全 文 ：·综述与专论· 2012年第1期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
收稿日期 : 2011-09-06
基金项目 : 国家自然科学基金项目（31070139）
作者简介 : 王金辉 , 男 , 硕士 , 研究方向 : 叶绿体基因工程 ; E-mail:zzwangjinhui123@126.com
通讯作者 : 沈桂芳 , 教授 , 研究方向 : 叶绿体基因工程 ; E-mail:gfsh2008@caas.net.cn
叶绿体转化体系研究进展
王金辉 李轶女 倪丕冲 王国增 张志芳 沈桂芳
（中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081）
摘 要: 叶绿体转化具有表达效率高，安全性高，遗传稳定，以及多基因可以同时转化等特点。真核或原核的外源基因都能
在叶绿体中进行成功表达，至少有 20 种植物成功的进行了叶绿体转化。叶绿体作为生物反应器具有广阔的应用前景。
关键词: 叶绿体转化 物种 叶绿体 生物反应器
Research of Chloroplast Transformation System
Wang Jinhui Li Yin Ni Pichong Wang Guozeng Zhang Zhifang Shen Guifang
（Biotechnology Research Institute， CAAS， Beijing 100081）
Abstract: Chloroplast transformation has several advantages, including high expression efficiency, high safety, stable transformation, and
multiple genes in a single transformation event. Eukaryotic and prokaryotic foreign genes have been expressed successfully in the chloroplast,
and more than twenty kinds of plants have been succeed in chloroplast transformation. It is noticeable that chloroplast, as a reactor, has gained
an extensive application prospect.
Key words: Chloroplast transformation Species Chloroplast Bioreactor
叶绿体是植物重要的光合器官，广泛存在于植
物的细胞和真核藻类中，为有机体生存、繁殖和发
展提供最初的能源，同时释放氧气，合成淀粉、脂
类、氨基酸和色素等。叶绿体是具有核外遗传物质，
并且具有转录和翻译机制的细胞器之一，基因组大
约在 120-180 kb 之间，环形双链的 DNA，包括大的
单拷贝区、小的单拷贝区和两个方向重复区［1］。叶
绿体也是理想的外源基因表达的受体，外源基因同
源重组到叶绿体的基因组中，可以在叶绿体中高效
表达［2］。近年来，叶绿体转化表现出巨大的应用前
景，用于改良作物的形状，作为生物反应器生产疫苗、
药物和工业产品等，也被应用到基础研究中，研究
叶绿体基因组的转录、mRNA 编辑、光合作用和进
化等［3］。
1 叶绿体转化的物种
1.1 衣藻
衣藻是真核单细胞生物，其结构简单，遗传背
景清楚，易于培养，利于遗传操作和工业生产，被
称为“绿色酵母”。1988 年，Boynton 等［4］首次利用
基因枪法将带有 atpB 野生型基因的叶绿体 DNA 轰
击了 atpB 突变的衣藻，使其恢复了光合作用的能力，
从而标志着叶绿体基因工程的开始。Goldschmidt 等［5］
于 1991 年成功实现将 aadA 基因作为筛选标记来获
得转入目的基因的莱茵衣藻转化子，很大程度上提
高了叶绿转化的效率。
随着衣藻叶绿体转化技术的日益成熟，衣藻叶
绿体作为一种生物反应器，具有很多其他生物反应
器所不具备的优点。首先，表达量高。试验证明藻
青蛋白（apcA 和 apcB）在莱茵衣藻叶绿体的表达量
占可溶性蛋白总量的 2%-3%［6］，从而表明叶绿体表
达体系高表达量的优越性 ；其次，叶绿体具有原核
