全 文 ：Vol. 31 , No. 1
pp. 1 - 6 　Jan. , 2005
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 31 卷 第 1 期
2005 年 1 月 　1～6 页
内源细胞分裂素调控油菜叶片衰老进程的研究
张治礼1 ,2 　郑学勤2 　吕应堂1
(1 武汉大学发育生物学教育部重点实验室 , 湖北武汉 430072 ; 2 中国热带农业科学院热带生物技术研究所热带作物生物技术国家重点实验
室 , 海南海口 571101)
摘 　要 :利用根癌农杆菌 ( Agrobacterium tumefaciens)介导法将嵌合基因 PSAG122ipt 导入双低油菜 ( Brassica napus) 品种 H165 ,
经双重 PCR 检测和基因组总 DNA Southern杂交证实 ,共获得 11 株转基因植株。生长观察结果显示 ,11 株转基因植株生
长发育正常 ,除 2 株与对照没有明显的差异外 ,其余 9 株叶片衰老时间明显延迟 ,主茎有柄叶衰老延迟 15～20 d ,无柄薹
叶延迟 20～30 d ,长势较旺。对其中的 2 株 (Line 5 和 Line 7)进行衰老生理指标测定的结果表明 ,转基因植株主茎基本定
型叶上部叶片 ,叶绿素含量、细胞分裂素含量、SOD 活性和 MDA 积累量与对照基本一致 ,转基因植株Line 5 和Line 7 基本
定型叶下部第 5 片叶叶绿素含量、细胞分裂素含量和 SOD 酶活性约为对照的 2～4 倍、3～5 倍和 3 倍 ,MDA 积累量仅为对
照的 40 %和 70 %。
关键词 :油菜 ( Brassica napus) ; PSAG122ipt 嵌合基因 ;叶片衰老 ;生理指标
中图分类号 : S565
Delaying Leaf Senescence by Regulating Cytokinin Biosynthesis in Brassica napus
ZHANG Zhi2Li1 ,2 , ZHENG Xue2Qin2 , LU¨ Ying2Tang1
(1 Key Laboratory of Ministry of Education for Developmental Biology , Wuhan University , Wuhan 430072 , Hubei ; 2 State Key Laboratory of Tropical Crop Biotechn2
ology , Institute of Tropical Biotechnology , Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences , Haikou 571101 , Hainan , China)
Abstract :Leaf is the most important photosynthetic organ in rape and greatly contributes to the yield of seeds1 So , the yield
of seeds in rape is seriously influenced by the process of leaf senescence , which can be delayed by increasing endogenous
or exogenous CTKs1 By regulating CTKs biosynthesis , it is possible to get the leaf2senescence2delayed rape cultivar with
higher yield of seeds1 In this paper , some results were reported about rape transformation , and some developmental and
physiological characteristics of the PSAG122ipt transgenic rapes1 The chimeric gene PSAG122ipt was integrated into rape ge2
nome mediated by Agrobacterium tumefaciens EHA105 and 11 transgenic plants were successfully screened by double PCR
