全 文 ：Vol131 , No15
pp1 640 - 646 　May , 2005作 　物 　学 　报ACTA A GRONOM ICA SIN ICA第 31 卷 第 5 期2005 年 5 月 　640～646 页
双低甘蓝型油菜杂交种亲本指纹图谱构建和杂交种纯度鉴定
刘平武　周国岭　杨光圣 3 　傅廷栋 Ξ
(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室 ,国家油菜改良武汉分中心 ,湖北武汉 430070)
摘 　要 : 利用 SSR 分子标记构建了 18 份恢复系和 21 份不育系共 39 份甘蓝型油菜杂交种亲本的 DNA 指纹图谱 ,筛选
出 H9901 和 H9905 两个杂交种亲本的共显性 SSR 标记 Na10 G08 ,并用其鉴定了 H9901、H9905 两个大田生产 F1 杂种群
体的纯度。对比 SSR 和田间调查的鉴定结果表明 ,SSR 标记鉴定可以识别更多的非杂交种单株 ,如母本因微粉导致的自
交、花粉污染、机械混杂等带来的非杂交种单株。本文还就 SSR 标记用于 DNA 指纹图谱构建和杂交种纯度鉴定的可行
性和优点进行了讨论。
关键词 : 甘蓝型油菜 ;杂交种亲本 ;指纹图谱 ;杂交种纯度 ;SSR
中图分类号 : S565
Fingerprints Construction of Hybrid Parents in Brassica napus and Its Util ization
in Hybrid Purity Test
L IU Ping2Wu , ZHOU Guo2Ling , YAN G Guang2Sheng 3 , FU Ting2Dong
( N ational Key L aboratory of Crop Genetic Improvement , Huazhong A gricult ural U niversity , Research Center of N ational Rapeseed Improvement ,
W uhan 430070 , Hubei , China)
Abstract: Utilization of heterosis is an important way of increasing yield potential in crop breeding programs1
Application of cytoplasmic male sterility (CMS) , compared with other ways of utilizing heterosis in rapeseed , is the
main way1 However , with the effect of temperature and light , the male sterile lines of polima cytoplasmic male
sterility (pol CMS) can produce small amount pollens , which will lead to self2pollination of the sterile lines in hybrid
seed production1 And the high ratio of sterile plants in F1 populations will reduce the yield1 In order to test purity of
hybrid and protect the parents of hybrid , an effective and accurate system must be set up1 Many molecular markers ,
such as RAPD , SCAR and AFL P have been widely used in constructing the fingerprints of crop varieties1 However ,
the fingerprints analysis and hybrid purity test in B rassica napus has rarely been reported by using SSR1
In the investigation reported in this paper , the fingerprints of 39 B1 napus hybrid parents including 18
restorers and 21 sterile lines were constructed with SSR1 106 SSR primer pairs were screened on 3 materials ( Y04 ,
Y12 , Y29) with great genetic diversity , and 16 primer pairs were selected for further analysis1 A total of 73 bands
were amplified ( Table 2) , and the certain band patterns were just the fingerprints for each B1 napus hybrid
parents , which could be used in identifying the factuality of the parents and the purity of hybrid1
