全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(3): 424−432 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(31000122), 重庆市自然科学基金项目(CSTC2008BB1002), 中国博士后科学基金项目(20090460718)
和西南大学博士启动基金项目(SWUB2008010)资助。
第一作者联系方式: E-mail: nmniyu@126.com
Received(收稿日期): 2010-09-08; Accepted(接受日期): 2010-11-26.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.00424
甘蓝型油菜烯脂酰-CoA还原酶基因 BnECR的克隆及功能分析
倪 郁 张飞萃 王亚超 蒲 飞 王 瑞 柴友荣 李加纳
西南大学农学与生物科技学院, 重庆 400715
摘 要: 反式烯脂酰-CoA 还原酶(trans-2,3-enoyl-CoA reductase, ECR)是催化超长链脂肪酸(VLCFAs)合成的脂肪酰
-CoA延长酶之一。根据已报道拟南芥 ECR基因设计引物, 采用 RACE (rapid amplification of cDNA ends)方法从甘蓝
型油菜中克隆 ECR 的全长 cDNA 序列和对应的基因组序列, 命名为 BnECR (GenBank 登录号分别为 FJ899705 和
FJ899706)。序列分析结果显示, BnECR的全长 cDNA序列为 1 328 bp, 对应的基因组序列为 2 093 bp, 由 4个外显子
组成, 在 ORF的上、下游分别有一个 163 bp的 5′UTR和一个 232 bp的 3′UTR。根据编码区预测 BnECR前体蛋白为一个
310个氨基酸残基的多肽链, 包含 ECR蛋白的重要功能位点 K144、R145及一个 NAD(P)H结合基序 G225SGGYQIPR/HG234。
NCBI Blastn、氨基酸序列多重比对及保守域分析表明, 该基因与拟南芥 AtECR 基因的同源性最高, 是对应拟南芥
AtECR的垂直同源基因。RT-PCR分析表明, BnECR基因在甘蓝型油菜根、茎、叶、花及角果中均有表达, 其中在茎
中的表达量最高。BnECR在高芥酸材料种子发育中后期的表达量显著高于低芥酸种子, 表明 BnECR可能参与甘蓝型
油菜芥酸的合成。将 BnECR克隆到酿酒酵母的穿梭表达载体中, 分别转化野生型酵母 By4743和突变体菌株 YDL015c,
添加半乳糖诱导表达。气相色谱分析表明, BnECR 在酿酒酵母中有效表达, 转化菌株中的芥酸(C22:1)占总脂肪酸含
量的 1.34%, 比对照增加 52%; 对突变体的转化结果表明芥酸含量恢复到野生型水平。
关键词: 甘蓝型油菜; 烯脂酰 CoA还原酶; 克隆; 芥酸; 酿酒酵母
Cloning and Functional Analysis of Enoyl-CoA Reductase Gene BnECR from
Oilseed Rape (Brassica napus L.)
NI Yu, ZHANG Fei-Cui, WANG Ya-Chao, PU Fei, WANG Rui, CHAI You-Rong, and LI Jia-Na
College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715, China
Abstract: Very-long-chain fatty acids (VLCFAs) are critical components found in cuticular waxes, sphingolipids and triacylglyce-
rols in higher plants. Biosynthesis of VLCFAs is catalyzed by the fatty acyl-CoA elongase, a membrane-bound enzymatic com-
plex containing 3-ketoacyl-CoA synthase (KCS), 3-ketoacyl-CoA reductase (KCR), 3-hydroxacyl-CoA dehydratase (HCD), and
trans-2,3-enoyl-CoA reductase (ECR). In this research, primers were designed based on multiple alignments of trans-2,3-
enoyl-CoA reductase (ECR) gene sequences from Arabidopsis thaliana, and the full- length cDNA, here designated BnECR, and
the corresponding genomic sequences were isolated from Brassica napus by using rapid amplification of cDNA ends (RACE)
method (GenBank accession No. FJ899705 and No. FJ899705). The sequence of BnECR cDNA was 1 328 bp (excluding the poly
dA tail), and the corresponding genomic sequence was 2 093 bp. BnECR was composed of four exons and contained a 163 bp 5
untranslated region (5 UTR) and a 233 bp 3 UTR. The deduced BnECR protein was 310 amino acid in length, with a MW of
735.78 kD and a pI of 9.52. The critical functional sites K144 and R145 in AtECR were unchanged in BnECR. The
G225SGGYQIPR/HG234 which presented a non-classical NADPH-binding motif was found in C-terminal of BnECR. NCBI Blastn,
multiple alignments and conserved domain search showed that BnECR had the highest homology to A. thaliana AtECR. RT-PCR
analysis showed that BnECR was ubiquitously expressed in B. napus and preferentially expressed in stem. The transcript level of
BnECR at middle and late stages of seed development in low erucic acid rapeseed cultivar was obviously lower than that in high
erucic acid rapeseed cultivar, suggesting that BnECR was involved in biosynthesis of erucic acid. The 933 bp BnECR ORF was
第 3期 倪 郁等: 甘蓝型油菜烯脂酰-CoA还原酶基因 BnECR的克隆及功能分析 425