and Southern blotting1 The growth of these transgenic plants was observed in a systematic way1 The results showed that the
transgenic plants grew normally with more vigor than the controls and no morphological variation , the senescence delayed
15 - 20 days for leaves with petiole in the main stem and 20 - 30 days for those without petiole1 In different leaf2positions
of 2 transgenic plants(Line 5 and Line 7) , the contents of chlorophyll ,cytokinins( ZRs and iPA) ,MDA and SOD activity
were examined , which are the important physiological indexes about leaf senescence1 The results showed that the contents
of chlorophyll , cytokinins (ZRs and iPA) and SOD activity were obviously higher in the leaves below newly full2extended
leaf than in the controls , while those in the extending leaves were identical to those in the controls1 Whereas , the produc2
tion of MDA was markedly inhibited1 In the fifth leaf below newly full2extended leaf (Line 5 and Line 7) , the contents of
chlorophyll ,cytokinins (ZRs and iPA) ,and SOD activity were about 2 - 4 , 3 - 5 and 3 times of those in the controls re2
spectively , while MDA production was only about 40 % and 70 % of the controls1 These data prove that the ipt gene in the
PSAG122ipt transgenic rapes can be controlled to express only in the senescent leaves and the leaf senescence can be physio2
logically delayed1
Key words : Brassica napus ; PSAG122ipt ; Leaf senescence ; Physiological index
基金项目 : 热带作物生物技术国家重点实验室开放基金资助。
作者简介 : 张治礼 (1970 - ) ,男 ,中国热带农业科学院副研究员 ,博士 ,主要从事植物发育分子生物学和植物基因工程育种研究 ,现为
武汉大学博士后研究人员。E2mail : zzl
-
catas @hotmail1com
Received(收稿日期) :2003212211 ,Accepted(接受日期) : 20042052201

　　大量的研究表明 ,外施细胞分裂素和提高内源
细胞分裂素含量均可延缓多数植物叶片的衰老、提
高植株抗逆性和种子产量[1～4 ] 。但由于外施细胞分
裂素不易大田操作、成本较高等原因 ,在实际应用中
受到较大限制。近年来 ,利用基因工程技术通过调
控内源细胞分裂素含量调控叶片衰老进程已经成为
此类研究的热点。国外学者 Smart ( 1991 ) 、Gan
