全 文 ：Vol. 30 , No. 5
pp. 496～501 　May , 2004
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 30 卷 第 5 期
2004 年 5 月 　496～501 页
芥菜转基因再生体系的建立
杨朝辉1 　雷建军2 　曹必好2 　钟小林1 　李蓉芬1 　江　渝1 　彭家和1 　何凤田1 , 3 Ξ
(1 第三军医大学生物化学与分子生物学教研室 ,重庆 400038 ; 2 华南农业大学园艺系 ,广东广州 510642)
摘 　要 　以叶用和茎用芥菜的子叶、叶片及下胚轴为外植体 ,通过筛选 12 种含不同种类和浓度激素的培养基 ,综合分析
与确定影响芥菜转基因再生体系各因素的最佳值 ,以及对再生抗性苗的 PCR、Southern、Northern 及抗虫鉴定 ,筛选到了能
稳定表达外源基因的转基因植株 ,建立了芥菜转基因再生体系。
关键词 　转基因 ;再生 ;芥菜
中图分类号 :S565
Establishment of Genetic Transformation Regeneration System in Brassica juncea
YANG Zhao2Hui1 ,LEI Jian2Jun2 ,CAO Bi2Hao2 ,ZHONG Xiao2Lin1 ,LI Rong2Fen1 ,J IANG Yu1 ,PENGJia2He1 ,HE Feng2Tian1 , 3
(1 Department of Biochemistry , Third Military Medical University , Chongqing 400038 ;2 Department of Horticulture , South China Agricultural University , Guangzhou
510642 , Guangdong , China)
Abstract 　Using hypocotyls , cotyledons and leaves as explants , 12 sorts of media containing different kinds and concentra2
tions of hormones were studied to establish an efficient regeneration system. The optimum values of the factors affected mus2
tard transgenetic regeneration system were determined. The regenerated plants were identified by PCR , Southern , Northern
blot and insect2resistance test . The target plants with cpti gene activity were separated from the Kan2resistant regenerated
plants. Therefore the perfect transgenetic regeneration system of mustard was established.
Key words 　Transgenetic ; Regeneration ; Brassica juncea Coss
　　芥菜 ( Brassica juncea) 的主要虫害有菜粉蝶 (鳞
翅目) 、黄条跳甲 (鞘翅目) 、猿叶虫 (鞘翅目) 、菜叶蜂
(膜翅目) 、菜青虫 (半翅目) 等。向芥菜体内导入抗
虫基因 ,使其具有天然抗性 ,是培育抗虫芥菜品种的
重要途径之一[1 ] 。我们以叶用和茎用芥菜生长 4 d
的无菌苗的下胚轴、子叶和 25 d 苗龄的叶片为外植
体 ,建立了较为完善的叶用和茎用芥菜的转基因高
频再生体系 ,并通过农杆菌介导的方法成功地将
cpti 基因导入芥菜植株 ,为芥菜的抗虫育种提供新
的种质资源。
1 　材料与方法
1. 1 　材料
　　叶用芥菜种子 9928 ( Brassica juncea) 由西南农业
大学园艺系蔬菜教研室提供。茎用芥菜种子涪丰
24 ( Brassica juncea var. tsatsai)购自北碚农贸市场。
重组质粒 pBI1212Cp (含豇豆胰蛋白酶抑制剂基 因 ,Cowpea trypsin inhibitor) [2 ] 及农杆菌 LBA4404 由本教研室构建和保存。Taq 酶、限制性内切酶 KpnⅠ、BamH Ⅰ、小分子量 Marker 等购自上海生工生物公司。抗生素 Amp (氨苄青霉素) 、Kan (卡那霉素) 、Str (链霉素) 、Carb (羧苄青霉素) 、Cef (头孢霉素) 购自 Sigma 公司。PCR 引物由上海生工生物公司合成。Southern、Northern 杂交试剂盒购自 Roche 公司。1. 2 　方法1. 2. 1 　芥菜无菌苗的培养挑选叶用及茎用芥菜种子 ,75 %乙醇浸泡 30 s后用 0. 1 % HgCl2 消毒 7～10 min ,其间不时摇动 ,最后用无菌水冲洗 4～5 次 ,播种于 MS 培养基上。温度为 (25 ±1) ℃,相对湿度 (65 ±5) %。1. 2. 2 　芥菜的组织培养取生长 4 d 的叶用、茎用芥菜无菌苗子叶、下胚轴及 25 d 苗龄的幼苗叶片为外植体 ,下胚轴从根部以上切取 0. 5～1 cm 的切段 ,子叶和叶片距叶柄 1Ξ基金项目 :重庆市科技攻关课题 (9825084) 。
作者简介 :杨朝辉 (1976 - ) ,男 ,湖南益阳人 ,讲师 ,从事分子生物学研究。3 通讯作者 :何凤田。Tel :023268752261 Fax :023268752260 E2mail :
hefengtian @163. net
Received(收稿日期) :200327211 ,接受日期 :2003210230.

