全 文 ：Vol131 , No12
pp1 150 - 153 　Feb1 , 2005作 　物 　学 　报ACTA AGRONOMICA SINICA第 31 卷 第 2 期2005 年 2 月 　150～153 页
rd29A 启动子在小麦幼胚愈伤组织中的活性研究
高世庆1 　陈　明1 　马有志1 , 3 　程宪国2 　杜丽璞1 　徐惠君1
(1 中国农业科学院作物育种栽培研究所 ,农业部作物遗传育种重点开放实验室 ,北京 100081 ;2 中国农业科学院土壤肥料研究所 ,北京 100081)
摘 　要 :来自拟南芥的 rd29A 基因受干旱、高盐及低温诱导表达 ,编码一种与 LEA 蛋白相似的亲水性很强的蛋白。用
Rd29A 启动子控制 GUS 报告基因的表达构建载体 ,通过基因枪介导转化小麦幼胚愈伤组织 ,经过分子生物学检测及在
PEG胁迫条件下的 GUS组织化学染色证实了 rd29A 启动子在小麦愈伤组织中能够诱导 GUS 基因的表达。
关键词 : rd29A 启动子 ; 遗传转化 ; 小麦
中图分类号 : S512 ,Q789
Activity of rd29A Promoter in Wheat Immature Embryonic Calli
GAO Shi2Qing1 ,CHEN Ming1 ,MA You2Zhi1 , 3 ,CHENG Xian2Guo2 ,DU Li2Pu1 ,XU Hui2Jun1
(1 Key Laboratory of Crop Genetics and Breeding , Ministry of AgriculturalΠ Institute of Crop Breeding and Cultivation , Chinese Academy of Agricultural Sciences ,
Beijing 100081 ;2 Soil and Fertilizer Institute , Chinese Academy of Agricultural Sciences , Beijing 100081 , China)
Abstract : rd29A gene from Arabidopsis , encoding LEA2like protein , was induced by stresses like drought , high2salt and
low2temperature1 An expression vector containing GUS gene under control of rd29A promoter was constructed and
bombarded into wheat immature embryogenic calli by biolistic1 The results of PCR , PCR2Southern and histochemical stain
showed that expression vector was transferred into wheat calli and GUS gene was induced by PEG treatment1
Key words : rd29A promoter ; Genetic transformation ;Wheat
　　干旱、高盐、低温等逆境胁迫是影响作物生长、
发育的重要限制因子。随着近年来生物技术的发
展 ,植物抗逆基因工程技术已逐渐在农作物品种改
良上得到应用。
目前的抗逆基因工程采用的基因可大致分成两
大类。第一类是直接与抗逆相关的基因 ,编码产物
包括直接保护细胞免受水分胁迫伤害的功能蛋白 ,
如LEA 蛋白、渗透蛋白、抗冻蛋白、离子通道蛋白
等 ;渗透调节因子 ,如脯氨酸、甜菜碱 ;以及毒性降解
酶 ,如谷胱甘肽 S 转移酶、超氧化物歧化酶、过氧化
氢酶等。第二类是与抗逆相关的转录因子基因 ,编
码的产物包括传递信号和调控基因表达的转录因
子 ,如 bZIP 转录因子、MYC 转录因子、MYB 转录因
子及 DREB 转录因子等[1 ] 。
转录因子也称为反式作用因子 ,是能够与真核
基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性作用的
DNA 结合蛋白 ,通过它们之间以及与其他相关蛋白
之间的相互作用激活或抑制转录。转录因子的
DNA 结合区决定了它与顺式作用元件结合的特异
性 ,而转录调控区决定了它对基因表达的激活或抑
制作用。
近年来转录因子在抗逆育种中的应用受到广泛
关注 ,基因分子生物学研究领域的重点已逐渐从功
能基因转到启动子顺式作用元件和转录因子及其调
控机理上。对转录因子的结构与功能的分析鉴定 ,
是阐明在各种条件下基因表达调控机理的重要内容
之一。揭示转录因子间以及它们与 DNA 之间相互
作用的机制 ,就可以人为控制特定基因的表达 ,为植