subcloned into the yeast-E. coli shuttle vector pYES2.0. And then the recombinant plasmid was transformed into Saccharomyces
cerevisiae wild type strain By4743 and mutant strain YDL015c, respectively. With galactose as inducer, the transformant was
cultured to induce the expression of BnECR. The GC result indicated that BnECR was overexpressed effectively in S. cerevisiae,
and the content of erucic acid reached to 1.34% of the total fatty acid in the recombinant strain, an increase of 52% over the con-
trol. Functional complementation of BnECR in a ECR-deficient mutant yeast demonstrated that with BnECR mediated the biosyn-
thesis of VLCFAs. Our results suggest that BnECR should be functional orthologue of AtECR.
Keywords: Brassica napus L; Enoyl-CoA reductase; Cloning; Erucic acid; Saccharomyces cerevisiae
超长链脂肪酸 (very long chain fatty acid,
VLCFAs)是指碳链长度为 20碳或更长的脂肪酸。常
见的有花生酸(C20:0)及其饱和同系物、芥酸(C22:1)
及其衍生物山嵛酸、蜡质(前体)等。这类脂肪酸参
与生物膜膜脂、鞘脂、木栓质及角质层蜡质的合成,
在植物体中具有广泛的生理功能[1-3]。植物 VLCFA
的合成是在内质网上脂肪酰-CoA 延长酶的作用下
进行的。脂肪酰-CoA延长酶属于膜结合的多酶复合
体, 包括 β-酮脂酰-CoA 合酶(3-ketoacyl-CoA syn-
thase, KCS)、β-酮脂酰-CoA还原酶(3-ketoacyl-CoA
reductase, KCR)、β-羟脂酰 -CoA 脱水酶 (3-hydro-
xacyl-CoA dehydratase, HCD)和反式烯脂酰-CoA 还
原酶 (trans-2,3-enoyl-CoA reductase, ECR), 分别催
化缩合、还原、脱水和再还原 4步反应[4-5]。拟南芥
延长酶中这 4个酶基因已被陆续分离[6-9]。催化最后
一步延长反应的 ECR被认为是所有微粒体脂肪酸延
长酶所共有的, 没有底物特异性[10]。Kohlwein等[11]从
一个温度敏感、缺乏鞘脂合成的酵母突变体 tsc13
中分离了编码 ECR的基因 TSC13, 并指出 TSC13蛋
白主要分布于内质网核泡分界处。拟南芥 AtECR 功
能互补于酵母突变体 tsc13, 编码的ECR蛋白为脂肪
酸延长酶活性所必需, 在拟南芥植株中普遍表达[9];
其 T-DNA 插入突变体导致鞘脂、角质层蜡与种子
VLCFA 合成受阻, 抑制细胞扩增, 植株变形[12]。烟
草 NbECR基因沉默导致烟草膜结构紊乱、皮层细胞
消融[13]。棉纤维发育中 GhECR基因参与了 VLCFA
的合成[14]。
芥酸是十字花科植物种子中特异积累的长链脂
肪酸, 改良芥酸的含量是油菜品质育种的重要目标
之一, 菜油中芥酸含量的水平直接影响菜籽油的食
用营养价值和工业应用价值[15]。因此, 对以芥酸为
代表的长链脂肪酸的研究具有重要的理论和现实意
义。对油菜脂肪酰-CoA延长酶的研究, 主要集中于
KCS 的研究。油菜中编码 KCS 的同工酶基因
Bn-FAE1.1 和 Bn-FAE1.2 特异性催化发育种子中芥
酸等的合成。但 Bn-FAE1.1 起主要作用, 并主要存
在于高芥酸品种油菜中 [16]。编码 KCR 的基因
Bn-KCR1和 Bn-KCR2近期也从高芥酸品种油菜中被
分离, 二者在高芥酸与低芥酸品种的发育种子中表
达差异显著[17]。甘蓝型油菜中编码 HCD和 ECR的
基因还未见报道。本研究从甘蓝型油菜中分离克隆
了编码反式烯脂酰-CoA 还原酶的 BnECR 基因, 并
对该基因的功能进行分析, 研究结果有助于进一步
理解油菜 VLCFA合成、代谢机制, 为充分利用改造
脂肪酰-CoA延长酶基因来调控油菜 VLCFA合成奠
定基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料和菌种
选用甘蓝型油菜 5B、高芥酸油菜 83501R(芥酸
含量 50%)和低芥酸油菜 2821R (芥酸含量为 0%),
种子由重庆市油菜工程技术研究中心(西南大学油
菜技术研究中心)提供, 于田间常规种植。分别采集
5B材料的根、茎、叶、花、角果及高、低芥酸材料
的开花后 10、25、40和 55 d的种子, 立即放入液氮
并于–80℃冰箱保存, 直到抽提 DNA与 RNA。大肠
杆菌(Escherichia coli) DH5α由重庆市作物品质改良
重点实验室保存。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
野生型菌株 BY4743 和突变体 YDL015c (BY4743,
Mata, his3Δ1, leu2Δ0, lys2Δ0, ura3Δ0, YDL015c::
KanMX4/YDL015C)购自德国 EUROSCARF Library。
1.2 实验试剂与培养基
T4 DNA连接酶, 限制酶 Sac I和 Xba I购自宝
生物工程有限公司; 胶回收试剂盒、质粒抽提试剂
盒和 DNA Marker 均购自 Transgen 公司, TRNzol
RNA 提取试剂盒、T-vector 试剂盒和反转录试剂盒
购自大连 TaKaRa 公司; 表达载体 pYES2.0 购自
Invitrogen公司。引物合成和序列测定均由上海英骏
生物技术有限公司完成。其他常规试剂均为国产分
析纯。酵母营养缺陷型 SC-Ura培养基和诱导表达培
养基的配制按 Invitrogen公司操作说明进行。
1.3 DNA与总 RNA的提取
基因组 DNA采用 CTAB法提取。总 RNA采用
TRNzol RNA提取试剂盒(TaKaRa)提取。
426 作 物 学 报 第 37卷