cm处切除 ,各外植体均垂直接入 12 种含不同激素
种类和浓度配比的 MS 培养基上 ,筛选各外植体的
最适再生培养基和比较外植体的分化能力。
1. 2. 3 　外植体选择压及最适抗生素的确定
将两类芥菜的 3 种外植体接种于 Kan 0、20、30、
50、75、100 mgΠL 的再生培养基上 ,检测其对 Kan 的
敏感性。将外植体接种于含 100、300、500 mgΠL 的
Carb 和 Cef 的培养基中 ,筛选最适抑菌抗生素及其
浓度。
1. 2. 4 　芥菜外植体的遗传转化
1. 2. 4. 1 　农杆菌的准备 　挑取含有重组质粒
(pBI1212Cp) 的农杆菌 LBA4404 单菌落 ,接种于 50
mL 含 Kan (50 mgΠL) 、Str (125 mgΠL)的液体 YEB 培养
基中 ,28 ℃,220 rΠmin 振荡培养 1～2 d ,用无菌的 MS
液体培养基稀释 5～10 倍 ,使其 OD260为 0. 3 左右。
1. 2. 4. 2 　外植体的预培养 　取 4 d 苗龄的子叶、下
胚轴及 25 d 苗龄的叶片外植体 ,置再生培养基上 ,
预培养 0 ,1 ,2 ,3 ,4 d ,比较各天数的分化率。
1. 2. 4. 3 　感菌时间的确定 　将预培养的外植体投
入稀释 5～10 倍的农杆菌菌液 ,不时摇动 ,让外植体
与农杆菌充分接触 ,感染 10、20、30 min 后取出 ,置滤
纸上吸去多余菌液 ,转至再生培养基上 ,暗处共培养
2 d 后转为正常条件下再共培养 2 d。
1. 2. 4. 4 　抗性筛选培养及植株再生 　经共培养的
外植体 ,转至抗性筛选培养基 (MS + BA 3. 0 mgΠL +
NAA 0. 1mgΠL + Carb 500 mgΠL + Kan 30 mgΠL) 。每
两周更换一次培养基 ,并逐渐降低 Carb 的浓度至
300 mgΠL。抗性芽转到生根培养基 (MS + NAA 0. 2
mgΠL + Carb 300 mgΠL + Kan 30 mgΠL)上诱导生根。
1. 2. 5 　再生植株的鉴定
取再生植株的叶片提取 DNA 进行 PCR 扩增初
步鉴定 ,再对阳性植株进行 PCR2Southern 和 Northern
杂交鉴定。对有 cpti 基因表达的植株在室内进行抗
虫鉴定。
2 　结果与分析
2. 1 　芥菜转基因再生体系的建立及其遗传转化
2. 1. 1 　不同 BA 和 NAA 配比对外植体再生的影响
在植物组织培养中 ,培养基中的外源激素是影
响外植体分化的关键因素。通过对表 1 所示的 12
种培养基的比较试验 ,筛选到了外植体分化的最适
培养基为 MS + BA 3. 0 mgΠL + NAA 0. 1 mgΠL。
2. 1. 2 　芥菜离体高频再生体系的建立
2. 1. 2. 1 　不同外植体和基因型的分化能力比较 　
对接种于 MS + BA 3. 0 mgΠL + NAA 0. 1 mgΠL 培养基
的生长 4 d 的叶用芥菜和茎用芥菜的无菌苗子叶、
下胚轴及 25 d 左右苗龄叶片的再生实验结果表明
(表 2) ,3 种外植体均能高频率地产生愈伤 ,不同基
因型的同种外植体其愈伤和芽出现的时间和形态较
一致 ,但再生能力有显著差异。子叶接种 5 d、叶片
接种 7 d 后于切口处可见浅绿色愈伤 ,质地紧密。
下胚轴 12～15 d 后在靠近根部一端有明显膨大的
愈伤出现 ,结构松散 ,容易褐化。两类芥菜的 3 种外
植体中 , 子叶再生频率最高 , 分别为 96. 67 %和
95 % ;叶片的再生频率分别为 85 %和 90 % ;下胚轴
较低 ,为 61. 54 %和 78. 18 %。
2. 1. 2. 2 　选择压的确定 　转化用的 pBI1212Cp 质粒
带有 npt Ⅱ基因。因此 ,可采用卡那霉素 ( Kan) 作为
筛选转化植株的选择剂。当 Kan 浓度低 ,即选择压
过低时 ,部分未转化的外植体由于产生耐受性而分
化再生成植株 ;选择压过高时 ,真转化子由于未能承
受高选择压而同样被抑制 ,使转化效率降低。为明
确未转化的芥菜外植体对 Kan 的耐受性 ,以确定适
当的选择压 ,分别将两类芥菜的 3 种外植体接种于
含 0、20、30、50、75、100 mgΠL Kan 的分化培养基上 ,25
d 后的统计结果表明 ,不同基因型的芥菜对 Kan 敏
感性无明显差异 ,3 种外植体对 Kan 的敏感性趋于
一致。Kan 20 mgΠL 时 ,有 2 个和 1 个直接再生 ,频
