全 文 ：　
第28卷 第3期 作　物　学　报 V ol. 28, N o. 3
2002 年5月　 301～ 304页 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA pp. 301～ 304　M ay, 2002
水稻巯基蛋白酶抑制剂基因在烟草叶绿体中的表达Ξ
苏　宁1　冯　丽2　杨　波1　孟　昆1　李轶女1　沈桂芳1
(1中国农业科学院生物技术研究所, 北京, 100081; 2西南农业大学农学系, 重庆, 400716)
摘　要　将水稻巯基蛋白酶抑制剂 (O ry zacy statin, OC ) cDNA 基因克隆、测序分析后, 与烟草 (N icotiana tabacum L. )
叶绿体16S rDNA 基因启动子和 T 393终止子构建表达盒, 与抗壮观霉素选择标记基因 aadA 表达盒相连, 以烟草叶绿
体基因组同源片段 rbcL 和OR F 512一起构建成叶绿体转化载体 pZOC。通过基因枪轰击烟草幼苗叶片, 壮观霉素筛选,
获得转化再生植株。经 Southern、W estern 检测及子代遗传学分析实验证明OC 基因已整合到烟草叶绿体中, 并且可以
遵循非孟德尔的母性遗传规律稳定遗传给后代。转基因植株对棉铃虫幼虫具有抗虫性。
关键词　OC 基因; 叶绿体转化; 抗虫作用
中图分类号: S511　　　文献标识码: A
Expression of Oryzacysta tin in Tran sgen ic Tobacco Chloropla st
SU N ing1　FEN G L i2　YAN G Bo1　M EN G Kun1　L I Yi2N ü1　SH EN Gui2Fang1
(1 B iotechnology R esearch Institu te, Chinese A cad em ic of A g ricultural S ciences, B eij ing , 100081; 2D epartm ent of A g ronom y , S outhw estern
A g ricultural U niversity , Chongqing , 400716, China)
Abstract　A fter clon ing and confirm ed by DNA sequencing, O ry zacy statin from rice w as p laced under the
con tro l of 16S rDNA p romoter and T 393 term inato r from tobacco (N icotiana tabacum L. ) ch lo rop last to
construct OC exp ression cassette. It w as ligated w ith selectable m arker aadA cassette and homology fragm en t
( rbcL and OR F 512)of tobacco ch lo rop last genom e to generate transfo rm ation vecto r pZOC. L eaves of tobacco
w ere transfo rm ed w ith particle bom bardm en t m ethod. A fter screen ing w ith spectinom ycin, transfo rm an tsw ere
finally obtained. T he analysis of Southern2blo tting, W estern2blo tting and genetic analysis of the p rogen ies
show ed that OC gene w as in troduced in to the tobacco ch lo rop last genom e and OC gene w as inherited m aternally
to the p rogen ies. B ioassay show ed that the transgen ic tobacco did have effective pest2resistance to larvae of
co tton bo llworm (H elicoverp a zea) as compared w ith inferious grow th of larvae fed on leaves of un transfo rm ed
tobacco.