1.4 BnECR 3末端与 5末端的扩增
参照 Invitrogen生物技术公司的 GeneRacer Kit
操作说明, 从甘蓝型油菜 5B 提取 RNA 反转录合成
cDNA作为 PCR模板。根据已报道的拟南芥反式烯
脂酰-CoA还原酶基因 AtECR(NM_115394)序列设计
基因特异引物。使用 GeneRacer 3′端引物 3′-P 和正
向特异引物 FECR3-1 进行 3′-RACE 一扩。使用
GeneRacer 3′端巢式引物 3′-NP 和正向特异引物
FECR3-2进行 3′-RACE巢式扩增。使用 GeneRacer 5′
端引物 5′-P和反向特异引物 RECR5-1进行 5′-RACE
一扩, 5′-NP与反向巢式引物 RECR5-2进行 5′-RACE
巢式扩增(引物序列见表 1)。PCR扩增程序为 94℃ 2
min, 然后 94℃ 30 s, 53℃ 30 s, 72℃ 1.5 min, 30个
循环。对扩增产物进行筛选、鉴定和测序。
1.5 BnECR 全长 cDNA 及对应的基因组序列的
分离
根据测序结果, 设计引物 FECR和 RECR(表 1),
以甘蓝型油菜基因组和总 cDNA 分别为模板进行
BnECR全长序列的扩增。PCR程序为: 94℃预变性
2~4 min; 94℃ 1 min, 58℃ 1 min, 72℃ 2 min, 共 30
个循环; 72℃ 10 min 结束反应。将扩增产物全部电
泳, 回收目的条带并进行亚克隆、测序。
1.6 RT-PCR分析
参照 Transgene 生物技术公司的操作说明, 分
别用甘蓝型油菜 5B的根、茎、叶、花、角果以及高、
低芥酸油菜花后 10、25、40和 55 d的种子提取 RNA
反转录合成 cDNA。基因特异引物 FECR和 RECR5-2
用于扩增 BnECR cDNA 5′端的 606 bp片段(表 1)。
同时设计合成内参基因引物 F26S和R26S来扩增相应
于 A. thaliana 26S rRNA基因的 534 bp基因片段[18]。
取 1.0 µL cDNA第一链产物做模板, 参照 50 µL标
准 PCR体系, 同时扩增目的基因与内参基因。扩增
程序为: 94℃预变性 2 min; 94℃变性 1 min, 58℃退
火 1 min, 72℃延伸 50 s, 共 27个循环; 72℃延伸 10
min。将扩增产物全部电泳, 在紫外灯下观察电泳结
果, 以凝胶成像系统拍照分析。
1.7 表达载体的构建与转化
设计引物 FECRO 和 RECRO(表 1)扩增甘蓝型

