全 文 ：Vol. 31 , No. 6
pp. 815 - 817 　Jun. , 2005
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 31 卷 第 6 期
2005 年 6 月 　815～817
研究
简报 云南疣粒野生稻细菌人工染色体 ( BAC)文库的构建与分析
阿新祥1 　程在全2 　吴成军2 　鄢　波2 　陈善娜1 　杨明挚1 　黄兴奇2 , 3 Ξ
(1 云南大学生命科学学院 ,云南昆明 650091 ;2 云南省农科院生物技术研究所 ,云南昆明 650223)
Construction and Analysis of Bacterial Artif icial Chromosome ( BAC) Library of
Oryza granulata Nees et Arn1 ex Watt1 in Yunnan
A Xin2Xiang1 , CHENG Zai2Quan2 , WU Cheng2Jun2 , YAN Bo2 , CHEN Shan2Na1 , YANG Ming2Zhi1 , HUANG Xing2Qi2 , 3
(1 College of Life Sciences , Yunnan University , Kunming 650091 , Yunnan ; 2 Biotechnology Research Institute , Yunnan Academy of Agricultural Sciences , Kunming
650223 , Yunnan , China)
　　我国有 3 种野生稻 ,即普通野生稻 ( Oryza rufipogon) 、药
用野生稻 ( O1 officinalis) 、疣粒野生稻 ( O1 granulata) 。野生
稻由于长期处于野生状态 ,经受了各种灾害和不良环境的自
然选择 ,抗逆性较强 ,是天然的基因库 ,保持有栽培稻不具有
或已经消失了的遗传基因 ,它在水稻育种中具有独特的作
用 ,是水稻育种的宏厚物质基础。但是 ,由于人为干扰破坏
等种种原因 ,云南的野生稻和全国的野生稻一样也处于濒危
状态 [1 ] 。因此进行云南野生稻遗传资源的保护与研究是非
常重要和有意义的。
大片段 DNA 插入文库的构建 ,为开展基因组的分化组
成、基因的表达与调控、染色体区段的分子物理作图 (physical
mapping)等领域的研究和基因的克隆提供技术平台。基因组
大片段插入文库的发展主要经历 3 个阶段 :Cosmid 文库[2 ] 、
YAC文库 [3 ] 、BAC文库 [4 ] 。Cosmid 文库用于高等植物的基因
图位克隆时 ,其插入片段就显得太小。近年来得到广泛应用
的人工染色体主要是 YAC、BAC 和 PAC。然而 , YAC 具有转
化效率低、嵌合体高及插入片段回收困难等难以克服的缺
点。比较而言 , BAC 具有嵌合、重排频率相对低 ,外源 DNA
能较稳定遗传 ,转化效率高 ;重组 DNA 容易分离等优点 ,因
而弥补了 YAC的不足。转化前又无需对重组子 DNA 进行包
装而又易于 PAC。所以BAC得到了迅速发展和广泛的应用。
近几年来 ,BAC克隆系统已成为构建基因组大片段插入文库
应用最广泛的系统 ,几十种植物 (包括大多数重要农作物)
(http :ΠΠwww1hbz1tamu1edu) 、动物[5 ,6 ] 甚至线粒体等细胞器 [7 ]
的 BAC文库正在构建或已构建完毕。国内对 BAC文库的构
建及应用也得到了快速发展 [7～16 ] 。但到目前为止 ,对于疣
粒野生稻 BAC文库的构建还未见报道。本研究通过云南疣
粒野生稻 BAC文库的构建 ,在分子水平上保存了疣粒野生
稻的遗传物质。分析结果表明 ,该文库包含 25 000 个克隆 ,
DNA插入片段平均大小为 80 kb ,相当于疣粒野生稻基因组
大小的 416 倍。本文库不仅较完整地保存了疣粒野生稻的
核基因组 ,同时还可以进一步用来发掘利用疣粒野生稻的有
利基因。
1 　材料与方法
111 　植物材料
　　野外采集的云南疣粒野生稻种植于温室中 ,待发出嫩叶
后 ,收集嫩叶材料用于提取核基因组 DNA。
112 　主要溶液和试剂
试剂盒采用美国 Epicentre 公司的 CopyControlTM BAC