According to the DNA fingerprints , primer Na10 G08 was chosen to test purity of F1 hybrids H9901 (8086A ×
Lun31R) and H9905 (8110A ×8759R) , and 3 bands were produced by this primer1 That was“010”in the female
parents 8086A and 8110A ,“101”in the male parents Lun31R and 8759R , and“111”in the hybrids ( Fig11 and
Fig12) 1 A total of 178 hybrid plants in H9901 and 173 hybrid plants in H9905 were investigated1 PCR
amplification result showed that 168 F1 hybrid plants in H9901 and 152 F1 hybrid plants in H9905 were true
hybrids1 The hybrid purity was 94138 % and 87186 % respectively1 In addition , the fertility investigation results of
these two F1 populations in field showed that 171 F1 hybrid plants in H9901 and 158 F1 hybrid plants in H9905Ξ基金项目 : 国家 863 计划资助 (2001AA241111) 。
作者简介 : 刘平武 (1976 - ) ,男 ,博士 ,讲师。Tel : 027287281713 ; E2mail : HZAUL PW @1631com3 通讯作者 :杨光圣。Tel : 027287281507 ; Fax : 027287280009 ; E2mail : rapelab @public1wh1hb1cn
Received(收稿日期) :2004203222 , Accepted(接受日期) :20042082231

were fertile1 The hybrid purity was 96107 % and 91133 % respectively ( Table 3 and Table 4) 1
Compared with the results of the observation of fertility in the field , SSR marker can detect more false hybrids ,
which might come from self2pollination of female parent , biological contamination of other pollens or machanical
contamination with other seeds1 Meanwhile , the feasibility and merits of constructing DNA fingerprints and
identifying hybrid purity were discussed also1
Key words : B rassica napus ; Hybrid parents ; Fingerprints ; Hybrid purity ; SSR
　　杂种优势的利用是提高作物产量的重要途径 ,
目前生产上利用甘蓝型油菜杂种优势的主要途径有
细胞质雄性不育 (CMS) 、细胞核雄性不育 ( GMS) 、
自交不亲和 ( SI) 和化学杀雄等途径 ,其中细胞质雄
性不育是油菜杂种优势利用最主要的途径。但在杂
交制种中 ,由于不育系不育性不彻底或由于温度、光
照的影响导致不育系产生微量花粉 ,进而导致 F1 杂
种中混杂不育株 ,比例过高会严重影响杂交种的产
量。因而在杂交种应用于生产之前 ,需要鉴定杂交
种的纯度。另外由于杂交种具有较高的科技含量和
商业价值 ,少数杂交种生产经营者为谋取私利常掺
假或以非法手段获取亲本生产杂交种 ,从而严重侵
害了育种工作者和合法的种子生产经营单位的正当
权益。为了更好地保护杂交种亲本和进行杂交种纯
度鉴定 ,需要建立一套准确、简便、快速、高效的体
系。这在油菜杂交种生产中具有重要的实际意义。
目前构建杂交种亲本的指纹图谱是鉴定和保护
杂交种亲本及检测杂种纯度的有效手段。用于构建
品种指纹图谱的遗传学标记主要包括形态学标记、
生化标记和分子标记。分子标记是近年发展起来
的 ,它反映了 DNA 水平上生物个体间的遗传差异 ,
目前广泛应用的主要包括限制性片段长度多态性
(RFL P) 、随机扩增长度多态性 ( RAPD) 、特征序列
扩增标记 ( SCAR) 、扩增片段长度多态性 (AFL P) 、
简单重复序列 ( SSR) 、单核苷酸多态性 ( SNPs) 等。
它们具有表现中性 ,鉴定不受时空限制和环境影响
等优点 ,因而发展很快。RAPD、SCAR、AFL P 已广
泛用于品种指纹图谱构建和杂交种纯度鉴定[ 1～5 ] ,
但利用 SSR 标记在甘蓝型油菜中进行指纹分析和
杂交种纯度鉴定方面的研究还未见报道。本文即试
图开展这方面的研究。
1 　材料与方法
111 　材料
　　所用的材料包括 18 份恢复系和 21 份不育系共
39 份双低甘蓝型油菜杂交种亲本材料 (表 1)和 2 个
大田生产 F1 杂种群体 H9901 ( 8086A ×轮 31R) 、