表 1 BnECR基因克隆与表达分析所用引物
Table 1 Sequences of primers for BnECR isolation and expression
引物
Primer
序列
Sequence (5′→3′)
用途
Application
3′-P GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG 3′-RACE第一轮扩增通用引物
Kit primer for 3′-RACE primary amplification
3′-NP CGCTACGTAACGGCATGACAGTG 3′-RACE巢扩通用引物
Kit primer for 3′-RACE nested amplification
FECR3-1 CCTTCAGATGAAGATTGGTTTCGGG 3′-RACE第一轮扩增特异引物
Gene-specific primer for 3′-RACE primary amplification
FECR3-2 TGGCTAGGATTCAACATCGCTACTCAGAC 3′-RACE巢扩特异引物
Gene-specific primer for 3′-RACE nested amplification
5′-P CGACTGGAGCACGAGGACACTGA 5′-RACE第一轮扩增通用引物
Kit primer for 5′-RACE primary amplification
5′-NP GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA 5′-RACE巢扩通用引物
Kit primer for 5′-RACE nested amplification
RECR5-1 CAAACCAAACCAAACCCGAAACC 5′-RACE第一轮扩增特异引物
Gene-specific primer for 5′-RACE primary amplification
RECR5-2 ATCCGTTTGAAGTAGTGAAAGCACCAGTAG 5′-RACE巢扩特异引物
Gene-specific primer for 5′-RACE nested amplification
FECR AGTTAGTTAGTTGTCCTACTCCCAACTACACAAC 目标基因全长序列扩增特异引物
Upstream gene-specific primer for amplifying full-length cDNA of
BnECR gene
RECR GGCAAAATGTTTTGAGTTTGACTTACCA 目标基因全长序列扩增特异引物
Downstream gene-specific primer for amplifying full-length cDNA of
BnECR gene
F26S CACAATGATAGGAAGAGCCGAC RT-PCR内参基因扩增引物
Upstream primer for amplifying 26S rRNA gene
R26S CAAGGGAACGGGCTTGGCAGAATC RT-PCR内参基因扩增引物
Downstream primer for amplifying 26S rRNA gene
FECRO AGAGCTCATGAAAGTCACCGTCGTCTCCCGC BnECR基因编码区扩增引物
Upstream primer for amplifying BnECR ORF
RECRO ATCTAGACTACAGGAATGGAGGTAAGATCACCC BnECR基因编码区扩增引物
Downstream primer for amplifying BnECR ORF