率为 4 %和 2 % ,但无愈伤产生。Kan 30 mgΠL 时 ,外
植体全部黄化变白 ,无愈伤产生 ,说明 Kan 30 mgΠL
就能完全抑制外植体的再生。因此我们将 Kan 30
mgΠL 作为选择压 ,在转化后筛选抗性愈伤和抗
性芽。
2. 1. 2. 3 　抗生素对芥菜外植体分化的影响 　采用
农杆菌介导的方法进行植物遗传转化时 ,可用 Cef
和 Carb 来有效的抑制农杆菌的生长。为了确定两
种抗生素对芥菜外植体的分化是否有影响及其影响
程度 ,我们将 3 种外植体分别接种于含 Cef 和 Carb
100、300、500 mgΠL 的分化培养基上进行比较试验。
结果 (表 3)表明 Carb 对外植体的分化无明显的抑制
作用 ,而 Cef 则有轻微的抑制作用。
2. 1. 2. 4 　预培养时间对芥菜外植体转化及再生的
影响 　预培养时间是影响植物转基因效率的重要因
素之一 ,未经预培养或预培养时间短 ,使感染农杆菌
后伤口严重褐化 ,外植体很少能够分化。预培养时
794　5 期 杨朝辉等 :芥菜转基因再生体系的建立 　　　

表 1 　不同种类及浓度的激素对芥菜外植体分化的影响
Table 1 　Effects of different hormone composition on the bud differentiation frequency in explants of mustard
种类
Type
培养基
Medium
子叶 Cotyledons 叶片Leaves 下胚轴 Hypocotyles
外植体
数 (个)
Total No. of
explants
分化的外植
体 数 ( 个 )
Differentiated
explants No
分化率 ( %)
Differentiation
percentage
外植体
数 (个)
Total No. of
explants
分化的外植
体 数 ( 个 )
Differentiated
explants No
分化率 ( %)
Differentiation
percentage
外植体
数 (个)
Total No. of
explants
分化的外植
体 数 ( 个 )
Differentiated
explants No
分化率 ( %)
Differentiation
percentage
叶用
芥菜
Brassica
juncea
1 80 17 21. 25 80 25 31. 25 80 15 18. 75
2 80 22 27. 5 80 17 21. 25 80 9 11. 25
3 80 35 43. 75 80 28 35. 0 80 21 26. 25
4 80 80 100. 0 80 76 95. 0 80 61 76. 25
5 80 62 77. 5 80 65 81. 25 80 56 70. 0
6 80 69 86. 25 80 71 88. 75 80 44 55. 0
7 80 71 88. 75 80 73 91. 25 80 43 53. 75
8 80 55 68. 75 80 57 71. 25 80 38 47. 50
9 80 60 75. 0 80 58 72. 50 80 47 58. 75
10 80 56 70. 0 80 53 66. 25 80 39 48. 75
11 80 33 41. 25 80 35 43. 75 80 19 23. 75
12 80 27 33. 75 80 22 27. 5 80 11 13. 75
茎用
芥菜
Brassica
juncea var
tsatsai
1 80 36 45. 0 80 42 52. 5 80 17 21. 25
2 80 40 50. 0 80 39 48. 75 80 19 23. 75
3 80 44 55. 0 80 45 56. 25 80 15 18. 75
4 80 80 100. 0 80 80 100. 0 80 52 65. 0
5 80 66 82. 5 80 72 90. 0 80 55 68. 75
6 80 73 91. 25 80 62 77. 5 80 33 41. 25
7 80 69 86. 25 80 74 92. 5 80 47 58. 75
8 80 48 60. 0 80 51 63. 75 80 31 38. 75
9 80 76 95. 0 80 73 91. 25 80 44 55. 0