Cloning Kits , 包括 CopyControlTM pCC1BACTM Vector、Fast2LinkTM
DNA Ligase、Fast2LinkTM 10 ×Ligation Buffer、ATP 等 EP1300 感
受态细胞。氯霉素、Spermidine 和 Spermine 为 Sigma 产品 ,琼
脂糖、Lambda Ladder PFG Marker 购自 New England Biolabs 公
司。
113 　高分子量核基因组 DNA的制备
主要参照 Zhang H2B 等方法 [17 ] 提取细胞核。收集的细
胞核液于 45 ℃水浴中预热 5 min ,加入等体积 45 ℃预热 1 %
的LMP ,混匀。快速将上述混合液加入 plug 模具中 ,静置凝
固约 1 h。将 plug 转移到 5～10 倍的含蛋白酶 K裂解溶液
(lysis buffer)中 ,在 50 ℃的环境中轻微摇晃 48 h ,充分裂解细
胞核膜。裂解后的 plug 放在 20 倍体积冰冷的 T10 E1 (含 011
mmolΠL 苯甲基磺酰氟 PMSF) 中 [11 ] ,置于冰上 1 h ,重复洗 3Ξ基金项目 : 国家自然科学基金重点项目 (3006900) 、国家自然科学基金项目 (30460019) 、云南省自然科学基金重点项目 (2004C0010Z) 和云南
大学 211 工程二期建设及植物学博士点资助。
作者简介 : 阿新祥 (1979 - ) ,女 ,云南大学生命科学学院硕士研究生 ,植物生理与分子生物学方向。　3 通讯作者 :黄兴奇。E2mail :
xingqh2 @public1km1yn1cn ;Tel :087125130681
Received(收稿日期) :2004204229 ,Accepted(接受日期) :20042112161

次 ,处理好的 plug 放入 T10 E1 中 ,4 ℃储存备用。
114 　文库的构建
用 018 U Eco R Ⅰ酶 ,37 ℃下酶切 8 min ,按下列条件 [17 ]
脉冲电泳 :温度 1215 ℃,泵 80 ,电泳角度 120°,脉冲时间 5～50
s ,电压 6 VΠcm ,电泳时间 18 h。切下 DNA 分子量在 100～300
kb 之间的胶条于透析袋中 ,电泳透析回收 DNA 大片段。大
片段 DNA 与载体以 4∶1 浓度连接后与大肠杆菌感受态细胞
进行电激转化 (转化条件为 115 kV ,25 mF ,200Ω) ,将转化物
悬浮于 1 mL SOC液中 ,37 ℃摇床培养 1 h。涂于培养平板上 ,
37 ℃培养 24～36 h。人工挑取白色菌落 ,接种于含氯霉素冻
存培养基 80μL 的 384 孔的细胞培养板中 ,37 ℃静置培养过
夜。 - 70 ℃保存。
115 　文库鉴定与分析
随机挑取若干单个白色克隆分别接种到含氯霉素的 LB
培养基中 ,培养菌液。碱裂解法提取质粒 DNA , Not Ⅰ酶解
后 ,脉冲电泳 [17 ]温度 1215 ℃,泵 80 ,脉冲角度 120°,脉冲时间
5～15 s ,脉冲电压 6 V Πcm ,电泳时间 16 h。EB 染色 ,在紫外
光下检测插入的 DNA 片段大小。为检测 BAC 克隆的稳定
性 ,随机挑选 4 个 BAC克隆做继代培养 ,分别提取第 1 代和
第 100 代细菌培养物中BAC克隆质粒 DNA , Not Ⅰ酶解后 ,脉
冲电泳检查 BAC克隆在继代培养前后是否有变化。
2 　结果与分析
211 　高分子量 DNA的获得
　　按照下列浓度梯度 (0、012、014、016、018、110、115、210、
510 ,酶浓度单位为 U) 加限制性消化酶 EcoR Ⅰ,37 ℃下分别
酶切 6、8、9、10、12 min 等 ,部分酶切的 DNA 片段大小主要集
中在 100～300 kb 的酶浓度为最佳酶切浓度 ,经多次实验比
较 ,认为酶切时间 8 min 时较适宜的酶切浓度在 016～110 U
之间 ,其中 018 U 为最佳酶切浓度。
通过不同方法的比较研究 ,建立了一种有效提取野生稻
核基因组大片段 DNA 的技术体系 ,重复性好 ,每次都能获得
大量的大片段 DNA。大片段 DNA 浓度通过与λDNA 浓度梯
度比较来确定。