第 3期 倪 郁等: 甘蓝型油菜烯脂酰-CoA还原酶基因 BnECR的克隆及功能分析 427


油菜 ECR基因的编码区, 并且参考酿酒酵母表达载
体 pYES2.0 的多克隆位点, 分别在引物的 5′端引入
Sac I和 Xba I的酶切位点。PCR扩增体系除延伸时
间为 1 min外, 其余条件同上。分别用 Sac I和 Xba I
酶切 PCR产物和表达载体 pYES2.0, 回收之后连接,
并转化到大肠杆菌 DH5α 中 , 筛选转化子 , 经过
PCR和酶切检测, 得到重组质粒 pYBnECR。将空质
粒 pYES2.0 和重组质粒 pYBnECR 转化到营养缺陷
型酿酒酵母 BY4743和突变体菌株 YDL015c中, 在
SC-Ura培养基上筛选得到转化子, 分别作为对照菌种
和工程菌株 YBnECR。大肠杆菌感受态准备、转化方
法及酵母感受态制备和转化方法分别参见文献[19-20]。
1.8 BnECR的诱导表达
将对照菌株和工程菌株 YBnECR接种到 15 mL
SC-Ura 的液体培养基中, 每个处理接种 3 瓶, 在
30℃和 120 r min−1条件下振荡过夜培养, 将培养物
接种到含有 2%半乳糖的 100 mL SC-Ura培养基中,
30℃、120 r min−1条件下诱导培养 72 h, 使 OD600达
到 2, 收获菌体。
1.9 气相色谱(GC)分析
将收获的菌体用去离子水洗涤 3 次, 50℃烘干
10 h, 磨碎 , 乙醚 /石油醚 (1∶1)浸提过夜。加入
KOH/CH3OH (1∶1)溶液, 超声波振荡 20 min, 合成
脂肪酸甲酯, 备用待测。气相色谱分析中采用弹性
石英毛细管柱, 载气为 N2, 线速 10 cm s−1。分流比
100∶1, 气化温度 250℃, 柱温 180℃, 尾吹 50 mL
min−1, 采用氢火焰离子化检测器, 上样量 2 μL。重
复 3次测定。
1.10 生物信息学分析
利用 Vector NTI Advance v.9.0进行核苷酸及氨
基酸序列分析 , 在 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.
gov/)网站上进行 GenBank Blast和蛋白序列的 CDD
搜索 , 在 http://bip.weizmann.ac.il/和 http://www.
expasy.org/等网站提供链接的各生物信息学软件网
站上进行蛋白质结构分析。
2 结果与分析
2.1 BnECR基因的克隆与核苷酸序列分析
利用引物组合 FECR3-1/3′-P、FECR3-2/3′-NP
和 FECR5-1/5′-P、FECR5-2/5′-NP分别进行 3′cDNA
和 5′cDNA 末端的一扩与巢扩, 获得与预期大小相
符的电泳条带。测序结果与 GenBank中的序列进行
同源比对表明, 获得的 cDNA3′末端序列和 5′末端序
列与拟南芥 ECR基因 AtECR (NM_115394)同源性最
高。根据测序结果设计了一对扩增全长 cDNA 的引
物 FECR/RECR, 从甘蓝型油菜总 cDNA和 gDNA中
扩增得到了预期大小的片段。该基因的 cDNA 序列
全长为 1 328 bp (不包括 polyA尾), 对应的基因组序
列长度为 2 093 bp, 被命名为 BnECR (GenBank登录
号分别为 FJ899705和 FJ899706)。如图 1所示, 933 bp
长的 ORF被 3个内含子隔开 , 与已报道的拟南芥
AtECR 结构相同。在 ORF 上游有一个 163 bp 的
5′UTR, 在 ORF下游有一个 232 bp的 3′UTR, 随后
是 polyA 尾。NCBI Blastn 同源分析表明, BnECR
cDNA 序列与 AtECR 同源性最高, 为 86%; 其次是
与棉花 GhECR2 (EU001743), 同源性为 77%, 与
GhECR1 (EU001742)、烟草 NbECR (DQ000300)的同
源性为 74%。ORF 水平上 BnECR 与 AtECR 的同源
性达到 89%, 即使与酵母 ECR 基因 ScTSC1 3
(NC_001136)也有 46.5%的同源性。从核苷酸水平的
同源性分析来看, BnECR 是拟南芥 AtECR 的垂直
对应基因。

图 1 BnECR的基因结构图
Fig. 1 Schematic structure of BnECR
黑色框代表外显子; 黑色框之间的黑线代表内含子; UTR: 非翻译区。
The black boxes indicate the exons. The black lines between the black boxes indicate the introns. UTR: untranslated region.

2.2 预测 BnECR蛋白的分析
在 Vector NTI Suite 8.0上对 BnECR的 ORF进
行了翻译, 根据核苷酸预测的 BnECR 前体蛋白由
310 氨基酸组成 , 分子量为 35.78 kD, 等电点为
9.52。通过 NCBI Blasp 对 BnECR 蛋白进行分析表
明, 它与拟南芥 AtECR(NP_191096)最同源, 一致性/
相似性为 97.1%/98.7%、其次是与棉花 GhECR2
(ABV60089)为 85.0%/92.0%, 与 GhECR1(ABV60088)
为 82.6%/90.3%, 与烟草 NbECR(AAY17262)为
82.6%/90.6%。在 Vector NTI Suite 8.0上进行多重序
428 作 物 学 报 第 37卷