Key words　OC gene; Ch lo rop last transfo rm ation; In sect resistance
　　蛋白酶抑制剂是一类能够抑制蛋白水解酶活性
的物质, 水稻巯基蛋白酶抑制剂 O ry zacy statin
(OC ) 基因是通过水稻染色体DNA 文库克隆得到
的基因, 与植物抗虫、抗病密切相关, 其编码蛋白
可抑制昆虫消化道内的蛋白水解酶活性, 使昆虫生
长发育迟缓、滞育, 甚至死亡。将蛋白酶抑制剂基
因转化植物, 可使转化植株产生抗病、抗虫性, 目
前已见报道将植物蛋白酶抑制剂基因转化植物, 并
表现出一定的抗虫性[ 1 ]。
高等植物叶绿体基因工程是植物基因工程发展
的新领域。1988年Boyn ton 等[ 2 ]转化衣藻叶绿体的
成功, 标志着叶绿体基因工程的开始, 该技术具有
表达量高, 安全性好以及定点整合等特点[ 3 ] , 因此
发展迅速。本研究的目的是将OC 基因转入烟草叶
绿体中, 研究其表达及转基因植株表型变化, 为进
一步利用OC 基因提供依据。本研究将OC 基因转
入烟草叶绿体并得到表达尚未见报道。Ξ 基金项目: 国家自然科学基金资助 (39570361)
作者简介: 苏宁 (19692) , 女, 河北保定人, 副研究员, 博士, 主要从事植物分子生物学研究。
Received on (收稿日期) : 2001202208, A ccep ted on (接受日期) : 2001207223

1　材料与方法
1. 1　材料
1. 1. 1　植物材料　　大烟草 (N icotiana tabacum
var. d ay any ie)为中国农科院烟草所提供。
1. 1. 2　菌株与质粒　　大肠杆菌DH 5Α、克隆载体
pGEM 27Zf (2)、pUOC (含OC 基因)、pSS1 (含启动
子、终止子、aadA 表达盒)由本室保存; pZS197 (含
同源片段 rbcL 和OR F 512) 由美国新泽西州立大学
PalM aliga 教授惠赠。
1. 1. 3　各种限制性内切酶、K lenow 酶、T 4DNA 连
接酶、DNA 回收试剂盒、探针标记试剂盒等均购
自美国 P rom ega 公司; 硝酸纤维素膜为Am ershan
公司产品; 同位素 Α232P2dA T P 购自北京亚辉公司;
其它试剂均为国产或进口分析纯。
1. 2　方法
1. 2. 1　植物表达体系构建　　参照 Sam brook 等[ 4 ]
分子克隆方法。
1. 2. 2　DNA 片段回收　　参照 P rom ega 公司回收
试剂盒说明书进行操作。
1. 2. 3　基因枪转化　　参照D aniell H [ 5 ]方法制备
金粉ö载体 DNA 子弹; 采用美国 B io2R ad 公司
M odel PD S21000öH e 基因枪轰击烟草叶片; 采用参
数为: 真空度25inches. H g, 轰击距离为9 cm , 可裂
膜为1100 p si、金粉颗粒直径1. 0 Λm; 轰击生长于
M S0无菌烟草幼苗叶片 (直径约3 cm ) , 并将叶片置
于光照培养箱 (25℃) 2天后, 切成5 mm 见方的小
片, 放在选择分化培养基 (M S0+ 0. 15 m göL IAA +
1. 5 m göL 62BA + 500 m göL Spc)上培养, 待愈伤长
出幼芽后, 再转入选择生根培养基 (M S0+ 500 m gö
L Spc)中, 再生出小植株后, 移至温室。
1. 2. 4　Southern 检测　　 (1) 烟草叶绿体DNA 提
取　　采用高离子浓度低pH 法[ 6 ]。(2) 转膜: 采用
B io2R ad M odel 785 V acuum blo tter system 于
5inches. H g 压力下转移30 m in。 (3) 探针标记: 采
用随机引物法制备 Α232P2dA T P 标记的DNA 探针;
Southern 杂交方法参照 Sam brook 等[ 4 ]方法进行。
1. 2. 5　W estern 检测　　提取植株总蛋白, 参照
P rom ega 公司试剂盒说明书操作。
1. 2. 6　转基因植株抗虫性测试　　将转基因烟草
叶片饲喂经饥饿处理的1龄棉铃虫 (H elicoverp a
zea) , 观察昆虫生长发育状况。
1. 2. 7　转基因植株后代表型分析　　将转基因烟
草分别作为母本和父本与野生型烟草杂交, 收获种
子, 将转基因植株种子和杂交种子消毒后, 放于含
500 m göL 壮观霉素的M S 抗性培养基中萌发, 观
察生长状况。
2　结果与分析
2. 1　烟草叶绿体转化载体 pZOC 构建