212 　核基因组大片段 DNA的连接转化
通过多次的连接转化实验 ,优化了野生稻核基因组大片
段 DNA 的连接转化条件 , 即 25 ng的 pCC1BACTM Vector 与约
100 ng的大片段连接 ,2μL 连接产物与 50μL EP1300 感受细
胞混匀后电激转化效果最好 ,每次转化都能够得到较多的白
色克隆 ,而出现的蓝色克隆很少 ,都少于 1 % ,符合 BAC文库
构建所要求的转化标准。
213 　BAC文库的限制性酶切分析
随机挑取 80 个克隆 ,限制酶 Not Ⅰ酶切检测 ,每个克隆
子都含有插入片段 (图 1) ,其大小分布在 40～200 kb 之间 ,平
均长度约为 80 kb(图 2) 。根椐保存的 25 000 个克隆计算 ,所
建云南疣粒野生稻文库的容量约为疣粒野生稻基因组 DNA
含量 430 Mb(参照水稻) 的 416 倍。达到了建库所要求的理
论值。
图 1 BAC克隆 Not Ⅰ酶切图谱
Fig11 FIGE analysis of BACs digested with
restriction enzyme Not Ⅰ
M:λ2ladder ; 1 - 17 : BAC clones digested with Not Ⅰ1
图 2 BAC文库插入片段的分布( 80 个克隆分析结果)
Fig12 Distribution of insert sizes of clones in the BAC
library ( 80 BAC clones were checked for insert sizes)
图 3 BAC克隆的稳定性检测
Fig13 Checking the steadity of BAC clones
M为λ2ladder ; 1 为第 1 代 ;2 为第 100 代。
M:λ2ladder ;1 :first generation ;2 :one hundredth generation1214 　文库的稳定性分析BAC载体系统较 YAC 的优点之一 ,就是其插入片段非常稳定。图 3 表明 ,随机挑取文库中 4 个克隆经继代培养 ,结果第 100 代插入片段的酶切图谱较第 1 代的无任何明显差异 ,充分说明所构建的云南疣粒野生稻 BAC 文库是稳定的。
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3 　讨论
BAC文库的发展已历经 10 多年 ,技术日趋完善 [11 ] 。尽
管如此 ,构建 BAC 文库仍然是一件十分费时费力而又涉及
多种分子生物学技术的工作。高分子量基因组 DNA 的制备
是构建 BAC文库的一大难关 ,关键一步是将细胞核包埋在
琼脂糖凝胶块中的质量 ,包括细胞核的质量和浓度、琼脂糖
凝胶的浓度等因素。若细胞核在包埋之前破裂、细胞核浓度
太低、琼脂糖浓度过高等 ,都会造成失败。为了防止细胞核
的破裂用于建库的组织始终在液氮中研磨且不能研磨得过
细 ,细胞核的悬浮也必须动作轻柔。包埋的琼脂糖浓度过高
会影响酶切效果 ,甚至造成无法酶切。研磨时液氮充分 ,大
片段的操作除酶切外全部在 4 ℃以下进行 ,这样就有效防止
了 DNA 的物理损伤和降解。选用绿色嫩叶为原材料 ,对粗
提细胞核进行洗涤时 ,可以减少叶绿体的污染情况 ,纯净的
细胞核是浅黄色 ,若颜色偏绿 ,可通过增加洗涤次数和降低
离心速度来减少叶绿体的污染。在进行脉冲电泳分离后切
下的片段太大连接效率就太低。故切下大小为 100～300 kb
的片段 ,连接效率高 ,产生的白色菌落多 ,蓝色菌落很少。本
研究用手工挑取文库 ,所以文库中几乎没有蓝色菌落 ,但是
挑取的速度太慢。因为受时间和条件的限制只挑取了25 000
个克隆 ,但已覆盖整个疣粒野生稻基因组的 416 倍 ,足以用
来做进一步研究。
构建云南疣粒野生稻基因组 DNA 的 BAC 文库 ,对于云
南疣粒野生稻遗传资源的保护和研究具有非常重要的作用。
一方面对于用刚刚兴起的保护生物学原理和技术来保护处
于濒危状态的云南野生稻资源 ,在分子水平上是一种完善和
补充 ;另一方面又可以用来做疣粒野生稻功能基因的分离与
克隆等 ,为进一步发掘和利用云南疣粒野生稻中的有利基因
奠定了基础。
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