列比对(图 2)及系统学分析表明 (图 3), BnECR和
AtECR 最相似, 聚在一个亚组里。虽然 BnECR 与
GhECR、NbECR也有很高的同源性, 但在许多氨基
酸残基位点上 BnECR 更趋向于与 AtECR 同源。例
如图 2所示(加下画线表示)的 V13、L14、A16、P17、
D19、F33、A37、D57、K58、S64、S78、A88、L105、I106、
L119、I162、G163、D222、A269、L273、S284、I289、K296。
根据 NCBI 保守域 [21]预测结果, 在 BnECR 蛋白
(M1~L310)中存在烯脂酰-CoA 还原酶保守性结构域
(PLN02560, E-value: 6.08E-169)。图 2显示 BnECR
的所有高保守氨基酸残基都与 AtECR 以及其他植
物的ECR相同, 特别是ECR的重要功能位点在这个
蛋白中都没有变化。例如, 拟南芥 ECR蛋白的 K144、
R145[22]和酵母 ECR 蛋白的 Q81[11]。TMpred 预测
BnECR蛋白有 4个跨膜螺旋结构 , 分别位于 L95~
V115、V165~N184、I198~L216、Q260~G281[23]。而根据拟
南芥、酵母 ECR蛋白的拓扑学分析表明, ECR蛋白
含有 6 个跨膜结构域, 定位于内质网[22]。综合序列
比对结果分析, BnECR 蛋白可能在 G122~T159、K218~
A258 之间还含有两个跨膜结构域。脂肪酸合成和延长
反应中的两步还原反应需要利用 NAD(P)H[7,24-25]。棉
花 ECR 中鉴定出一个 NAD(P)H 结合基序 G(5X)

图 2 BnECR与其他物种的 ECR蛋白的氨基酸序列比对
Fig. 2 Deduced amino acid sequence of BnECR compared with sequences of related proteins
参加比对的物种有甘蓝型油菜 BnECR (GenBank登录号为 ACR56737)、拟南芥 AtECR(NP_191096)、棉花 GhECR1(ABV60088)、
GhECR2(ABV60089)、烟草 NbECR(AAY17262)和酵母 ScTSC13(NP_010269)。序列比对图中, 完全相同、基本相同与不相同的氨基酸
残基分别用黑色、灰色与白色背景表示; BnECR中趋向于与 AtECR同源的氨基酸残基用下画线表示。一致序列行中用*表示 ECR重
要功能位点, 下画线表示 NAD(P)H结合基序。
Amino acid sequence of BnECR (GenBank accession No. ACR56737) was aligned with orthologues AtECR from A. thaliana (NP_191096),
GhECR1 and GhECR2 from Gossypium hirsutum (ABV60088 and ABV60089), NbECR from Nicotiana benthamiana (AAY17262) and
ScTSC13 from Saccharomyces cerevisiae (NP_010269). Identical, conservative, and non-similar residues are denoted by black shading, grey
shading, and white background respectively. Residues in BnECR preferentially similar to AtECR are underlined. In the consensus line, the
critical functional sites are marked by the asterisks and the NADPH-binding region is underlined.

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图 3 BnECR与其他物种的 ECR蛋白的系统发生树
Fig. 3 Phylogenetic tree of BnECR protein and ECR proteins
from other species established by Bootstrap neighbor-joining
系统发生树括号中数字表示相对进化距离。
Calculated relative distance values are shown in parentheses
following molecule names.

IPXG (G225SGGYQIPR/HG234)[14], 而这个基序同样
也存在于 BnECR 中(图 2)。综上所述, 从核苷酸和
氨基酸 2 个水平的同源性及保守域分析来看, 获得
的 BnECR是对应于拟南芥 AtECR的垂直同源基因。
2.3 BnECR的表达分析
AtECR 参与拟南芥所有 VLCFAs 的合成[9]。为
了解 BnECR 的表达模式, 本研究采用甘蓝型油菜
5B 的根、茎、叶、花、角果的 RNA 样品进行半定
量 RT-PCR 分析。结果表明, BnECR 在所检测的组
织中普遍表达 , 但同时也存在组织器官特异性。
BnECR在茎中的表达量最高, 在叶、花中中等表达,
在根和角果中的表达量最低 (图 4)。同时也研究了
BnECR 在油菜高芥酸材料 83501R 和低芥酸材料
2821R种子不同发育阶段的表达。总体来讲, BnECR
在高芥酸材料中的表达丰度高于低芥酸材料(图 5)。
种子发育初期, BnECR 在高芥酸材料中的表达略高
于低芥酸材料, 在花后 40 d的种子中高芥酸材料表
达量达到最高。低芥酸材料种子中的表达随发育进
程逐渐减弱。这表明 BnECR参与了甘蓝型油菜芥酸
的合成。

图 4 BnECR的组织器官表达模式
Fig. 4 Expression pattern of BnECR in different rapeseed
organs
M: DL2000 DNA marker; Ro: 根; St: 茎; Le: 叶; Fl: 花; Si: 角
果(花后 30 d); 26S rRNA: 内参。
M: DL2000 DNA marker; Ro: roots; St: stems; Le: leaves; Fl:
flowers; Si: siliques of 30 days after flowering; Simultaneous de-
tection of 26S rRNA gene expression was used as internal control.