将 pUOC 经 E coR É 单酶切, 回收 0. 65 kb
DNA 片段, 克隆到 pGEM 27Zf (2) 中, 得到 pGOC,
并进行序列分析, 分析结果表明: 本文所利用的
OC 基因与 Keiko A be[ 7 ]发表的OC 基因同源性达到
98% ; 将 pGOC 用 Sm aÉ、X hoÉ 双酶切后回收,
与 pSS1经 H indË 酶切后用 K lenow 补平, 再经 S alÉ 酶切回收的大片段 (约4. 76 kb) 连接, 得到质粒
pSOC, 该质粒含有OC 基因表达盒和抗性筛选表达
盒 (aadA cassette) ; pSOC 经B am H É 酶切, 回收片
段后克隆到含有同源片段的 pZS197 B am H É 位点
上, 构建成转化载体 pZOC, 如图1所示。
2. 2　基因枪转化烟草叶绿体及再生植株的获得
将 pZOC 质粒DNA 金粉子弹轰击过的烟草叶
片切成小块, 放于M S 选择分化培养基中, 约2周小
叶块开始逐渐由绿变白, 继续培养约5～ 8周后, 在
叶块边缘长出绿色小芽, 待绿芽长大后切下, 移入
M S 选择生根培养基中, 约3～ 4周后, 可长成小植
株, 炼苗后, 移入温室培养。
图1　烟草叶绿体转化载体 pZOC 结构图
F ig. 1　Schem atic diagram of tobacco chlorop last transform ation vector pZOC
2. 3　转基因植株 Southern 检测
分别以 E coR É 消化质粒 pZOC (阳性对照)、未 转基因植株叶绿体DNA (阴性对照)、转基因植株叶绿体DNA , 电泳, 以 E coR É 消化质粒 pUOC 回
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收的0. 65 kb OC 片段为探针, 进行杂交。结果表
明: 转基因植株可出现一条与阳性对照 (约0. 65
kb) 大小相等的杂交带, 而未转基因植株则没有杂
交带出现, 5号转基因植物杂交带较弱, 可能与同
质化程度低有关 (见图2)。
图2　转基因植株叶绿体DNA Southern 检测
F ig. 2　Southern blo t of ch lorop last DNA
iso lated from transgenic tobacco.
1. 阳性对照, 2. 阴性对照, 3～ 6. 转基因植物
1. Positive contro l; 2. N egative contro l; 3～ 6. T ransform ed p lants
2. 4　转基因植株W estern 检测
分别提取水稻种子总蛋白、野生型和转基因烟
草植株总蛋白, 以水稻种子总蛋白提取物 (富含水
稻巯基蛋白酶抑制剂) 为阳性对照, 以野生型为阴
性对照, 进行W estern 检测, 结果转基因植株检测
到了蛋白表达, 并且其分子量大小与阳性对照相一
致 (见图3)。
图3　转基因植株W estern 检测
F ig. 3　W estern blo t analysis of transgenic tobaccos
1. 阳性对照　 2. 阴性对照　 3～ 4. 转基因植株
1. Positive contro l　 2. N egative contro l　 3～ 4. T ransgenic p lants
2. 5　转基因植株抗虫性测试
选取具有蛋白酶活性, 且 Southern 检测呈阳性
的转基因植株叶片进行杀虫实验, 以未转基因植株
为对照, 每株做3组, 每组喂养5条1龄棉铃虫。从表
1可以看出: 对照未转基因烟草叶片饲喂的棉铃虫
幼虫生长发育正常, 体重有明显增加, 比接虫前平
均体重增加20倍左右, 而转基因烟草叶片饲喂的棉
铃虫幼虫体重增加幅度较小, 为接虫前体重的9. 4
～ 12. 1倍 (见图4)。
2. 6　转基因植株后代表型分析
2. 6. 1　转基因植株种子　　将转基因烟草收获种
子, 种子消毒后, 在含有500 m göL 壮观霉素的M S
培养基中培养, 结果转基因植株种子在含抗生素培
表1　转基因烟草叶片抗虫测试
Table 1　Insectic ida l activ ity of transgen ic plants to H elicoverpa zea
P lant
O riginal w eigh t of
insects(m g)
A verage w eigh t of
survivals(m g)
Death rate
(% )
S3 1. 1±0. 1 8. 3±1. 2 46
S8 1. 1±0. 1 11. 5±3. 0 20
S15 1. 1±0. 1 7. 4±2. 5 50