(1995 ) 、Faiss ( 1997 ) 、Mckenzie ( 1998 ) 、Naomi Ori
(1999) 、McCabe (2001) 和我国学者付永彩 (1999) 、袁
政 (2002)等都分别进行了尝试并获得了一些延缓叶
片衰老的转基因株系[5～12 ] 。
目前油菜是我国种植面积最大和产量最高的油
料作物之一。油菜的花序属于无限花序 ,每株一生
可以形成数百至千朵花蕾 ,但结角率却很低 ,蕾角脱
落数约占 20 %～40 % ,不实角果 (阴角) 可达 10 %～
20 %。一般认为 ,油菜盛花期根系活力下降 ,植株
中、下部叶片衰老脱落 ,病虫危害 ,干旱、涝害等逆境
导致叶片早衰造成养分供应不足是蕾角脱落、阴角
形成的主要原因。利用基因工程技术 ,通过调控内
源细胞分裂素含量调控油菜叶片衰老进程 ,适当延
缓叶片自然衰老 ,减轻各种逆境造成的叶片早衰现
象 ,延长功能叶片有效光合作用时间 ,有可能减少油
菜蕾角脱落数和不实角果数 ,提高结角率和油菜种
子产量。
本研究报告了将具有细胞分裂素生物合成自动
调节功能且具有衰老特异表达特性的 PSAG122ipt 嵌合
基因导入双低油菜 ( Brassica napus) 品种 H165 ,获得
了叶片衰老延迟的转基因油菜株系。同时 ,对叶片
叶绿素含量、细胞分裂素含量、SOD 活性和 MDA 积
累量等生理指标进行了测定。
1 　材料和方法
111 　材料
11111 　植物材料　　双低油菜 H165 种子由中国科
学院遗传与发育生物学研究所陈正华提供。
11112 　菌种和质粒 　　农杆菌 EHA105 由本室保
存 ,质粒 pAGT(含有 PSAG122ipt 嵌合基因的植物表达
载体)由作者构建[13 ] 。
11113 　主要生化试剂 　　卡那霉素 ( kanamycin ,
Kan) 、链霉素 ( streptomycin , Str) 、利福平 ( rifamycin ,
Rif)均为 Sigma 公司产品 ;限制性内切酶 BamH Ⅰ、
Sac Ⅰ等分子生物学试剂均为 Progmega 公司产品 ;
DIG标记和检测试剂盒 (Cat1No1745832) 等购自德国
Boehringer Mannheim 公司 ;iPA、ZRs 酶联免疫吸附测
定试剂盒由南京农业大学提供 ;其他生化试剂和常
规试剂均为国产超纯或分析纯。
11114 　培养基 　　YEP、LB 培养基 ,油菜组织培养
采用 MS基本培养基。
112 　方法
11211 　植物表达载体 pAGT导入农杆菌 EHA105 　
　参照王关林等[14 ] 提供的直接导入法将植物表达
载体 pAGT导入根癌农杆菌 EHA105 ,双重 PCR 检测
(检测 ipt 和 PSAG12 DNA 片段) 。
11212 　油菜的组织培养和遗传转化 　　以带柄子
叶和下胚轴段为外植体 ,参照文献 [15～17 ]的方法
稍作修改。
11213 　转化植株双重 PCR 检测和基因组总 DNA
Southern 杂交 　　根据 PSAG122ipt 嵌合基因序列 ,设计
了 PSAG12 和 ipt 基因 DNA 片段 PCR 扩增特异引物。
以抗性油菜植株基因组总 DNA 为模板 ,分别进行
PCR 特异扩增反应 ,反应条件为 94 ℃预变性 4 min ,
然后进入 94 ℃变性 30 s →65 ℃退火 30 s →72 ℃延伸
( PSAG12 ,2 min 30 s ; ipt 基因 ,1 min 30 s) ,30 个循环后
72 ℃继续延伸 10 min ,4 ℃保存。1 %琼脂糖凝胶电
泳观察扩增结果。
提取经 PCR 检测为双阳性的油菜植株基因组
总 DNA ,经 BamH ⅠΠSac Ⅰ双酶完全消化后 ,以地高
辛标记的 ipt 基因 DNA 片段为探针进行 Southern 杂
交。整个过程参照王关林等[14 ]的方法。
11214 　生理指标测定 　　选取长势一致的 2 株转
基因植株和 1 株对照植株分别进行取样 (主茎叶) 。
样品 1 ,基本定型叶片上部第 3 片叶 ;样品 2 ,基本定
型叶上部第 1 片叶 ;样品 3 ,基本定型叶片 ;样品 4、
样品 5 和样品 6 分别是基本定型叶下部第 1 片叶、
第 2 片叶和第 5 片叶。取样后立即用液氮速冻 ,移
入 - 70 ℃冰箱保存备用。每个样品重复测 3 次 ,取
平均值。
叶绿素含量、SOD 活性和 MDA 积累量的测定参
照汤章诚主编的《现代植物生理学实验指南》中提供
