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第 27 卷 第 6 期 作　物　学　报 V o l. 27, N o. 6
2001 年 11 月 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA N ov. , 2001
水稻野败型细胞质雄性不育系统花药的 RRM 特异引物差异
展示分析
景润春　易　平　孙清萍　朱英国Ξ
(武汉大学植物发育生物学教育部重点实验室, 生命科学学院遗传研究所, 湖北武汉 430072)
提　要　根据 RRM RNA 结合蛋白基因家族共有保守序列设计特异引物, 对水稻野败型细胞质雄性
不育系、保持系、恢复系及 F 1 杂种单核期花药进行差异展示分析。不同材料间具有稳定表达的组成型
RRM RNA 结合蛋白基因, 同时具有丰富的差异表达的具调控功能的RRM RNA 结合蛋白基因。不同
材料间差异表达的RRM RNA 结合蛋白基因类型分析说明RRM RNA 结合蛋白基因家族参与了细胞
质雄性不育系统的核质互作。F 1 杂种中特异表达差异片段可能与育性恢复或杂种优势有关。
关键词　水稻; 细胞质雄性不育; RNA 识别基序; RNA 结合蛋白基因家族; 差异展示
Ana lys is of the Pa ttern s of D isplayed cD NA of Un inuclea te Stage
An thers of W A -CM S System Using RRM Spec if ic Pr im er
J IN G R un2Chun　Y I P ing　SUN Q ing2P ing　ZHU Y ing2Guo
(T he K ey L abora tory of M O E f or P lan t D evelopm en ta l B iology and Institu te of Genetics, Colleg e of lif e S cience, W uhan
U niversity , H ubei 430072)
Abstract　　D ifferen t ia l d isp lay of m RNA s w as u sed to ana lyze the d ifference of gene
exp ression in un inuclea te stage an thers of W A 2CM S system , includ ing a sterile line, its
m ain ta iner line, ersto rer line, F 1 hyb rid, w ith RRM specif ic p rim er to study the m o lecu lar
basis of in teract ion betw een the nucleu s and the cytop lasm. T he p rim er w as designed based
on con sen su s sequence from RRM RNA 2b ind ing p ro tein gene fam ily. T he resu lts show ed
tha t there w ere stab le exp ressed fragm en ts am ong the d ifferen t m RNA sam p les. T he
differen t exp ressed fragm en ts w ere d ivided in to severa l d ifferen t types based on their
rela t ion sh ip w ith the m RNA sam p les, w h ich w ere though t to p lay an im po rtan t ro le in
regu la t ing gene exp ression. T he resu lts ind ica ted tha t the RRM RNA 2b ind ing p ro tein gene
fam ily part icipa ted in the pa thw ay of in teract ion betw een the nucleu s and the cytop lasm. T he
specif ic exp ressed fragm en t in un inuclea te stage an ther from the F 1 hyb rid w as p robab ly
rela ted to fert ility resto ra t ion o r hetero sis.
Key words　　O ry z a sa tiva L. ; Cytop lasm ic m ale sterility; RNA recogn it ion m o tif; RNA 2
b ind ing p ro tein gene fam ily; D ifferen t ia l d isp layΞ 本文得到国家自然科学基金资助 (39770455)
作者简介: 景润春 (19702) , 男, 河北献县人, 博士。