CK 1. 1±0. 1 23±3. 4 0
图4　取食转基因植株和未转基因植株的棉铃虫
F ig. 4　H elicoverpa zea fed on leaves of transgenic
and untransgenic tobacco
养基中萌发后呈绿色幼苗, 而未转基因植株种子在
含抗生素培养基中萌发呈白色幼苗 (见图5) , 表明
aadA 基因已遗传给子代种子
2. 6. 2　转基因植株杂交种子　　待转基因烟草开
花后, 分别以转基因植株为母本或父本, 与野生型
烟草进行杂交实验。将收获的杂交种子消毒后, 在
含有500 m göL 壮观霉素的M S 培养基中萌发。结
果以转基因植株为母本, 野生型烟草为父本的杂交
种子在抗性培养基中萌发为绿色幼苗, 以转基因植
株为父本, 野生型烟草为母本的杂交种子在抗性培
养基中萌发为白色幼苗 (见图5)。试验结果表明叶
绿体遗传为非孟德尔遗传, 即外源基因在叶绿体中
遵循单亲母系遗传规律, 遗传性状通过母本直接遗
传给后代。
3　讨论与结论
叶绿体转化是近十年才开始兴起的一种新技
术, 与常规细胞核转化体系相比, 具有叶绿体基因
组较小、结构相对简单、易于操作等优点; 由于转
基因是通过同源重组实现的, 因此叶绿体转化为定
点整合, 且不存在位置效应, 这使外源基因的表达
相对稳定。基因工程环境安全性问题一直是人们关
注的焦点, 而叶绿体转化为母系遗传, 外源基因不
会随花粉传播, 不会产生外源基因的漂移。
3033期　　　　　　　　　　　　苏　宁等: 水稻巯基蛋白酶抑制剂基因在烟草叶绿体中的表达　　　　　　　　　　　　

图5　转基因植株后代及杂交后代种子在壮观霉素 (500 m göL )培养基上萌发
F ig. 5　The seedlings and hybrid seedlings of p lastid transgenic tobacco on M S m edium containing 500 m göL
spectinom ycin ( resistant seedlings are green; sensitive seedlings are bleached on the selective m edium ).
A. 在抗性培养基中生长的野生型烟草种子; B. 在抗性培养基中生长的以野生型为母本和转基因植物为父本杂交种子;
C. 在不含抗生素培养基中生长的野生型种子; D. 在抗性培养基中生长的转基因植物为母本和野生型为
父本杂交种子; E. 在抗性培养基中生长的转基因植物种子
A. W ild2type tobacco seeds on the selective m edium; B: The seeds of w ild2type fem ale×transgenic m ale on the selective m edium;
C: W ild2type tobacco seeds on M S m edium in the absence of spectinom ycin; D: The seeds of transgenic fem ale×w ild2
type m ale on the selective m edium; E: transgenic2selfed seeds on the selective m edium.
　　植物蛋白酶抑制剂可抑制昆虫消化道蛋白酶,
使昆虫生长发育不良甚至死亡, 本文将水稻巯基蛋
白酶抑制剂 (OC ) 基因转化烟草叶绿体, 其表达产
物具有杀虫活性, 为进一步利用OC 基因转化水稻
等高等植物提供依据。在转基因植株叶片饲喂的棉
铃虫幼虫之所以体积也有一定的增加, 是因为水稻
巯基蛋白酶抑制剂主要是作用虫体消化道, 使其产
生厌食, 从而抑制棉铃虫生长。另外转基因植株杀
虫活性表现不一, 这可能与叶绿体基因组的高拷贝
有关, 一般来说显花植物每个叶肉细胞中约有100
个叶绿体, 每个叶绿体中均含有100多个叶绿体基因
组拷贝, 野生型叶绿体全部被外源基因取代, 即叶绿
体转化中常提到的同质化问题是保证外源基因高效
表达的关键, 正是由于野生型叶绿体被外源基因取
代的程度不同, 从而使其表现出不同的杀虫活性。同
质化问题也是叶绿体转化亟待解决的难题之一。
转化多个抗虫基因到植物中以防止害虫产生抗
性, 是近年来抗虫植物基因工程的新策略。本实验室
已获得了转化烟草叶绿体双价抗虫基因 (B t 和OC )
烟草植株, 并证明转双价基因烟草比转单基因烟草
具有更强的杀虫活性, 这部分工作将另文发表。
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