10 80 58 72. 5 80 54 67. 5 80 20 25. 0
11 80 61 76. 25 80 65 81. 25 80 27 33. 75
12 80 57 71. 25 80 46 57. 50 80 13 16. 25
　Notes : ①BA1. 0 ②BA2. 0 ③BA3. 0 ④BA3. 0 + NAA0. 1 ⑤BA3. 0 + NAA0. 2 ⑥BA3. 0 + NAA0. 01 ⑦BA2. 0 + NAA0. 2 ⑧BA2. 0 + NAA0. 2 +
KT1. 0 ⑨BA2. 0 + NAA0. 1 ⑩BA2. 0 + NAA0. 01 λϖ BA1. 0 + NAA0. 1 λωBA1. 0 + NAA0. 01
表 2 　芥菜不同外植体的再生能力比较
Table 2 　Comparison on regeneration capacity of three explants types of mustard
种类
Type
外植体类型
Types of explants
外植体总数 (个)
Total No.
of explants
形成愈伤 Callus2forming 分化芽 Regenerated2shoot
形成愈伤的外植体数 (个)
Callus2forming explants No. % 形成芽的外植体数 (个)Callus2forming explants No. % 芽数Π外植体ShootsΠexplants
叶用芥菜
Brassica juncea
子叶 Rotyledon 60 60 100. 0 58 96. 67 3. 2
叶片Leaf 60 60 100. 0 51 85. 0 2. 8
下胚轴 Hypocotyle 60 52 86. 67 32 61. 54 1. 3
茎用芥菜
Brassica juncea
var tsatsai
子叶 Cotyledon 60 60 100. 0 57 95. 0 2. 9
叶片Leaf 60 60 100. 0 54 90. 0 3. 1
下胚轴 Hypocotyle 60 55 91. 67 43 78. 18 2. 2
表 3 　不同浓度的抗生素对芥菜外植体分化的影响
Table 3 　Effect of different antibiotic concentration on explants differentiation of mustard
种类
Tpye
抗生素
Antibiotic
(mgΠL) 子叶 Cotyledons 叶片Leaves 下胚轴 Hypocotyles分化的外植体数(个) Differentiated
explants No
分化率 ( %)
Differentiation
percentage
分化的外植体数
(个) Differentiated
explants No
分化率 ( %)
Differentiation
percentage
分化的外植体数
(个) Differentiated
explants No
分化率 ( %)
Differentiation
percentage
叶用芥菜
Brassica juncea
CK0 60 100. 0 59 98. 33 40 66. 67
Carb100 54 90. 0 52 86. 67 35 58. 33
Carb300 56 93. 33 50 83. 33 39 65. 0
Carb500 55 91. 67 53 88. 33 42 70. 0
Cef100 52 86. 67 50 83. 33 39 65. 0
Cef300 47 78. 33 43 71. 67 35 58. 33
Cef500 32 53. 33 29 48. 33 11 18. 33
茎用芥菜
Brassica juncea
var. tsatsai
CK0 60 100. 0 60 100. 00 44 73. 33
Carb100 58 96. 67 59 98. 33 45 75. 0
Carb300 52 86. 67 55 91. 67 41 68. 33
Carb500 54 90. 0 58 96. 67 33 55. 0
Cef100 51 85. 0 55 91. 67 46 76. 67
Cef300 48 80. 0 55 91. 67 37 61. 67
Cef500 40 66. 67 38 63. 33 19 31. 67