性，但也能表达真核蛋白质，并且对表达后蛋白质
进行加工，表达产物以活性形式积累。Mayfield 等［7］
根据莱茵衣藻密码子偏爱性合成了编码 IgA 抗疱疹
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第1期2
抗体的基因（hsv8Isc），在莱茵衣藻叶绿体中表达了
折叠正确的可溶的有活性的蛋白。Dreesen 等［8］将
葡萄球菌的 D2 纤维连接蛋白结构域与霍乱毒素的 B
亚基融合（CTB-D2）在衣藻叶绿体中表达，口服表
达抗原疫苗的小鼠中，80% 的小鼠可以抵御金黄色
葡萄球菌的感染，表达的产物比较稳定，可以在室
温保存至少一年半。
赵雅坤等［9］在衣藻叶绿体中成功实现了人白
细胞介素 4（hIL4）的高效表达。1999 年，张中林
等［10］利用基因枪法将丙肝病毒融合抗原基因 NS3-C
在衣藻叶绿体中表达。试验结果证明 , 用衣藻叶绿
体作为生物反应器生产医药蛋白是可行的。杨宗岐
等［11］在衣藻叶绿体中表达来源于 Pyrococcus furiosus
的耐高温 α-淀粉酶，酶活检测表明，转基因衣藻表
达产物具有耐高温 α-淀粉酶活性，鲜重衣藻最高达
77.5 U/g。该结果表明，完全可用莱茵衣藻作为生
物反应器实现超耐热酸性 α-淀粉酶的工业化生产。
Kruse 等［12］利用基因工程手段使转基因莱茵衣藻产
生氢气，从而使通过基因工程的手段生产清洁能源
成为可能。
1.2 茄科植物
1990 年，有研究者首次利用基因枪法将 rrn16
基因在烟草叶绿体中得到表达，拉开了高等植物叶
绿 体 转 化 的 帷 幕［13］。Golds 等［14］ 用 PEG 法 也 将
rrn16 基因转化到烟草叶绿体中，探索出了一个稳定
叶绿体转化的方法。1993 年，Carrer 等［15］报道了
利用卡那霉素基因作为烟草叶绿体转化的筛选标记，
转基因植株的新霉素磷酸转移酶（NPT Ⅱ）占细胞
总蛋白的 1%。叶绿体转录的 mRNA 以多顺反子为主，
将无启动子的 uidA 基因插入叶绿体 rbcL 基因的下
游，由于 rbcL 基因的终止子的效率不高，转录出了
包含 uidA 基因的多顺反子。uidA 基因在叶绿体中得
到了较高的表达，表达产物 GUS 在转基因植株中得
到了较高水平的积累，证明在叶绿体中离启动子较
远的顺反子也可以有效地翻译［16］。
由于植物受哺乳类病毒污染的风险小，成本低，
可以大面积种植，所以用植物作为生物反应器生产
人类的医用蛋白成为一个研究的热点。Staub 等［17］
将人类的生长素基因转入烟草的叶绿体基因组中，
表达出了可溶性，具有生物活性，二硫键正确的蛋
白，高浓度的可溶性蛋白占叶绿体可溶性的 7% 以上，
是核转化表达量的 300 倍。结果证明叶绿体是一种
高效的人类医药蛋白的生物反应器。
为了研究在植物抗逆过程中活性氧（ROS）清
除系统具有调控抗氧化酶活性的功能，Le Martret
等［18］将脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）、谷胱甘肽
转移酶 （GST） 和谷胱甘肽还原酶 （GR）3 个基因重
组到烟草的叶绿体基因组中，过量表达这 3 种酶，
氧胁迫、高盐、冷，以及重金属胁迫转化植株，发
现在叶绿体中增强部分的抗氧化途径可以提高植物
非生物胁迫的耐受能力。
烟草叶片的再生能力强，可以直接在叶片上进
行叶绿体和同质化等，所以烟草的叶绿体转化比较
成熟，取得了较大的进展。人们也相继成功地进行
了了茄科植物马铃薯、番茄和茄子的叶绿体转化。
Sidorov 等［19］利用烟草的叶绿体转化载体成功的转
化了马铃薯，将 aadA 和 gfp 基因重组到马铃薯叶绿
体基因组中。2001 年，Ruf 等［20］在番茄（Lycopersicon
esculentum）的叶绿体转化中取得了成功，将 aadA
基因转化到叶绿体基因组中，外源基因表达量占可
溶性蛋白的 40% 以上，为利用番茄表达口服疫苗、
抗体及药物等奠定了基础。2010 年，Singh 等［21］利
用烟草叶绿体的叶绿体转化载体 trnV-rps7/12 成功的
将筛选标记基因 aadA 重组到茄子的叶绿体中，为改
良茄子的性状提供了一种新的转化方法。叶绿体基
因组比较保守，茄科植物的叶绿体转化大部分都是
利用烟草叶绿体的同源片段进行重组的。
1.3 禾本科植物
水稻、玉米及小麦等禾本科植物是重要的粮食
作物，但是叶绿体转化技术在禾本科植物的应用进
