控约 70%和 30%
的支链淀粉合成[34-35]。水稻中 SBE3基因缺失表现为
直链淀粉扩增(amylose extender), 即直链淀粉含量
增加, 支链淀粉含量明显降低[36-37]。吴方喜等[38]利
用农杆菌介导法将水稻 SBEI正、反义基因分别导入
籼稻恢复系明恢 81中, 结果表明, 转 SBEI正义基因
的直链淀粉含量明显下降, 转 SBEI反义基因的直链
淀粉含量明显上升。张鹏[39]利用根癌农杆菌介导的
转基因技术将 SBE1、SBE3的反义或 RNA干扰结构
分别导入具有不同直链淀粉含量的水稻受体品种中,
结果显示转反义 SBE1/SBE3 和 SBE3-RNAi 种子直
链淀粉含量较对照都有明显的提高, 且不同品种间
差异显著。这充分说明 SBE基因对于淀粉的合成有
着重要的调控作用。本研究的结果也显示 RNA干扰
SBE3基因可导致直链淀粉含量极显著提高, 且不同
株系间具有差异。但陈忠正等[40]利用 RNA干扰技术
在农杆菌介导下, 对粳稻中花 11 进行转化, 却只引
起转基因水稻胚乳中直链淀粉含量少量的提高。这
可能与 SBE3基因 RNA干扰区段的选择、外源片段
随机整合的“位置效应”等有关。这一研究结果提示,
后续的研究应尝试选择 SBE 基因的不同区段, 构建
同时沉默 SBE1、SBE3 的 RNA 干扰复合表达载体,
并导入不同优良水稻品种, 以期获得目标性状更为
优良的转基因水稻品系。
本研究还发现转基因水稻籽粒的千粒重显著下
降 , 且大致的趋势是直链淀粉含量提高幅度越大 ,
千粒重下降越明显, 这与原初的设想不一致。张鹏[39]
的研究结果也显示 RNA干扰 SBE1、SBE3的转基因
水稻种子中糙米的粒重变小。从对水稻各淀粉合成
关键酶活性的影响可以看出, RNA干扰 SBE3基因在
显著地降低其自身酶活性的同时也导致其他籽粒淀
粉合成关键酶活性不同程度地下降。这可能是 RNA
干扰的转基因水稻千粒重下降的一个重要原因。此
结果提示采用 RNA 干扰技术对水稻进行遗传改良
时要注重不同基因间的相互作用。考虑到 RNA干扰
SBE3 基因对 SSS 和 ADPG-PPase 的活性影响最大,
因此可设想在 RNA 干扰 SBE3 基因的同时, 过量表
达这些相关基因, 以期在保持千粒重不变或提高的
前提下使直链淀粉含量得到提高。为了达到这一目
标, 本课题组已构建了这些复合表达载体, 转化工
作正在进行之中。
4 结论
RNA 干扰抑制水稻 SBE3 基因的表达, 并显著
降低其活性, 同时导致其他籽粒淀粉合成相关酶活
性除 GBSS 以外不同程度地显著下降, 尤以 SSS 和
ADPG-PPase 降幅最大, 说明基因在淀粉合成中彼
此相互影响。此外, SBE3活性的下降也导致转基因
株系直链淀粉含量显著提高及千粒重显著下降, 且
不同转基因株系间有差异, 直链淀粉含量上升幅度
越大的株系, 千粒重下降越明显。
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《作物学报》被国内外数据库和文摘收录情况
国外：
(1) 联合国粮农组织(FAO)AGRIS数据库
(2) 美国《生物学文摘》(Biological Abstract)
(3) 美国《剑桥科学文摘》(Cambridge Scientific Abstract)
(4) 美国《化学文摘》(Chemical Abstracts)
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(6) 波兰哥白尼索引(Index of Copurnicus)
(7) 日本科学技术文献数据库(JST’ Bibliographic Databases)
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国内:
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