　 3 朱英国, 通讯联系人
收稿日期: 200024210, 接收日期: 200029221
Received on: 200024210, A ccep ted on: 200029221

生物个体在生长发育过程中, 基因的表达在转录、转录后和翻译 3 个水平上都受到严格
的调控。20 世纪 70 年代基因割裂现象发现至今已有众多转录因子和剪接因子被鉴定和克隆。
转录调控是基因表达调控的第一步, 而转录后的调控决定着基因表达最终产物的类型和丰
度[ 1 ]。转录后调控过程涉及众多蛋白质, 其中最重要的是一类含 RNA 识别基序 (RNA
recogn it ion m o tif, RRM )的RNA 结合蛋白。RRM 通常由 80～ 90 个氨基酸组成, 其中含有 8
个氨基酸和 6 个氨基酸组成的RN P1 和RN P2 两个结合RNA 所必需的高度保守的亚基序,
RN P1 和RN P2 分别位于RRM 二级结构 Β12ΑA 2Β22Β32ΑB2Β4 中 Β3 和 Β1 反向平行的片层结构
中央位置。目前, 在人、动物、植物、真菌、细菌等不同物种中已发现约 300 个含 RRM 的
RNA 结合蛋白基因, 但研究主要集中于人、动物和微生物上, 在植物中尚知之甚少[ 2 ]。
水稻杂种优势的利用已在我国粮食生产中取得了巨大成就, 其中野败型 (w ild abo rt ive,
W A )杂交水稻产量约占我国杂交水稻总产量的 90% [ 3 ]。同时, 水稻由于具有较小基因组, 已
建 成高密度分子标记连锁图和较稳定成熟的转化系统, 已成为禾本科植物分子生物学研究
的模式植物[ 4 ]。因此, 我们选用水稻野败型细胞质雄性不育系、保持系、恢复系和不育系与
恢复系杂交所得 F 1 代杂种单核期花药为材料, 根据RN P1 高度保守区域设计特异引物, 结合
锚定引物进行差异展示比较分析, 以揭示含RRM 的RNA 结合蛋白基因家族在水稻野败型
细胞质雄性不育系统特定发育时期的作用。
1　材料与方法
1. 1　水稻单核期花药总 RNA 提取
选用水稻野败型细胞质雄性不育系珍汕 97A、保持系珍汕 97B、恢复系 IR 24 和 (珍汕
97A × IR 24) F 1 代植株为材料。在幼穗发育的适宜时期取花药压片以鉴定花粉发育时期, 并
结合植株外部形态特征判定单核期幼穗, 于 4℃冷库中剥取中选幼穗中部的花药。总RNA 提
取采用 P rom ega 公司 To ta l RNA Iso la t ion System 并遵其说明进行操作。获取的总RNA 经
含 2. 2 m o löL 甲醛的变性琼脂糖凝胶检测合格后贮于- 70℃冰箱备用。
1. 2　Poly (A)m RNA 的分离和反转录
Po ly (A )m RNA 的分离采用 Pharm acia B io tech 公司m RNA Pu rif ica t ion K it 并遵照其说
明书进行操作。反转录参照 Sam b rook [ 5 ]方法, 锚定引物为购自 Gibco 公司O ligo (dT ) 12～ 18
P rim er。
1. 3　PCR 扩增及产物分离
PCR 扩增采用与反转录相同的锚定引物, 上游特异引物根据B irney [ 2 ]和L azar[ 6 ]文献设
计为 5′2GGA T GCT GAA GA T GCT 23′, 由上海 Sangon 公司合成。PCR 反应体系为 25 ΛL ,
其中 T aq DNA 聚合酶 1. 0U , M gC l2 1. 5 mm o löL , 10×扩增缓冲液 2. 5 ΛL , 200 Λm o löL
dN T P s, 1 ΛL DM SO , 1 ΛL 反转录产物, 0. 2 Λm o löL 引物。PCR 程序为: 94℃ 5 m in; 94℃
1 m in, 48℃ 1 m in, 72℃ 1 m in, 40 个循环; 72℃延伸 5 m in; 4℃保存。PCR 反应于 Perk in
E lm er DNA T herm al Cycler 480 扩增仪上进行。PCR 产物于 5% 变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳
分离后, 经 P rom ega Silver Sequence DNA Sequencing System 银染显带并照像记录实验结果。
1. 4　差异带回收再扩增及 Northern 杂交分析
根据银染显示的带型直接用无菌刀片挖出差异条带, 放入 100 ΛL 无菌双蒸水中水浴煮
沸 10 m in, 后 10000 röm in 离心 2 m in, 取上清 4 ΛL 为底物, 用上述同样反应条件进行回收
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条带DNA 再扩增, 并把扩增产物与原 PCR 产物同时 5% 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测再扩
增效果。N o rthern 杂交分析参照 Sam b rook [ 5 ]进行, 用变性 PCR M arker 指示分子量大小。
2　结果与分析
2. 1　水稻野败型细胞质雄性不育系统单核期花药的 RRM 特异引物差异展示分析