894 　　　作 　　物 　　学 　　报 30 卷 　

间过长 ,则切口处趋于愈合和封闭 ,使农杆菌侵染效
率下降。在比较了 0～4 d 预培养的外植体的分化
率后 (表 4) ,发现以采用 2 d 或 3 d 的预培养时间
为宜。
表 4 　预培养时间对芥菜外植体再生的影响
Table 4 　Effects of pre2culture time on regeneration of mustard explants
种类
Tpye
预培养时间
Pre2culture
time (d)
子叶 Cotyledons 叶片Leaves 下胚轴 Hypocotyles
分化的外植体数
(个) Differentiated
explants No
分化率 ( %)
Differentiation
percentage
分化的外植体数
(个) Differentiated
explants No
分化率 ( %)
Differentiation
percentage
分化的外植体数
(个) Differentiated
explants No
分化率 ( %)
Differentiation
percentage
叶用芥菜
Brassica juncea
0 2 3. 3 0 0 0 0
1 13 21. 67 9 15. 0 5 8. 33
2 25 41. 67 19 31. 67 12 20. 0
3 27 45. 0 17 28. 33 12 20. 0
4 19 31. 67 11 18. 33 10 16. 67
茎用芥菜
Brassica juncea
var tsatsai
0 0 0 1 1. 67 0 0
1 8 13. 33 11 18. 33 5 8. 33
2 15 25. 0 21 35. 0 9 15. 0
3 17 28. 33 18 30. 0 12 20. 0
4 12 20. 0 14 23. 33 7 11. 67
2. 1. 2. 5 　浸菌时间对芥菜外植体转化及再生的影
响　在农杆菌感染植物的过程中 ,农杆菌在植物细
胞表面的附着是实现 T2DNA 转移和整合的前提。
但时间过长 ,外植体受伤严重 ,不利于再生和转化。
时间太短 ,不利于较多的农杆菌附着于外植体。将
外植体在 OD260为 0. 3 左右的农杆菌菌液中分别浸
泡 10、20 和 30 min ,筛选结果 (表 5)表明浸菌时间以
20 min 为宜。
表 5 　浸菌时间对芥菜外植体再生的影响
Table 5 　Effects of incubation time on regeneration of mustard explants with A. tumefaciens
种类
Tpye
浸菌时间
Mncubation
time (min)
子叶 Cotyledons 叶片Leaves 下胚轴 Hypocotyles
分化的外植体数
(个) Differentiated
explants No
分化率 ( %)
Differentiation
percentage
分化的外植体数
(个) Differentiated
explants No
分化率 ( %)
Differentiation
percentage
分化的外植体数
(个) Differentiated
explants No
分化率 ( %)
Differentiation
percentage
叶用芥菜
Brassica juncea
10 12 30. 0 10 25. 0 7 17. 5
20 18 45. 0 23 57. 5 15 37. 5
30 16 40. 0 22 55. 0 9 22. 5
茎用芥菜
Brassica juncea
var tsatsai
10 15 37. 5 13 32. 5 11 27. 5
20 27 67. 5 19 47. 5 17 42. 5
30 21 52. 5 23 57. 5 10 25. 0
　　综合考虑以上各因素 ,建立了芥菜转基因再生
体系 :取生长 4 d 的芥菜子叶、下胚轴和 25 d 的叶片
在分化培养基上 (MS培养基 + BA 3. 0 mgΠL + NAA
0. 1 mgΠL)预培养 2～3 d 后 ,于农杆菌菌液中浸染 20
min ,在分化培养基上暗培养 2 d ,正常条件下培养
2 d 后 ,转入抗性培养基 (MS + BA 3. 0 mgΠL + NAA
011 mgΠL + Carb 500 mgΠL + Kan 30 mgΠL) 筛选抗性