H9905 (8110A ×8759R) 。
表 1 供试材料
Table 1 List of the materials tested
编号
No1 名称Name 来源Origin 编号No1 名称Name 来源Origin 编号No1 名称Name 来源Origin
Y01 8086A RHZAU Y14 9623622R OCRICAAS Y27 3551R RHZAU
Y02 8061A21 RHZAU Y15 1478AB RHZAU Y28 194A RHZAU
Y03 195A RHZAU Y16 1472AB RHZAU Y29 8117A RHZAU
Y04 725R RHZAU Y17 1471AB RHZAU Y30 5900R RHZAU
Y05 205A RHZAU Y18 1481AB RHZAU Y31 723R RHZAU
Y06 206A RHZAU Y19 1489AB RHZAU Y32 5148R RHZAU
Y07 8759R RHZAU Y20 251A RHZAU Y33 5148R21 RHZAU
Y08 轮 31R Lun31R RHZAU Y21 245A RHZAU Y34 9928R RHZAU
Y09 4270R21 RHZAU Y22 8110A RHZAU Y35 9928R(New) RHZAU
Y10 1815R21 RHZAU Y23 8110A21 RHZAU Y36 6545R RHZAU
Y11 1815R22 RHZAU Y24 8061A21 RHZAU Y37 986A RHZAU
Y12 1815R23 RHZAU Y25 8061A22 RHZAU Y38 1070A RHZAU
Y13 9623621R OCRICAAS Y26 3531R RHZAU Y39 1141A RHZAU
　　注 :A : 不育系 ; R : 恢复系 ,所有恢复系均可恢复表中不育系的育性。RHZAU :华中农业大学油菜室 ;OCRICAAS : 中国农业科学院油料
所。
Notes :A : Sterile lines ; R : Restorer lines1 The sterility of those sterile lines listed in the table can be restored by the restorer lines1 RHZAU :
Rapeseed2lab of Huazhong Agricultural University ; OCRICAAS : Oil Crop Research Institute , Chinese Academy of Agricultural Sciences1
146　第 5 期 刘平武等 :双低甘蓝型油菜杂交种亲本指纹图谱构建和杂交种纯度鉴定 　　　

112 　田间种植和大田生产 F1 杂种群体的育性调查
双低甘蓝型杂交亲本按 5 行区种植 ,大田生产
F1 杂种群体 H9901 和 H9905 按 10 行区种植。随
机选取大田生产 F1 杂交种群体单株进行编号挂牌 ,
在油菜开花期分 3 次逐株调查育性 ,每次至少检查
单株上的 3～5 朵开放花朵 ,将可育记为 F ,不育记
为 S。
113 　D NA提取
参照 Horn 等 (1992) 和李佳等 ( 1994) 报道的
SDS法大量提取亲本基因组 DNA[ 6 ,7 ] ,小量提取大
田生产 F1 杂种群体单株基因组 DNA。
114 　SSR分析
11411 　SSR 的 PCR 反应 　　PCR 反应体系含 1 ×
扩增缓冲液、2 mmol·L - 1 MgCl2 、012 mmol·L - 1
dN TPs(购自 SABC) 、014 U Taq 酶 (购自 MB I) 、215
mmol·L - 1 引物 (由 Sangon 合成 ,序列来自 http :ΠΠ
www1ukcrop1 net)和 50 ng 模板 DNA ,加 ddH2 O 至终
体积 10μL ,反应在 PTC2225 型热循环扩增仪上进行 ,
94 ℃1 min ;94 ℃1 min ,60 ℃30 s ,72 ℃45 s ,10 个循
环 ,每循环复性温度降 015 ℃;94 ℃1 min ,55 ℃30 s ,
72 ℃45 s ,30 个循环 ;4 ℃保存。
11412 　PA GE 检测 　　参考陆光远等 (2001) 的银
染法[ 8 ] 。
2 　结果与分析
211 　双低甘蓝型油菜杂交种亲本指纹图谱构建
　　根据段院生等研究结果[ 1 ] ,选用 3 个遗传差异
较大的材料 ( Y04 , Y12 , Y29)对 106 对 SSR 引物进
行了筛选 ,选择 26 对带型清晰、多态性较好的引物
对 39 份甘蓝型油菜杂交种亲本材料进行多态性分
析 ,淘汰扩增效果欠佳、带型不好辨认的引物 ,最后
选择 16 对引物用于构建甘蓝型油菜杂交种亲本
DNA 指纹图谱 (表 2) 。对于某一亲本材料 ,16 对引
物特异带的组合即为该亲本的指纹 ,可用于该亲本
的真伪和杂交种纯度的鉴定 ,这对于杂交种亲本保
护及其杂交种种子纯度鉴定具有极其重要的意义。
212 　双低甘蓝型油菜杂交种纯度鉴定
21211 　以田间育性调查鉴定杂交种纯度 　　将大
田生产的 F1 杂交种 H9901 和 H9905 群体单株编
号 ,于开花期调查各单株的田间育性表现 ,H9901 调
查了 178 个单株 ,其中 171 株可育、7 株不育 (表 3
中的 8、35、66、99、107、119、129 号单株) ,杂交种纯
度为 96107 % ; H9905 调查了 173 个单株 ,其中 158