　　水稻野败型细胞质雄性不育系统的RRM 特异引物差异展示图谱 (图 1)显示: RRM 特异
引物结合 3′锚定引物在珍汕 97A、珍汕 97B、IR 24 及 F 1 杂种单核期花药m RNA 样品中均具
有多条扩增产物带型, 表明在水稻中同样存在着具RRM 基序的RNA 结合蛋白基因家族。
图 1　　水稻野败型细胞质雄性不育系统单
核期花药的RRM 特异引物差异展示图谱
A 为珍汕 97A、B 为珍汕 97B、F 为 F1 杂
种、R 为 IR 24、M 为 分 子 量 M arker
pBR 322öM sp É , S 长箭头所指为材料间
组成型稳定表达带型, É、Ê、Ë、Ì、Í、Î 长箭头所指为材料间交叉类型的带
型, 照片中短箭头所指为材料特异表达类
型的带型。
F ig. 1 　　 Patterns of disp layed cDNA
from uninucleate stage an ther of the WA 2
CM S system of rice using RRM specific
p rim er, A stands fo r Zhenshan 97A , B
stands fo r Zhenshan 97B, F stands fo r F1
hybrid, R stands fo r IR 24, M stands fo r
DNA mo lecu lar w eigh t m arker
　　从差异展示图谱可见, 在水稻野败型细胞质雄性不
育系统单核期花药中具有组成型稳定表达的 RRM
RNA 结合蛋白基因, 这类基因在不育系、保持系、恢
复系和 F 1 杂种间表达无差异, (图 1 中 S 长箭头所指) ;
还有一些见调控功能的RRM RNA 结合蛋白基因在不
育系、保持系、恢复系和 F、杂种间只丰富差异片段可
据不同材料间的不同差异带型划分为几种类型 (图 1 中É、Ê、Ë、Ì、Í、Î 长箭头所指和照片中短箭头所
指 )。根据差异类型不同可以把具调控功能的 RRM
RNA 结合蛋白基因的差异表达归纳为表 1。从表 1 可
见, 在珍汕 97A、珍汕 97B、F 1 杂种、IR 24 等 4 个材料
中均存在材料特异表达类型的RRM RNA 结合蛋白基
因 (图 1 的照片中短箭头所指) , 由于珍汕 97A 与珍汕
97B 是同核异质体关系, 所以 RRM RNA 结合蛋白基
因家族的转录明显受到细胞质的调控。另外, 由于野败
型细胞质雄性不育系统内细胞核和细胞质在材料间的
差异及核质互作的影响, 差异表达的 RRM RNA 结合
蛋白基因中存在着多种材料间交叉类型 (图 1 中É、Ê、Ë、Ì、Í、Î 长箭头所指) , 表明 RRM RNA 结合蛋
白基因家族广泛参与了野败型细胞质雄性不育系统中
核质互作关系的形成。
2. 2　F1 杂种中特异表达的 RRM RNA 结合蛋白基因
cD NA 片段的 Northern 杂交分析
我们选取于 F 1 杂种中特异表达的分子量约 320bp
的差异片段 (图 1 照片中短箭头所指) FB , 并从银染聚
丙稀酰胺凝胶中回收再扩增。差异片段 FB , 回收再扩
增产物的琼脂糖凝胶检测结果 (图 2) 说明 FB 从银染聚
丙烯酰胺凝胶中回收再扩增的效果良好, 分子量大小与
聚丙烯酰胺凝胶电泳结果相符合, 回收再扩增产物可以作为N o rthern 杂交的探针。
　　F 1 杂种中特异表达的差异片段 FB 的N o rthern 杂交分析结果 (图 3) 显示, FB 在珍汕
97A、珍汕 97B、IR 24、F 1 杂种中均具分子量约 1. 2 kb 的转录本, 而在 F 1 杂种中多一条分子
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表 1　　具调控功能的 RRM RNA 结合蛋白基因在水稻
野败型细胞质雄性不育系统的差异表达
Table 1　　Polymorphism of displayed cD NA among
differen t mRNA s sample fr iom WA-CM S system
差异表达类型
T ypes of
differen t
exp ressed
fragm ent
珍汕 97A
Zhenshan97A
珍汕 97B
Zhenshan97B
F1
F1 hybrid
IR 24
IR 24É + - - +Ê + + - -Ë + - + -Ì - + + -Í - + + +Î - - + +Ï Ý - - -Ð - Ý - -Ñ - - Ý -Ò - - - Ý
　　注: “+ ”表示为扩增片段存在; “- ”表示为片段缺失; “Ý ”
表示为材料特异表达片段。
　　N o tes: “+ ”stands fo r differen tial exp ressed fragm ents; “- ”
stands
fo r deletion of differen tial exp ressed fragm ents“Ý ”stands
fo r specific exp ressed fragm ents of the mRNA s samp le in
WA 2CM S system
量略小的转录本 (图 3 中箭头指示) ; 另