展较缓慢，受限制的主要原因可能是通过幼胚诱导
的愈伤组织，前质体与叶绿体基因组的表达调控不
相同，外源基因同源重组的效率低 ；禾本科植物
的叶片再生能力弱，叶绿体转化同质化比较困难。
2006 年，Lee 等［22］首次将 gfp 和 aadA 基因成功重
组到水稻（Oryza sativa）叶绿体基因组中，为叶绿
体转化技术在禾本科植物中的应用奠定了基础。李
轶女等［23］选择 ndhF 与 trnL 的基因间序列作为除
2012年第1期 3王金辉等 ：叶绿体转化体系研究进展
草剂 PPT 抗性基因 bar 定点整合的位点，将 bar 基
因重组到水稻叶绿体基因中，bar 基因在水稻基因
组中正常的表达，既提高了水稻抗 PPT 的能力，又
可以作为转化的筛选标记。Cui 等［24］利用基因枪法
将 gfp 和 npt Ⅱ基因转化小麦未成熟盾片和花序，培
养获得了转化植株，为叶绿体转化技术成功的应用
到禾本科植物培育新的品种奠定了基础。由于禾本
科植物对壮观霉素具有天然的抗性，所以一般不用
aadA 作为筛选标记基因，而 Lee 等［22］利用链霉素
对转化的水稻愈伤进行筛选。
1.4 油料作物
大豆作为一种重要的油料作物，培育优良的大
豆新品种一直是人们研究的热点。自 1996 年孟山都
公司开发的抗草甘膦大豆 GTS40-3-2 首次销售，到
目前为止已经有超过 1 000 个商业化的抗草甘膦大
豆品种。由于核转化的生物安全性令人担忧，转基
因大豆会通过“基因漂移”而破坏非转基因大豆的
原始基因，从而造成生态危害，而叶绿体转化的生
物安全性高，可能会很好地解决基因漂移的现象。
Dufourmantel 等［25］利用基因枪法成功的转化了大豆，
将 aadA 基因重组到大豆叶绿体基因组中。
McBride 等［26］将融合的抗虫的 cry1Ac 基因转
化到烟草叶绿体中，表达量占可溶性蛋白的 3%-5%，
Hou 等［27］将 aadA 基因和抗虫的 cry1Ac 基因一起转
化到油菜的叶绿体基因中，获得的转化植株有比较
良好的抗虫性。2003 年，Skarjinskaia 等［28］在油料
作物 Lesquerella fendleri 中也成功进行了叶绿体转化，
将 aadA 和 gfp 基因重组到叶绿体基因组中。
1.5 其他
Sikdar 等［29］ 利 用 基 因 枪 法 转 化 拟 南 芥
（Arabidopsis thaliana）叶绿体基因组，获得抗壮观
霉素的转化植株。Chiyoda 等［30］建立了简单有效的
地钱叶绿体转化体系，成功对培养的地钱悬浮细胞
进行转化，将 aadA 基因表达盒重组到地钱叶绿体
trnI/trnA 位点，aadA 基因表达盒中的启动子是烟草
叶绿体 Prrn，终止子是烟草叶绿体 TPsbA。
2008 年，De Marchis 等［31］利用 aadA 基因作为
筛选标记，gfp 基因作为叶绿体转化的检测标记，将
aadA 和 gfp 基因的表达盒成功地重组到甜菜叶绿体
基因组 rrn16/rps12 位点，检测发现 gfp 基因在甜菜
叶绿体中有较高水平的表达。
已经成功进行叶绿体转化的物种有胡萝卜［32］、
棉花［33］、矮牵牛［34］、西兰花［35］、莴苣［36, 37］、杨树［38］
和甘蓝［39］等。
物种 外源基因 启动子 终止子 同源片段 参考文献
衣藻 atpB [3]
烟草 rrn16 [13]
拟南芥 aadA Prrn TpsbA trnV-rps12/7 [29]
马铃薯 aadA/gfp PrrnPpsbA
TpsbA
Trps16
rbcL-accD
rrn16-rps7/3-rps12 [19]
番茄 aadA Prrn TpsbA psaB-psbC/D [20]
油菜 aadA/cry1Aa10 Prrn TpsbA rps7-ndhB [27]Lesquerella fendleri aadA/gfp PrrnLrbcL 优化 TpsbA rrn16-trnV-rps12/7 [28]
胡萝卜 dehydrogenase (badh/aadA Prrn TpsbATrps16 rrn16S/trnI-trnA/rrn23S [32]
棉花 aphA-6 Prrn Trps16 rrn16S/trnI-trnA/ rrn 23S [33]
大豆 aadA Prrn TpsbA trnV-rps12/7 [25]
矮牵牛花 aadA/gusA prrn TpsbcTpsbA accD-rbcL [34]