愈伤组织和抗性芽 ,每 2 周更换 1 次培养基 ,经多次
继代筛选 , 再在生根培养基上 (MS + NAA 0. 2
mgΠL + Carb 300 mgΠL + Kan 30 mgΠL)生根。最后获
得了 50 株再生植株。
2. 2 　再生植株的鉴定
2. 2. 1 　PCR 扩增
提取转基因芥菜植株总 DNA 进行 PCR 扩增 ,50
株中有 21 株即 42 %的转基因芥菜植株 DNA 及阳性
对照 pBI1212Cp 质粒均扩增出一条 326 bp 的特异
带 ,与 cpti 基因大小一致 (图 1) ,而未转化植株未扩
出任何带 ,扩增结果为阴性。初步证明目的基因已
整合到芥菜植株中。
2. 2. 2 　PCR2Southern
为确定 PCR 产物的真实性 ,通过用高盐法将
PCR 产物从凝胶转移到尼龙膜上 ,将 pBI1212Cp 质
粒经 Kpn ⅠΠBamH Ⅰ双酶切得到的 cpti 片段用 DIG
标记作探针进行杂交。转基因芥菜植株及阳性对照
均出现一条 326 bp 的 cpti 基因杂交带 ,而未转基因
植株没有任何杂交带出现 (图 2) ,表明目的基因已
整合到植株中。
2. 2. 3 　Northern 印迹
取 PCR2Southern 印迹阳性植株及对照植株的叶
片提取总 RNA 各 20μg ,1. 0 %甲醛变性凝胶电泳后
994　5 期 杨朝辉等 :芥菜转基因再生体系的建立 　　　

转移到尼龙膜上 ,探针与上步相同。转基因植株及
阳性对照均有明显的杂交信号 ,而未转基因植株没
有任何杂交带出现 (图 3) 。表明目的基因在转基因
植株中的表达量较高。
图 1 　转基因植株的 PCR检测
Fig. 1 　PCR amplification of transgenic plants
M:MassRuler DNA Ladder Low Range ;1 :PCR amplification
of pBI1212Cp ,as positive control ;
2 :Negative control ;3 —5 :PCR amplification
of transgenic plants
图 2 　转基因植株的 PCR2Southern 杂交检测
Fig. 2 　PCR2Southern blot analysis of the
transgenic plants
1 —4 :transformed plants ;5 :Negative control ;
6 :pBI1212Cp digested by Kpn ⅠΠBamHⅠ
图 3 　转基因植株的 Northern 印迹分析
Fig. 3 　Northern blot analysis of the transgenic plants
1 :pBI1212Cp digested by Kpn ⅠΠBamHⅠ;
2 :Negative control ;3 —7 :Transformed plants
2. 2. 4 　抗虫性初步鉴定
经Northern 印迹鉴定 ,21 个植株中 8 株有 cpti
基因的高效表达。在室内用菜青虫 ( Pieris rapae L. )
幼虫对这些植株进行初步抗虫性鉴定。首先在培养
皿两边各放数片对照和转基因芥菜叶片 ,放入 10 条
菜青虫后盖好培养皿 ,2 d 后观察到对照的芥菜叶片
被严重咬食 ,并且排泄大量虫便 ,而转基因芥菜的叶
片被咬食的程度大大低于对照组 ,差异显著。然后
将转基因和对照植株分单株隔离 ,每株放 3 条菜青
虫幼虫 , 4 d 后 ,转基因植株的幼虫全部提前蛹化 ,
而对照植株上的幼虫生长正常 ,说明转基因植株有
着较强的抗虫性。
3 　讨论
高效的再生及转化体系是外源目的基因导入受
体植株的前提和基础。从实验结果来看 ,在一定的
范围内 ,BA 浓度升高可促进外植体的分化。植物组
织培养理论和实践也证实 ,生长素与细胞分裂素浓
度的比值大 ,有利于根的形成 ;比值小 ,则有利于芽
的形成。芥菜外植体的培养中 ,低比值 (1Π30) 比高
比值 (1Π10)的 NAAΠBA 更有利于愈伤的形成和芽的
分化 ,与前人的结果一致。叶用芥菜和茎用芥菜的
子叶和叶片在 MS + BA 3. 0 mgΠL + NAA 0. 1 mgΠL
的培养基上获得了很高的分化频率 ,而下胚轴的分
化频率维持在较低水平。在 12 种试验培养基中下
胚轴的再生频率都低于子叶和叶片 ,说明子叶和叶
片是芥菜转基因体系中比较理想的转化受体。这与