外在 IR 24 中 1. 2 kb 转录本的丰度相对
较低, 可见 RRM RNA 结合蛋白基因
家族的基因表达调控不仅表现在转录本
类型, 也表现在转录本丰度上。F 1 杂种
中特异表达的差异片段 FB 的真实性得
到N o rthern 杂交的验证, 这也说明本
文中采用的高退火温度的 R T 2PCR 反
应的可靠性较高。
3　讨论
本文用RRM 特异引物对水稻野败
型细胞质雄性不育系统内不育、保持
系、恢复系和杂种 F 1 单核期花药的
m RNA 进行差异展示分析, 这是 RRM
RNA 结合蛋白基因家族在细胞质雄性
不育系统中作用方式研究的首次报道。
已有研究结果表明, 虽然 RRM 基序具
有许多保守性很强的氨基酸以保证其与
RNA 的结合活性, 但不同 RRM RNA
结合蛋白却可特异地结合不同的RNA 分子, 从而在细胞代谢过程中发挥重要作用[ 1, 7 ]。本实
验发现在水稻野败型细胞质雄性不育系统内不同材料间存在着组成型表达的RRM RNA 结
合蛋白基因, 这类基因可能对细胞基本代谢活动的进行, 起着重要的作用。另外不同材料间
RRM RNA 结合蛋白基因也存在着丰富的差异表达。说明RRM RNA 结合蛋白基因家族的
图 2　　F1 杂种特异表达差异片段从
银染聚丙烯酰胺凝胶中回收再扩
增, FB 为回收再扩增片段
F ig. 2　　Reamp lification of the
specific exp ressed fragm ent in
F1 hybrid from silver stained
po lyacrylam ide gel
图 3　　F1 杂种中特异表达的差
异片段 FB 的N o rthern 杂交分析
R 为 IR 24、A 为珍汕 97A、B 为珍汕 97B、
F 为 F1 杂种, 箭头所指为 F1
杂种中特异表达的转录本
F ig. 3　　N o rthern b lo t analysis of
a specific exp ressed cDNA fragm ent
in mRNA s from F1 hybrid
R stands fo r IR 24, A stands fo r Zhenshan
97A , B stands fo r Zhenshan 97B, F
stands fo r F1 hybrid
5486 期　　　　景润春等: 水稻野败型细胞质雄性不育系统花药的RRM 特异引物差异展示分析　　　　　

转录明显受到细胞质的调控, 这可能与 RRM RNA 结合蛋白基因家族广泛参与转录后的调
控有关, 也可说明转录后调控类型的丰富程度。
　　单核期对水稻野败型细胞质雄性不育系统是十分关键的发育时期, 直接影响着育性恢复
程度及产量构成因子的形成。本实验发现RRM RNA 结合蛋白基因家族参与了细胞核与细
胞质的相互作用。同时, 细胞质雄性不育性的形成与育性恢复均与细胞质内线粒体基因组变
异与转录后调控有关。本变验中 F 1 杂种中特异表达或缺失的差异片段可能与育性恢复或杂
种优势有一定关系。
随机引物差异展示技术揭示的多是m RNA 3′端少部分m RNA 片段信息[ 8, 9, 10 ] , 而根据
基因家族中共有保守序列设计特异引物进行高退火温度的差异展示分析可能更有利于遗传信
息的揭示。
参　考　文　献
1　Burd CG, G D refuss, S cience, 1994, 265 (5172) : 615～ 621
2　B irney E, S Kum ar, A R Krainer. N ucleic A cid R esearch , 1993, 21 (25) : 5803～ 5816
3　Yuan L P. P roc. A sian2P acif ic Conf . A g ric. B iotechnol, Beijing: Ch ina Science and T echno logy P ress, 1992, 97～ 105
4　Ko Sh im amo to. S cience, 1995, 270: 1772～ 1773
5　Sam brook J , E F F ritsch, T M aniatis. M olecu lar C lon ing : A L abora tory M anua l. 2nd ed. N ew Yo rk: Co ld Sp ring
H arbo r L ab P ress, 1989, 432～ 450
6　L azar G, T Schaal, T M aniatis et al. P roc. N atl. A cad. Sci. U SA , 1995, 92: 7672～ 7676
7　Kenan D J, C C Q uery, J D Keene. T IB S , 1991, 16 (6) : 214～ 220
8　L iang P, A B Pardee. S cience, 1992, 257: 967～ 970
9　张弛, 陈受宜. 中国科学, 1995, 25 (8) : 840～ 847
10　程宁辉, 高燕萍, 杨金水等. 植物学报, 1997, 39 (4) : 379～ 382
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