物转基因工作奠定良好理论基础。
利用不同类型的启动子构建转录因子基因的植
物表达载体 ,通过转基因来改良作物的抗逆性已经
成为近年来的研究重点。刘强等[2 ]以拟南芥为研究
材料 ,分别构建含组成型启动子 CaMV235S 和来自
拟南芥的诱导型启动子 Rd29A 携带抗逆相关基因
繱基金项目 : 国家“863”及国家转基因专项资助。
作者简介 : 高世庆 (1977 - ) ,男 ,中国农业科学院博士研究生 ,专业为生物化学和分子生物学。3 通讯作者 :马有志。
Received(收稿日期) :2003212222 ,Accepted(接受日期) : 20042052201

DREBA1 植物表达载体 ,来研究这两种不同类型的
启动子对拟南芥转基因植株生长及表型的影响。结
果表明 , 在非逆境条件下 , 35S 启动子可调控
DREBA1 基因过量表达一种 TINY蛋白 ,导致转基因
植株出现严重的矮化现象[3 ] 。rd29A 启动子在非逆
境条件下 ,不能被诱导激活启动 DREBA1 基因的表
达 ,而在逆境条件下 , rd29A 启动子能被诱导激活启
动 DREBA1 基因表达 TINY蛋白 ,转基因植株能够正
常生长 ,与对照植株相比表现出明显的抗逆性[4 ] 。
rd29A 启动子在单子叶植物中是否具有活性尚
不清楚 ,本研究选用诱导型启动子 rd29A 构建表达
载体进行基因枪转化小麦愈伤组织 ,目的是确定
rd29A 启动子在小麦的表达活性。从而为 rd29A 启
动子在小麦抗逆基因工程中的应用提供依据。
1 　材料与方法
111 　材料
　　受体材料为山东省推广品种鲁麦 22 和鲁麦 23。
取授粉后 12～14 d 的未成熟胚 ,在 75 %乙醇中
浸泡 30 s ,然后用 10 %次氯酸钠消毒 10 min。无菌
水冲洗 3～5 次 ,接种于 SD2 培养基上诱导愈伤组
织 ,作为基因枪转化的靶材料。
112 　所用菌株和载体
受体菌大肠杆菌 JM109、克隆载体 pBluescriptSK
( + ) 、pAHC25 由本实验室提供 , rd29A 启动子是根
据已知序列设计引物从拟南芥基因组中扩增获得 ,
p Rd GH2bar 由本实验室构建。
113 　p Rd GUS2bar 载体构建(见下面示意图)
114 　基因枪转化
在转化前 4 h ,将胚性愈伤组织转移到高渗透压
培养基 (SD2 培养基附加 012 molΠL 甘露醇 ,012 molΠL
山梨醇) [5 ]上 ,每盘培养皿 40 块愈伤组织 ,放置在培
养皿中央直径约 215 cm 范围内。用 p Rd GUS2bar 基
因包裹直径 110μm 金粉 ,采用 PDS21000ΠHe 基因枪
(Bio2Red 公司生产) ,选择 1 100 Psi 的可裂膜 ,载样
距靶材料 6 cm 进行轰击。
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115 　GUS 基因表达检测
在 PEG26000 (聚乙二醇) 浓度分别为 5 %、10 %
和 15 %的 MS 培养基上使愈伤组织经不同时间 (0
h、5 h、10 h、15 h、20 h) 处理 ,加入 X2Gluc 溶液 37 ℃
保温过夜 ,次日取出 ,经 70 %酒精褪色后观察愈伤
组织中蓝色斑点。
116 　引物设计及 PCR检测
rd29A 引物由上海生物工程公司合成 ,5 端引物
为 5′2AGATCATACCTATTAGAACGATT23′,3 端引物为
5′2TCCAATAGAAGTAATCAAACCCT23′。反 应 条 件 :
94 ℃预变性 5 min ;94 ℃30 s ,55 ℃30 s ,72 ℃30 s ,进
行 30 个循环 ;72 ℃延伸 10 min。
117 　PCR Southern 鉴定
将转基因小麦愈伤组织的总 DNA 进行 PCR 扩
增 ,扩增产物全部加样于 018 %琼脂糖凝胶 ,电泳后
将 DNA 转移到尼龙膜 ( Hybord N + membrane) 上。用
EcoR Ⅰ将 p Rd GUS2bar 载体上的 Rd29A 片段切下 ,
电泳回收 ,用 Dig2142Datp 标记 ,Southern 杂交及杂交
后的洗膜、杂交信号的检测按照试剂盒说明书进行。
2 　结果与分析
211 　p Rd GUS2bar 载体构建酶切鉴定
　　将构建好的 p Rd GUS2bar 载体利用 Sma Ⅰ和
Sac Ⅰ进行双酶切 ,然后用 1 %的琼脂糖凝胶电泳检
测酶切产物。通过溴化乙啶染色 ,如图 1 所示 ,CK
为未经酶切的重组子 ,样品 1、2、3 均切出了 2 kb 左
右的 GUS 基因片段 ,说明了 GUS 基因片段已经插
入并连接到载体上 ,片段大小、位置完全正确。
图 1 重组子 p Rd GUS2bar 载体酶切鉴定
Fig11 Identification of the plasmid p Rd GUS2bar