株可育、15 株不育 (表 4 中的 27、29、37、48、57、59、
63、119、131、135、144、166、169、187、199 号单株) ,
杂交种纯度为 91133 %。
21212 　以 SSR 分子标记鉴定杂交种纯度 　　根据
211 结果及表 1 ,引物 Na10 G08 在所有材料中均可
扩增出 3 条带 (如图 1) ,8086A 和 8110A 均为“0 ,1 ,
0”,而轮 31R 和 8759R 均为“1 , 0 , 1”, H9901 和
H9905 杂交种带型为“1 ,1 ,1”。因此 ,该引物可用于
这两个杂交种的纯度鉴定。
用引物 Na10 G08 对 H9901 F1 杂种群体的 178
个单株及双亲进行 PCR 扩增 ,在父本轮 31R 中扩增
出 2 条特征带 ,分别为 290 bp 和 260 bp ,在母本
8086A 中扩增出一条 280 bp 特征带 (见图 1) ,F1 群
体中有 168 株扩增出杂交种带型 (如图 1 中的 33、
34、36、37、63 号等单株) ,有 3 个单株带型与父本相
同 (如图 1 中的 103 号单株) ,有 6 个单株带型与母
本相同 (如图 1 中的 35、66 号单株) ,均为田间调查
的不育株 ;而 86 号单株的带型与双亲及杂交种均不
相同 (见图 1) 。
按以上结果 ,H9901 F1 杂种群体的 178 个单株
中具有杂交种带型的 168 株为真杂种 ,其余 10 株为
母本微粉导致的自交或其他途径混杂的种子 ,杂交
种纯度为 94138 %。
图 1 引物 Na10 G08 在 4 个亲本和 H9901 F1 杂种中的扩增效果
Fig11 Amplif ied patterns of 4 parents and hybrid H9901 with SSR primer Na10 G08
M : 100 bp ladder ; 1～4 : 8086A、轮 31R、8110A、8759R ;33、34、35、36、37、63、64、65、66、67、68、69、70、84、85、86、103 为 H9901 中的单株。
M : 100 bp ladder ; 1 - 4 : 8086A , Lun 31R , 8110A , 8759R ;
33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 63 , 64 , 65 , 66 , 67 , 68 , 69 , 70 , 84 , 85 , 86 , 103 are plants in H99011
246 　　　　作 　　物 　　学 　　报 第 31 卷 　



表 3 杂种 H9901 的 SSR纯度鉴定结果和田间育性调查结果
Table 3 The hybridity identif ication results of hybrid H9901 by SSR primer Na10 G08 and investigation results of fertility in f ield ( 178 F1 plants)
SSR 扩增结果 Results of PCR amplification by SSR
杂种带型
Plants with
hybrid bands
父本带型
Plants with
male bands
母本带型
Plants with
female bands
异常带型
Plants with
unusual bands
田间调查不育株
Sterile plants in field
在图 1 中的泳道序号
Lane No1 in Fig11 — 22 , 25 , 103 35 , 66 , 99 , 107 , 119 , 129 86 8 , 35 , 66 , 99 , 107 , 119 , 129
合计
Total plant No1 168 3 6 1 7
杂种纯度
Hybrid purity 94138 % 96107 %
　　用引物 Na10 G08 对 H9905 F1 杂种群体的 173
个单株及双亲也进行了 PCR 扩增来鉴定其纯度 ,
Na10 G08 对 H9905 双亲及杂交种的扩增带型与
H9901 相同 (见图 2) 。从表 4 中看出 , F1 群体中有
152 株扩增出了杂交种的带型 (如图 2 中的 66、67、
68、69 号等单株) ;有 1 株带型与父本相同 (图 2 中
的 167 号单株) ;有 13 株带型与母本相同 (如图 2 中
的 169 号单株) ,除 110 号单株外 ,其他均为田间调
查的不育株 ,说明与母本带型相同 ,不一定就是母本
微粉导致的自交不育株 ,也有可能是混杂的保持系
表现可育 ;有 7 株扩增出了不同于双亲和杂交种的
带型 (如图 2 中的 70 号单株) ,其中的 63、144、199
号等 3 个单株为田间调查的不育株 ,说明田间调查
的不育株既有母本微粉自交造成的 ,也有通过其他
渠道混杂进去的其他不育系的种子。
按 PCR 扩增结果 , H9905 杂种群体 173 个 F1
单株中具有杂交种带型的 152 株为真杂种 ,其余 21
株为母本因微粉导致的自交或其他途径混杂的种
子 ,杂交种纯度为 87186 %。
图 2 引物 Na10 G08 在 H9905 杂种及双亲中的扩增效果
Fig12 Amplif ied patterns of hybrid H9905 and its parents with SSR primer Na10 G08