2.4 BnECR基因在酿酒酵母中的功能分析
利用带有酶切位点的引物 FECRO/RECRO以甘
蓝型油菜 cDNA为模板进行 PCR扩增, 经亚克隆、
测序验证后的阳性克隆, 抽提质粒。对质粒和表达
载体 pYES2.0分别进行 Sac I和 Xba I双酶切, 回收
目的条带和载体骨架, 连接后转化大肠杆菌 DH5α,
从含有 Amp 的 LB 平板上挑选转化子, 培养阳性克
隆子, 抽提质粒。经过 PCR 和酶切鉴定正确, 得到
构建成功的重组质粒 pYBnECR。将空载体 pYES2.0
和重组质粒 pYBnECR 转化到酿酒酵母野生型
BY4743和突变体 YDL015c中, 在 SC-Ura平板上筛
选到对照菌株和转化菌株 YBnECR, 以转化空载体
的受体菌为对照, 诱导表达外源基因。经过GC分析,
如图 6 所示, 对照菌株和工程菌株都显示了典型的
酵母脂肪酸组成, 并以 C16 和 C18 的饱和、不饱和
脂肪酸为主。在本试验条件下, 长于 18个碳的脂肪
酸只检测到芥酸(C22:1)。对 BY4743 的转化结果表
明 , 转化菌株中的芥酸 (C22:1)占总脂肪酸含量的
1.34%, 是对照的 1.52 倍, 差异显著(P<0.05)。说明
BnECR蛋白促进了芥酸的合成。YDL015c的转化结
果表明, 转化菌株中的芥酸(C22:1)占总脂肪酸含量
的 0.96%, 是对照的 4.17 倍 , 与对照差异显著
(P<0.05)。表明突变体恢复了芥酸的合成能力。酵母
超表达和酵母突变体的功能互补分析分别证明
BnECR蛋白能够介导芥酸的合成。

图 5 BnECR 在高、低芥酸材料不同发育阶段种子中的表达
Fig. 5 Expression of BnECR during high erucic acid rapeseed
cultivar and low erucic acid rapeseed cultivar seed development
M: DL2000 DNA marker; 10 d: 开花后 10 d种子; 25 d: 开花后
25 d种子; 40 d: 开花后 40 d种子; 55 d: 开花后 55 d种子;
83501R: 高芥酸材料; 2821R: 低芥酸材料; 26S rRNA: 内参。
M: DL2000 DNA marker; 10, 25, 40 and 55 d: seeds of 10, 25, 40,
and 55 d after flowering, respectively. 83501R: high erucic acid
rapeseed; 2821R: low erucic acid rapeseed. Simultaneous detec-
tion of 26S rRNA gene expression was used as internal control.

3 讨论
VLCFA参与种子甘油酯、生物膜膜脂及鞘脂的
合成 , 并为角质层蜡质的生物合成提供前体物质 ,
在植物体中具有广泛的生理功能 [1-3]。内质网中由
KCS、KCR、HCD、ECR组成的脂肪酸延长酶共同
负责催化 VLCFA 的合成, 其中 ECR 催化延长反应
的最后一步还原反应。植物中 ECR活性降低将会减
少 VLCFA 的合成, 细胞扩增受抑制, 植株变形乃
430 作 物 学 报 第 37卷


图 6 转基因酿酒酵母总脂肪酸气相色谱分析图
Fig. 6 Gas chromatographic analyses of fatty acid methyl esters prepared from transgenic yeast cells compared with cells containing
empty vector as the control
A和 B: 空载体 pYES2. 0和重组质粒 pYBnECR分别转化酿酒酵母野生型 BY4743; C和 D: 空载体 pYES2. 0和重组质粒 pYBnECR
分别转化酿酒酵母突变体 YDL015c。
A and B: S. cerevisiae wild type strain BY4743 yeast cells transformed with the empty vector pYES2.0 and the construct pYBnECR, respec-
tively; C and D: S. cerevisiae mutant strain YDL015c yeast cells transformed with the pYES2.0 and the construct pYBnECR, respectively.