with restriction endonucleases
M:λΠEcoR Ⅰ+ Hind Ⅲ;CK:未经酶切的重组子 ;
1～3 :经酶切消化的重组子。
CK:plasmid p Rd GUS2bar no digested ;
1 - 3 :plasmid p Rd GUS2bar digested with Sma Ⅰand Sac Ⅰ1
212 　转基因小麦愈伤组织的分子检测
图 2 为转基因小麦愈伤组织 PCR 检测结果。
用未转基因的小麦愈伤组织的 DNA 作为阴性对照 ,
1、2 为转基因的小麦愈伤组织的 DNA 样品。采用
Rd29A 启动子的引物进行 PCR 检测 ,转基因的小麦
愈伤组织 DNA 样品均扩增出 520 bp 的 Rd29A 启动
子片段。
图 2 转基因小麦愈伤组织的 PCR分析
Fig12 PCR analysis of transgenic wheat calli
M:Marker Ⅲ;CK:阴性对照 ;1～2 :转基因的小麦愈伤组织
CK:negative control ;1 - 2 :transgenic wheat calli
将 PCR 扩增产物转移到尼龙膜上 ,进行 PCR2
Southern 分析。结果显示 ,经过不同浓度的 PEG处
理 5 h、20 h 的转基因愈伤组织 PCR 产物均出现了
杂交带。说明 rd29A 启动子已经转到小麦基因组中
(图 3) 。
图 3 转基因小麦愈伤组织的 PCR2Southern 分析
Fig13 PCR2Southern blot analysis of transgenic wheat calli
CK- :阴性对照 ;CK+ :阳性质粒对照 ;
1～4 :在 0、5 %、10 %、15 % PEG浓度下处理 5 h 的转基因小麦愈伤
组织 ;5～7 :5 %、10 %、15 % PEG处理 20 h 的转基因小麦愈伤组织。
CK- :negative control ;CK+ :plasmid control ;
1 - 4:transgenic wheat calli treated with 0 ,5 %,10 %,15 % PEGfor 5 h ;
5 - 7 :transgenic wheat calli treated with 5 % ,10 % ,15 % PEGfor 20 h
213 　小麦愈伤组织 GUS 基因组织化学染色
为了确定 rd29A 启动子活性 ,我们对转基因小
麦愈伤组织进行组织化学染色 ,经 5 %、10 %、15 %
的 PEG处理 5 h 的愈伤组织加入 X2Gluc 后 37 ℃放
置过夜 ,没有呈现蓝色 (图 4) 。而经 5 %、10 %、15 %
的 PEG处理 20 h 的愈伤组织加入 X2Gluc ,37 ℃放置
过夜呈现出蓝色 ,证明 5 %、10 %、15 %的 PEG都可
以诱导 rd29A 启动子的活性 ,诱导的最佳时间是
20 h。而且随 PEG浓度的增加 ,转基因小麦愈伤组织
呈现出的蓝色是逐渐加深的 (图 4) 。
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图 4 转基因小麦愈伤组织 GUS 基因组织化学染色结果
Fig14 Histochemical stain of wheat calli after different concentration PEG treatment
CK:未经 PEG处理的转基因小麦愈伤组织 ;5 %、10 %、15 % :分别表示 PEG的浓度。
CK:transgenic wheat calli no treated with PEG;5 % , 10 % , 15 % :PEG concentration1
3 　讨论
实验结果表明 ,PEG处理 20 h 的转基因小麦愈
伤组织经 GUS染色 ,发现随着 PEG浓度的增加 ,蓝
色呈现出逐渐加深的趋势。说明来自拟南芥基因组
的受干旱、高盐及低温诱导表达的 rd29A 启动子 ,在
胁迫处理的小麦愈伤组织中能够被诱导启动下游基
因的表达。同时 , rd29A 启动子在小麦愈伤组织中
具有诱导表达活性 ,可以用来作为小麦抗逆转基因
的研究工具 ,应用于小麦抗逆基因工程。
利用含 rd29A 启动子的载体结合 PEG的使用 ,
在小麦愈伤阶段进行转基因再生植株的筛选是可行
的 ,笔者已经初步建立起了 PEG筛选小麦愈伤组织
获得转基因再生植株的技术体系 ,使小麦转基因再
生植株筛选工作的时间大大缩短 ,从而加快了抗逆
转基因小麦新品种的育种进程。而且 ,这一体系的
建立可以不用抗生素进行转基因植株的筛选 ,为获得
无抗生素筛选标记基因的转基因植株创造了条件。
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