的方法[18 ] 。
细胞分裂素含量测定参照南京农业大学提供的
iPA、ZRs 酶联免疫吸附测定试剂盒说明书。
2 　结果与分析
211 　油菜的遗传转化
　　经含 25 mgΠL 卡那霉素的抗性培养基诱导下胚
2 　　　　作 　　物 　　学 　　报 第 31 卷 　

轴段产生愈伤组织、分化成苗和诱导子叶柄基部直
接出芽 ,部分小苗呈紫红色、红白相间或绿白相间 ,
另有部分白化苗 ,绿苗仅占小苗的 40 %左右。用 25
mgΠL 卡那霉素抗性培养基继代培养小苗时 ,也有部
分绿苗转变为绿白相间或紫红色 ,大部分非绿色苗
在继代培养 2 次后 ,都慢慢停止生长甚至死亡。用
25 mgΠL 卡那霉素抗性生根培养基筛选时 ,也有部分
绿苗渐渐变成绿白相间苗或紫色苗 ,最后死亡 ,但数
量较少。有少量绿苗根发生较慢且生长缓慢 ,最终
慢慢黄化。筛选结果见表 1。
表 1 油菜 H165 遗传转化结果
Table 1 Results of transformation of Brassica napus H165
油菜品种
Cultivar of
Brassica napus
农杆菌
A1 tumefaciens 外植体Number of explants 出愈数Number of
callus
分化绿苗数
Number of green
seedlings
存活绿苗数
Number of normal
seedlings
生根绿苗数
Number of plants
with normal roots
H165 EHA105 3 920(cotyledon stems) - 11 6 4
H165 EHA105 4 140(hypocotyls) 817 32 21 18
　　以带柄子叶为外植体进行遗传转化时 ,最终生
根绿苗率不足 011 % ,以下胚轴段为外植体进行遗
传转化时 ,最终生根绿苗率不足 015 % ,转化率较
低。
212 　转基因植株的鉴定
以抗性植株的基因组DNA 为模板 ,利用 PCR 技
术在较高温度的退火条件下 (65 ℃) ,对发育正常的
22 株抗性油菜小苗进行了 PSAG12 和 ipt 基因 DNA 片
段的双重 PCR 检测 ,结果共有 11 株呈双阳性反应。
部分 PCR 检测结果见图 1。
提取经 PCR 检测为双阳性油菜植株的基因组
总 DNA ,经 BamH ⅠΠSac Ⅰ双酶完全消化后 ,以地高
辛标记的 ipt 基因 DNA 片段为探针进行 Southern 杂
交。根据植物表达载体图谱[13 ] ,利用 BamH ⅠΠSac
Ⅰ双酶消化可以切下 720 bp 的 ipt 基因 DNA 片段。
杂交带位置应与 ipt 基因 DNA 片段位置一致。基因
组总 DNA Southern 杂交结果显示 ,经双重 PCR 检测
的双阳性植株都显示出较强的阳性杂交信号。部分
杂交结果见图版 Ⅰ。
图 1 转基因植株部分 PCR检测结果( ipt 基因 :720 bp 和 PSAG12 DNA片段 :2 130 bp)
Fig11 PCR analysis of transgenic rapes ( ipt gene : 720 bp; PSAG12 : 2 130 bp) ( partly)
M: Gene rulerTM 1 kb ladder marker (右) , DNA marker DL 2000(左) ;
CK+ :质粒 pAGT;CK- :非转基因植株 ;1～9 : Kan 抗性植株。
M: Gene rulerTM 1 kb ladder marker (right) , DNA marker DL 2000(left) ;
CK+ :Plasmid pAGT;CK- :Non2transgenic plant ;1 - 9 : Kan2tolerance plants1
213 　转基因植株的抗衰老特性观察
为便于观察 ,基因组总 DNA Southern 杂交呈阳
性的 11 株转基因植株分别编号为 Line 1～11 ;4 株
对照为 CK 1～4。
移栽时 ,11 株转基因植株和 4 株对照植株均带
有 3～4 片绿叶。移栽后 10 d ,新叶开始产生 ;移栽
35 d 左右 ,移栽后发生的新叶渐渐长大并完全展开 ,
此时所有植株均无黄化叶片 (包括边缘黄化) 。移栽
50 d 后 ,Line 1、Line 8 和 4 株对照植株移栽前形成的