油菜[3 ] 、甘蓝[4 ]等植物中下胚轴的再生频率显著高
于子叶和叶片的情况相反 ,说明不同植物其外植体
的再生能力有较大差异。
Kan 能与植物叶绿体、线粒体中核糖体的 30S
小亚基相结合 ,抑制翻译的启动从而抑制蛋白质的
合成 ,导致细胞缺乏叶绿素 ,周围因白化而死亡[1 ] 。
从大肠杆菌中分离克隆的新霉素磷酸转移酶基因
( npt Ⅱ基因)的产物新霉素磷酸转移酶 ,可以使 Kan
的羟基磷酸化 ,使其不能与 30S小亚基结合 ,从而解
除 Kan 的毒性。转化细胞中由于 npt Ⅱ基因的表达 ,
可以解除 Kan 对细胞的毒害。因而可在加有 Kan 的
培养基中正常生长并分化成苗。一般认为同种植物
的不同基因型对 Kan 有不同的敏感性[5 ] ,然而我们
在实验中发现 ,叶用芥菜和茎用芥菜作为基因型有
较大差异的两个芥菜变种 ,对 Kan 的敏感性竟无明
显差异 ,其具体机理有待进一步研究。另外 , Kan 的
施用时间也是影响转化的重要因素 ,选择压施加早 ,
由于基因还未充分表达而杀死细胞 ,不能起到筛选
作用。施加晚 ,选择效果降低。实验表明 ,在培养初
期 ,适当降低卡那霉素浓度 (20～25 mgΠL) ,对芥菜
转化细胞启动分裂和分化较为有利 ,能够获得抗卡
那霉素的愈伤组织及再生苗。但是 ,若将这些在选
择培养基上诱导分化的再生苗从母体愈伤组织上切
下 ,继代培养在选择培养基上 ,一部分小苗便逐渐白
化死亡 ,表明它们是非转化体。Dong[6 ] 发现 ,在选择
培养基上形成的亚麻再生植株中 ,80 %为“假阳性
005 　　　作 　　物 　　学 　　报 30 卷 　

苗”( Escapes) ,在这些苗中检测不到 GUS 活性 ,产生
这种现象的原因可能是少数细胞被转化 ,但这些转
化细胞可以“交叉保护”(Cross protect) 大量非转化细
胞 ,使之对卡那霉素产生抗性 ,导致分化出苗。解决
这一问题的办法是先将外植体培养在较低浓度卡那
霉素的选择培养基上 ,获得转化愈伤组织和苗 ,再通
过反复继代筛选 ,逐步加强选择压力 ,严格淘汰一些
“逃逸”的非转化体 ,可以收到良好的效果[7 ] 。
自从 1984 年首例转基因烟草诞生以来 ,植物转
基因技术发展迅速 ,许多具有特定用途的目的基因
被导入植物 ,建立了多种适应于不同植物遗传转化
的方法和系统。其中农杆菌介导的转化是目前研究
得较为清楚的一种方法 ,是双子叶植物转化的首选
方法。农杆菌感染外植体后 ,由于细菌分泌了有毒
物质和植物对细菌侵染的过敏保护反应 ,往往导致
伤口褐化 ,影响农杆菌的侵染和转化。通过预培养
能使外植体对农杆菌侵染产生抵抗能力 ,从而减少
外植体的褐化[8 ] 。有人[9～11 ] 认为植物 DNA 的合成
和细胞分裂素是根癌农杆菌转化的一个必要条件 ,
外植体在农杆菌感染前于分化培养基上预培养 2～
3 d ,使伤口处细胞因创伤和植物激素的诱导而开始
分裂 ,这时用农杆菌感染有利于提高转化频率。我
们在实验中发现 ,两类芥菜的 3 种外植体如不经预
培养均很难再生出抗性芽 ,预培养 2 d 或 3 d 的再生
频率均高于预培养 1 d 或 4 d ,说明预培养时间太短
或太长均不利于外植体分化 ,而以 2 d 或 3 d 为宜。
尽管 2 类芥菜的 3 种外植体都采用相同的再生
培养体系 ,但受外植体本身因素的影响 ,各外植体获
得转基因植株的几率不同。经 PCR2Southern 检测阳
性的 21 株再生植株中 ,10 株来自子叶 ,7 株来自下
胚轴 ,4 株来自叶片 ,说明虽然叶片的再生频率较
高 ,但整合有 cpti 基因的再生植株少。而 8 株有较
高 cpti 基因表达活性的植株中 ,5 株来自下胚轴 ,2
株来自子叶 ,1 株由叶片再生而来。通过本实验证
实虽然 2 类芥菜的下胚轴再生频率均较低 (61. 54 %
和 78. 18 %) ,但其获得有外源基因表达活性的转基
因植株的几率最高。因此我们认为在对芥菜进行外
源基因转化时宜以下胚轴做外植体。
就转化率而言 ,本实验为 42 % ,与国内外相关
研究 (55 %～68 %) [12～14 ] 相比偏小 ,但我们的有外源
基因表达活性的植株获得率 (16 %) 高于其他研究
(9 %～12 %) [15 ,16 ] ,因此我们认为该体系适合于叶用
和茎用芥菜外源基因的遗传转化。
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