M : 100 bp ladder ; P1 : 8759R ; P2 : 8110A ; 66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、167、77、78、169、79、80、81、82、83 为 H9905 中的单株。
M : 100 bp ladder ; P1 : 8759R ; P2 : 8110A ;
66 , 67 , 68 , 69 , 70 , 71 , 72 , 73 , 74 , 75 , 76 , 167 , 77 , 78 , 169 , 79 , 80 , 81 , 82 , 83 , 84 , 85 are plants in H99051
表 4 杂种 H9905 的 SSR鉴定结果和田间育性调查结果
Table 4 The identif ication results of hybrid H9905 by SSR primer Na10 G08 and investigation results of fertility in f ield ( 173 F1 plants)
SSR 扩增结果 Results of PCR amplification by SSR
杂种带型
Plants with
hybrid bands
父本带型
Plants with
male bands
母本带型
Plants with
female bands
异常带型
Plants with
unusual bands
田间调查不育株
Sterile plants in field
在图 2 中的泳道序号
Lane No1 in Fig12 — 167 27 ,29 ,37 ,48 ,57 ,59 ,110 ,119 ,131 ,135 ,166 ,169 ,187 30 , 63 , 70 , 144 ,155 , 179 , 199 27 ,29 ,37 ,48 ,57 ,59 ,63 ,119 ,131 ,135 ,144 ,166 ,169 ,187 ,199
合计
Total plant No1 152 1 13 7 15
杂种纯度
Hybrid purity 87186 % 91133 %
　　从上面结果可以看出 ,共显性 SSR 标记纯度鉴
定结果与田间调查结果比较 ,前者更准确 ,可以区分
出更多的假杂交种子。它不仅能区分出大多田间调
查的不育株 (母本微量花粉导致的自交 ,如 H9901
中的 35、66、99、107、119、129 , H9905 中的 27、29、
37、48、57、59、119、131、135、166、169、187 等单株) ,
还可以区分出一部分通过其他渠道混杂的假杂交种
子 ,如保持系 ( H9905 中的 110 单株) 、父本混杂
( H9901 中的 22、25、103 , H9905 中的 167 等单株) 、
外来花粉污染及机械混杂 ( H9901 中的 86 , H9905
中的 30、63、70、144、155、179、199 等单株)等。
546　第 5 期 刘平武等 :双低甘蓝型油菜杂交种亲本指纹图谱构建和杂交种纯度鉴定 　　　

3 　结论和讨论
本研究用 SSR 标记构建了 39 份甘蓝型油菜杂
交种亲本的 DNA 指纹图谱 ,从指纹图谱中筛选出
共显性 SSR 标记 Na10 G08 ,鉴定了 2 个大田生产 F1
杂种群体的纯度 ,并与开花期 2 个群体育性调查的
结果进行了比较。试验表明 ,SSR 标记鉴定可以识
别更多的非杂交种单株 ,如母本因微量花粉导致的
自交、父本混杂、花粉污染、机械混杂等带来的非杂
交种单株 ,而田间调查仅通过育性一个指标来鉴定
纯度。共显性 SSR 标记可以根据带型将父母本及
F1 杂种区分开 ,同时 ,同一 SSR 标记在不同杂交种
亲本中扩增的带型往往并不相同 (如表 2 中
Na10 G08 在 Y01、Y02、Y06、Y10 等 4 份材料中扩增
的带型互不相同) ,其相应杂交种的带型也不同。据
此 ,利用一条或多条 SSR 引物产生的标记可将不同
杂交种亲本以及各杂交种亲本相应的杂交种区别
开。显然 SSR 标记可以提供更多的信息。另外利
用分子标记不受季节地区限制 ,省去了种植工序 ,因
而简便、快速。
目前用于构建 DNA 指纹图谱的分子标记中 ,
RAPD 对 PCR 反应条件敏感 ,可靠性不够 , RFL P
和 AFL P 则操作繁琐 ,成本较高 ,而 SSR 标记所产
生的 DNA 指纹稳定性好 ,可靠性高 ,操作较简便 ,
且 SSR 为共显性标记 ,多态性信息量大[ 9 ] ,采用 10
μL 体系与 RAPD 20μL 体系相比成本偏低。因此 ,
利用 SSR 标记构建 DNA 指纹图谱更快捷、经济。
用 SSR 技术鉴定杂交种纯度的关键是建立一
套快速、准确、简便的 DNA 提取、PCR 扩增体系和
扩增程序 ,同时针对每一杂交种及其亲本筛选出特
异的引物。实验表明 ,SSR 方法可直接利用 SDS 小
量法粗提的 DNA ,不需纯化 ,因而简化了步骤 ,节约
了时间 ,降低了成本。本实验室的陆光远经过反复
摸索和实验 ,已建立了一套适合于油菜的 SSR2PCR
反应体系和程序[ 10 ] ,且采用 10μL 的体系。这些结
果为这一技术的利用和普及推广奠定了基础。
利用 SSR 方法构建 DNA 指纹图谱并进行杂交
种纯度鉴定 ,具有准确度高、成本低等优点 ,既可弥
补储藏蛋白和同工酶技术的不足 ,又可克服 RAPD
可靠性差、RFL P 具有放射性、AFL P 繁琐的缺点 ,在
品种保护、新品种登记注册、品种纯度鉴定中具有广
阔的应用前景。
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646 　　　　作 　　物 　　学 　　报 第 31 卷