小叶均完全黄化并渐渐枯死 ,其余植株尚有 1～2 片
绿色小叶。移栽后 60 d ,全部植株均开始进入生殖
生长阶段 ,Line 1、Line 8 和对照植株移栽后发生的
第 1、2 片叶开始黄化衰老 ,Line 8 有一干枯叶片 ,但
其余植株仍分别有 1～2 片移栽前形成的小叶呈绿
色 ,移栽后发生的叶片全都呈深绿色 ,较对照深绿 ,
无黄化叶片。移栽后 100 d ,Line 2～7 和 Line 9～11
植株移栽前产生的小叶全部黄化干枯 ,移栽后发生
的第 1 片和第 2 片叶也开始黄化 ,此时Line 1、Line 8
3　第 1 期 张治礼等 :内源细胞分裂素调控油菜叶片衰老进程的研究 　　　

和 4 株对照植株已出现 3～5 片黄化叶片 (移栽后生
成的叶片) ,有些已经干枯 ,所有植株都进入盛花期。
移栽后 115 d ,Line 1、Line 8 和对照植株主茎有柄叶
开始全面黄化 ,上部无柄薹叶仍保持深绿色 ,其余植
株主茎仅有少量叶片黄化 ;移栽后 170 d ,Line 1、Line
8 和 4 株对照植株已全部死亡 ,其余植株主茎叶片
开始大范围黄化 ,植株上部的无柄薹叶保持深绿 ,无
限花序仍继续开花 ,但花较小 ;移栽后 200 d 左右 ,
Line 2～7 和Line 9～11 植株上部无柄薹叶也渐次失
绿、死亡。
上述观察结果表明 ,11 株转基因油菜植株和 4
株对照植株在温室大棚中均能完成生长发育的全过
程且发育正常。观察发现 ,营养生长进入生殖生长
即植株开花后 ,叶片衰老进程明显加快。11 株转基
因植株中 ,Line 1、Line 8 和 4 株对照植株的衰老进程
基本一致 ,但Line 2～7 和 Line 9～11 等植株衰老进
程减慢 ,叶片衰老延缓。Line 2～7 和 Line 9～11 植
株主茎有柄叶衰老进程延迟 15～20 d ,上部无柄薹
叶衰老延迟 20～30 d。
214 　转基因植株 Line 5 和 Line 7 叶片叶绿素含量
变化
　　对叶片衰老延迟的转基因植株 Line 5 和 Line 7
进行了生理检测。叶绿素含量的变化见图 2。Line
5 和Line 7 基本定型叶及其上部叶片叶绿素含量与
对照基本一致 ,但基本定型叶下部第 3 片叶约比对
照提高了近2Π3 ,第 5 片叶约为对照的 2～4 倍。
图 2 转基因植株 Line 5 和 Line 7 不同叶位
叶片叶绿素含量的变化
Fig12 The contents of chlorophyll in
different leaf2positions of transgenic
plant Line 5 and Line 7
215 　转基因植株 Line 5 和 Line 7 叶片细胞分裂素
含量的变化
　　如图 3 所示 ,转基因植株 Line 5 和 Line 7 基本
定型叶细胞分裂素含量略高于叶片基本定型前 ,但
与对照植株没有明显差异 ;叶片基本定型后 ,转基因
植株叶片细胞分裂素含量仍维持在较高水平 ,但对
照植株却表现出明显的下降趋势。Line 5 和 Line 7
植株基本定型叶下部第 3 片叶细胞分裂素含量约为
对照的 113 倍和 114 倍 ,基本定型叶下部第 5 片叶
细胞分裂素含量分别为对照的 317 倍和 415 倍。
图 3 转基因植株 Line 5 和 Line 7 不同
叶位叶片细胞分裂素含量的变化
Fig13 The contents of cytokinins( iPA
and ZRs) in different leaf2positions of
transgenic plant Line 5 and Line 7
图 4 转基因植株 Line 5 和 Line 7 不同叶
位叶片 SOD 活性的变化
Fig14 SOD activity in different
leaf2positions of transgenic
plant Line 5 and Line 7
216 　转基因植株 Line 5 和 Line 7 叶片 SOD 活性、
MDA含量的变化
　　油菜叶片自然衰老过程中 ,SOD 活性表现为明
显的下降趋势 ,但转基因植株 Line 5 和 Line 7 叶片
基本定型后 ,SOD 酶活性下降幅度明显低于对照 ,基
本定型叶下部第 5 片叶约为对照的 3 倍 (图 4) 。
4 　　　　作 　　物 　　学 　　报 第 31 卷 　

MDA 积累趋势虽与对照一致 ,呈上升趋势 ,但