至死亡 [12-13]。本研究从甘蓝型油菜中克隆了编码
ECR的基因 BnECR, 从核苷酸、氨基酸水平的同源
性及保守域分析来看, 获得的序列与拟南芥 AtECR
同源性最高 , 在核苷酸水平上达到 86%的同源性 ,
氨基酸水平上达到 97.1%/98.7%的一致性/相似性 ,
存在烯脂酰-CoA还原酶保守性结构域(PLN02560)。
根据拟南芥 ECR 蛋白拓朴学研究结果预测 BnECR
蛋白有 6 个跨膜结构域, 定位于内质网[22]。经过比
对发现, BnECR蛋白在 G225和 G234之间有一个植物
ECR 基因家族的 NAD(P)H 结合基序 G(5X)IPXG。
前人鉴定的 ECR酶活性的重要功能位点, 如 Q81(对
应 BnECR 的 Q89)[11]、K144R145等在 BnECR 中保守
存在 [22]。综合上述分析 , BnECR 是对应于拟南芥
AtECR的垂直同源基因。
拟南芥中编码 KCS 的基因可能有 21 个[26], 编
码 KCR、HCD、ECR 的基因各有 1 条[7-9]。油菜是
异源四倍体, 基因组大小大约是拟南芥基因组的 6
倍[27-28]。到目前为止, 油菜中编码 KCS 和 KCR 的
基因各有 2条, 分别为 Bn-FAE1.1、Bn-FAE1.2[16]和
Bn-KCR1、Bn-KCR2[17]。本研究中采用 RACE 方法
只分离克隆到 1条 BnECR基因, 具有转录活性和酶
催化活性, 可能是主要的ECR功能成员。由于RACE
方法对分离表达丰度低的基因有局限, 因此不排除
在甘蓝型油菜中还存在其他 BnECR基因成员。
与拟南芥 AtECR的表达模式一致, BnECR在甘
蓝型油菜组织器官中普遍表达, 这与前人研究结果
符合, 延长反应中的 KCS存在组织、器官特异性表
达和底物特异性, 而 KCR、HCD 与 ECR 被认为是
所有微粒体脂肪酸延长酶所共有的, 没有底物特异
性[10]。BnECR 同时存在组织器官特异性表达, 在茎
中表达最高, 在叶、花中中等表达(图 4)。这可能与
VLCFAs 不同程度地参与这些器官的生物膜脂、角
质层蜡质的合成有关。在种子发育中后期, 高芥酸
材料的 BnECR 表达量高于低芥酸材料(图 5), 表明
BnECR参与种子中芥酸的合成。
Rossak 等[29]认为 FAE1 编码的 KCS 是长链脂
肪酸合成的限速酶。拟南芥的 FAE1发生突变, 种子
中长链脂肪酸含量大幅度降低, 推测 FAE1 是芥酸
生物合成的关键基因[30-31]。油菜中 Bn-FAE1.1 起主
要催化芥酸合成的作用[16]。油菜 BnKCR2转化酵母
功能互补分析表明, VLCFA 含量增加为野生型的 2
倍[17]。本研究中, BnECR基因导入酿酒酵母超表达,
芥酸含量增加为对照的 1.52 倍; 转化突变体基本恢
复为野生型水平, 表明 BnECR是具有催化芥酸合成
的功能基因。这些数据为油菜中超表达 BnKCR、
BnECR增加 VLCFA含量提供了证据支持。
随着人们对植物 VLCFA 代谢研究的深入, 基
因工程为其生物合成调控开辟了广阔前景。目前的
转化研究主要是单基因导入, 伴随着油菜脂肪酸延
长酶基因的陆续分离, 油菜 VLCFA 合成代谢的信
息得到进一步补充。这也为通过遗传转化、导入多
个延长酶基因调控油菜 VLCFA合成提供了途径。
第 3期 倪 郁等: 甘蓝型油菜烯脂酰-CoA还原酶基因 BnECR的克隆及功能分析 431


4 结论
从甘蓝型油菜中分离克隆了反式烯脂酰-CoA
还原酶基因 BnECR, 同源比对及相关生物信息学分
析表明 BnECR 是对应于拟南芥 AtECR 的垂直同源
基因; 其表达具有普遍性和器官特异性, 种子发育
中后期 , mRNA 在高芥酸种子中的表达显著增强 ,
暗示 BnECR参与了油菜种子芥酸的合成; 转基因酵
母超表达和功能互补分析表明 BnECR 蛋白具有催
化芥酸合成的功能。
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