莴苣 aadA/gfp Prrn TpsbATrrnB rrn 16S/trnI-trnA/ rrn 23S [36]
西兰花 gus /aadA prrn TpsbA rbcL-accD [35]
白杨 aadA/gfp Prrn PpsbA TpsbATrps16 rbcL-accD [38]
水稻 aadA/gfp prrn TpsbA rrn 16S/trnI-trnA/ rrn 23S [22]
地钱 aadA Prrn TpsbA trnI-trnA [30]
甘蓝 aadA/gus Prrn TpsbA trnV-rrn16S-trnI-trnA-rrn23S [39]
甜菜 aadA/gfp Prrn PpsbA TpsbA rrn16-rps12 [31]
茄子 aadA PpsbA TpsbA trnV-rps12/7 [21]
小麦 nptII/gfp Prrn TpsbA atpB-rbcL [24]
表 1 首次成功进行叶绿体转化的物种
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第1期4
2 讨论
与核转化相比，叶绿体转化的最大特点是表
达量高、安全性高。显花植物每个叶肉细胞含有约
10 000 个叶绿体基因组拷贝，如果完全同质化并有
强启动子存在，外源基因可以得到高效的表达，同
时叶绿体对外源基因的表达有很强的承受能力。人
血清白蛋白在烟草叶绿体中表达量占可溶性总蛋白
的 11.1%，比核转化的表达量高 500 倍［40］。但是，
由于叶绿体的拷贝数高，同质化是叶绿体转化亟待
解决的问题之一，必须不断的增加筛选压，提高同
质化程度。叶绿体是母系遗传，外源基因不会随花
粉传播，造成基因漂移。Ruf 等［41］研究发现 , 有极
低水平的父本基因泄露，其中基因进入到 F1 后代子
叶中的频率是 1.58×10-5，而进入到顶端分生组织的
频率是 2.86×10-6。叶绿体转化定点插入，遗传稳定
性好，不会出现性状分离的现象 ；可以直接表达来
自原核的基因 ；叶绿体基因组具有原核性叶绿体基
因组多顺反子转录、基因排列、调控方式及密码子
的偏爱性等与原核性很相似 ；叶绿体的原核性利于
原核来源基因的表达，真核基因在叶绿体基因中也
能很好的表达。
叶绿体转化成为继核转化之后又一个高效的技
术，在衣藻、烟草等 20 种植物中都取得了成功，其
中至少有 40 种外源基因在烟草叶绿体中进行了成功
表达［42］。由于衣藻易于培养，生长周期短，转化效
率高等，所以外源基因成功转化衣藻叶绿体的报道
最多，一般利用衣藻作为生物反应器表达外源基因。
在高等植物中，茄科植物成功进行叶绿体转化的物
种比较多，模式植物烟草的再生能力强，转化效率
高，所以比较容易进行叶绿体转化。由于叶绿体基
因组比较保守，同一科内叶绿体基因组的差异很小，
番茄（S. lycopersicum）和马铃薯（S. bulbocastanum）
叶绿体基因组的差异为 0.6%，颠茄（A. belladonna）
与茄属和烟草属内物种叶绿体基因组差异不超过
2%［43］，所以马铃薯、番茄等利用烟草的同源片段、
启动子和终止子也成功进行了叶绿体转化。番茄、
甘蓝等蔬菜成功进行叶绿体转化为利用叶绿体转化
改良蔬菜的营养品质奠定了基础。由于水稻、玉米
等禾本科植物的外植体的再生能力比较差，必须经
通过幼胚诱导的愈伤组织才能再分化，再分化的能
力受到愈伤质量的限制，叶绿体转化后同质化比较
困难，所以叶绿体转化在禾本科植物中进展的比较
缓慢。由于禾本科植物愈伤诱导技术已经比较成熟，
为叶绿体转化奠定了基础，在重要粮食作物水稻、
小麦中取得成功为叶绿体在农业生产中的应用奠定
了基础，可以利用叶绿体转化培育抗虫、抗除草剂、
抗病等作物新品种。
随着分子生物学的发展，尤其是测序技术的进
步，对叶绿体基因组的研究逐渐深入，到目前为止，
已经公布了 235 组真核生物叶绿体基因组，这其中
包括同一种的不同亚种。大量植物叶绿体基因组测
序，可以根据植物的叶绿体基因组设计特异的叶绿
体同源载体，提高同源重组效率，同时为叶绿体在
更多物种中的应用奠定了基础。叶绿体转化作为一
项安全高效的体系，越来越受到重视，成功进行叶
绿体转化的物种也在不断增加，势必为利用植物表
达外源基因提供一个理想的平台。
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（责任编辑 狄艳红）