上升幅度明显趋缓。与对照相比 ,转基因植株 Line
5 和Line 7 基本定型叶及其上部叶中的MDA 含量与
对照基本持平 ,但基本定型叶下部第 5 片叶仅为对
照的 40 %和 70 %(图 5) 。
图 5 转基因植株 Line 5 和 Line 7 不同叶位
叶片 MDA含量的变化
Fig15 The contents of MDA in different
leaf2positions of transgenic
plant Line 5 and Line 7
3 　讨论
甘蓝型油菜细胞对卡那霉素十分敏感 ,以往的
实验[5～17 ]和本研究都表明 (数据没有列出) ,5 mgΠL
低浓度的卡那霉素即可严重抑制子叶柄外植体细胞
增殖和不定芽分化 ,少数下胚轴段虽能分化出少量
的愈伤组织 ,但大都呈浅褐色不能进一步分化产生
不定芽。本实验选择 25 mgΠL 浓度卡那霉素对油菜
子叶柄和下胚轴段的细胞分裂、分化及小苗培养进
行抗性筛选。统计结果表明 ,利用子叶柄为外植体
进行遗传转化的最终绿苗生根率不足 011 % ,利用
下胚轴段作为外植体的最终绿苗生根率也不足
015 %。植物遗传转化效率涉及到多种因素 ,如植物
种类、基因型、外植体、组培条件、所用工程农杆菌对
外植体的侵染力、筛选的效果和敏感性等。本文中
的遗传转化主要参考了沙优宝 ( 1999) 、朗春秀
(1999) 、蓝海燕 (2000)等提供的策略和方法[15～17 ] ,没
有在改善遗传转化效率方面做太多的工作。不同基
因型植物对不同抗生素的耐受性不同 ,筛选效果、遗
传转化率也不同。由于油菜对卡那霉素过于敏感 ,
在筛选过程中使用了较低浓度 ,可能影响了对转化
细胞的有效筛选而影响了转化效率。选择合适的带
有不同抗生素抗性基因标记的植物表达载体 ,开展
利用不同抗生素对转化油菜植株筛选效果的研究 ,
可能有助于进一步提高油菜的转化效率。
本试验获得的 11 株转基因植株中 ,有 2 株没有
明显延缓叶片衰老 ,可能是外源基因 ipt 没能表达
或表达量偏低 ,不足以启动叶片细胞分裂素生物合
成的缘故 ;其余 9 株都表现出明显的叶片衰老延缓
现象 ,生理衰老平均推迟 15～30 d。转基因植株生
长发育正常 ,没有出现可见的叶型变化、侧芽增多等
现象 ,表明 ipt 基因的表达受到了衰老特异表达启
动子的严格调控。
植物叶片叶绿素含量、细胞分裂素含量、SOD 活
性及 MDA 积累量是植物叶片衰老的重要生理指标。
转基因植株基本定型叶下部不同叶位叶片叶绿素含
量、细胞分裂素含量和 SOD 活性明显高于对照、
MDA 积累低于对照表明 ,本试验获得的转基因植株
叶片衰老进程在生理上得到了延缓 ,这与试验中对
转基因植株生长情况的观察结果一致。
外施细胞分裂素类物质可以提高杂交水稻叶片
光合速率 ,促进籽粒灌浆和干物质积累 ,增加粒重和
产量[3 ] ;叶面喷施 62BA 和 PP333可以延缓小麦叶片衰
老 ,提高单位面积穗数 ,增加穗粒数和千粒重[4 ] 。这
些研究结果表明 ,通过调控内源细胞分裂素水平调
控叶片衰老进程 ,有可能提高作物的产量[3 ,4 ] 。Gan
等[6 ]对转基因烟草的研究证实了这种可能性 ,他们
获得的转基因烟草种子产量提高了 50 % ,生物量提
高 40 %。张宇文等[19 ]的研究表明 ,不同类型油菜叶
片对产量的贡献率不同。甘蓝型油菜秦油 1 号和 2
号无柄薹叶对产量的贡献率分别为 714 % 和
1515 % ,短柄叶为 511 % 和 1416 % , 长柄叶仅为
013 %和 510 %。本试验获得的转基因油菜植株主茎
有柄叶衰老进程延迟 15～20 d ,无柄薹叶衰老延迟
20～30 d ,这可能对转基因油菜的产量形成有利。
一些报道还显示 ,细胞分裂素水平与植物抗逆
性密切相关 ,外施细胞分裂素可以提高植株的抗逆
性[1～3 ] ,但内源细胞分裂素与植株抗逆性之间的关
系则很少有人涉及。本研究初步获得了延缓叶片衰
老的 PSAG122ipt 嵌合基因转基因油菜株系 ,并证实其
对叶片衰老的一些重要生理指标产生了较大的影
响。ipt 基因的特异表达对整个植株抗逆性和油菜
种子产量以及生物总量影响的研究正在进行中。
5　第 1 期 张治礼等 :内源细胞分裂素调控油菜叶片衰老进程的研究 　　　

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