全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(11): 1949−1957 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)(2002AA213051), 国家自然科学基金项目(30900914), 北京市自然科学基金项目(5062012), 陕西
省教育厅自然科学专项(09JK777)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 黄丛林, E-mail: conglinh@126.com
第一作者联系方式: E-mail: wangyh@nwu.edu.cn
Received(收稿日期): 2009-04-14; Accepted(接受日期): 2009-07-25.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.01949
phaG和 phaC基因在烟草叶绿体中的转化及其遗传分析
王玉华1 吴忠义2 张秀海2 王永勤2 黄丛林2,* 贾敬芬1
1 西北大学生命科学学院/陕西省生物技术重点实验室 / 西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室, 陕西西安 710069; 2 北京
市农林科学院北京农业生物技术研究中心, 北京 100097
摘 要: 中长链羟基脂肪酸聚酯(medium-chain-length-PHAs, mcl-PHAs) 属于微生物聚酯。羟酰-CoA-ACP-转移酶和
II型PHA合酶是mcl-PHAs生物合成途径中的两个关键酶。将编码羟酰-CoA-ACP-转移酶的基因phaG与水稻叶绿体
psbA基因的启动子和终止子连接构建表达盒RpsbA-pro-phaG-RpsbA-ter, 将II型PHA合酶的基因phaC与水稻叶绿体
16S rRNA基因的强启动子Prrn及rbcL基因的终止子连接构建表达盒prrn-phaC-RrbcL-ter, 连同壮观霉素抗性基因aadA
表达盒prrn-aadA-TpsbA-ter一起克隆进烟草叶绿体基因组同源片段 rbcL和accD之间 , 得到烟草叶绿体表达载体
pTGC。用包裹有质粒pTGC的金粉子弹轰击烟草无菌苗叶片, 经壮观霉素筛选后获得 6 株叶绿体型转基因植株。对
T0代和T1代转基因植株进行PCR检测和Southern blot分析表明, 外源基因已整合进烟草叶绿体基因组中, 且T1代转基
因植株已同质化。RT-PCR分析结果证实外源基因已在转录水平上表达。转基因植株的自交及正反交结果表明, 外源
基因在转基因后代中能够稳定遗传, 遗传方式遵循母性遗传规律, 不存在转基因的花粉漂移现象。
关键词: 烟草; 叶绿体转化; phaG和 phaC; 遗传分析
Transformation of phaG and phaC Genes into Tobacco Chloroplast Ge-
nome and Genetic Analysis
WANG Yu-Hua1, WU Zhong-Yi2, ZHANG Xiu-Hai2, WANG Yong-Qin2, HUANG Cong-Lin2,*, and JIA
Jing-Fen1
1 College of Life Sciences, Northwest University / Shaanxi Provincial Key Laboratory of Biotechnology / Key Laboratory of Resource Biology and
Biotechnology in Western China, Xi’an 710069, China; 2 Beijing Agro-Biotechnology Research Center, Beijing Academy of Agriculture and Forestry
Sciences, Beijing 100097, China
Abstract: Polyhydroxyalkanoates (PHAs) belong to the group of microbial polyesters, which are a class of polymers produced by
various species of bacteria as source of carbon and energy reserve. Due to their properties of biodegradable thermoplastics and
elastomers, PHAs have been regarded as ideal alternatives to traditional petroleum-derived plastics in medical areas and many
other areas of high technology and high-value. Compared with short-chain-length-PHAs (scl-PHAs), such as polyhydroxybutyrate
(PHB), medium-chain-length-PHAs (mcl-PHAs) copolymers are less crystalline, and are more flexible polymers with low melting
points, and generally regarded as elastomers. PHAs were produced commercially by bacterial fermentation method, but the proc-
ess was not economically competitive with petrochemical-based polymers. At present, novel efforts are focused on using the
transgenic plants as bioreactors to produce PHAs. Both 3-hydroxyacyl-CoA-ACP-transferase and type II PHA synthase are the
key enzymes for mcl-PHAs biosynthesis. The gene phaG encoding 3-hydroxyacyl-CoA-ACP-transferase was placed under the
control of psbA-pro and psbA-ter of rice to construct phaG expression cassette, and the gene phaC encoding type II PHA synthase
was placed under the control of prrn and rbcL-ter of rice to construct phaC expression cassette, which were ligated with the
screening marker gene aadA expression cassette prrn-aadA-TpsbA-ter. These recombined fragments were cloned between the
plastid rbcL and accD genes of tobacco for targeting to the large single copy region of chloroplast genome. Chloroplast expression
vector of pTGC was constructed and then transformed into tobacco chloroplast genome through particle bombardment. Six trans-
plastomic tobacco plants were obtained by spectinomycin screening. PCR and Southern blot analysis confirmed integration of
phaG and phaC genes into chloroplast genome of T0 and T1 transgenic plants, and T1 transgenic plants exhibited homogenization.
1950 作 物 学 报 第 35卷

The expression of phaC and phaG at transcription level was detected by reverse transcriptase–polymerase chain reaction
(RT-PCR). Recombinant transgenes in the tobacco chloroplast genome were maternally inherited and were not transmitted via
pollen when out-crossed with untransformed female plants.
Keywords: Tobacco; Chloroplast genetic transformation; phaG and phaC; Maternally inheritance; Genetic analysis
羟基脂肪酸聚酯(polyhydroxyalkanoates, PHAs)
是微生物在碳、氮营养失衡时, 在体内合成并积累
的细胞碳源或能源贮存颗粒, 当环境营养条件恢复
时这些颗粒可被微生物分解利用 [1]。由于其具有生
物降解性、生物相容性、压电性等, PHAs已成为生
物材料的研究热点。PHAs含有不同长度碳链的单体
侧链基团, 根据单体碳原子数的不同被划分为两大
类 , 即由 3~5 个碳原子的单体组成的短链PHAs
(short-chainlength-polyhydroxyalkanoate, scl-PHA)和
由 6~18 个碳原子的单体组成的中长链PHAs (me-
dium-chain-length-polyhydroxyalkanoate, mcl-
PHA)[2], 其中mcl-PHA是结晶度很低的弹性体 , 在
药物释放及组织工程等方面具有很广阔的应用前景。
mcl-PHAs 在细菌中的合成主要存在两条途径,
即由脂肪酸 β-氧化途径的中间产物参与的合成途径,
以及与脂肪酸从头合成途径相偶联的合成途径, 后
一途径需要由 phaG 基因编码的羟酰-CoA-ACP-转
移酶和由 phaC 基因编码的 II 型 PHA 合酶共同参
与[3]。目前, 通过细菌发酵法已初步实现PHAs的商
品化, 但高昂的生产成本阻滞了其大规模工业化生
产, 因此, 近年来对PHAs的研究工作主要集中在如
何降低其生产成本上。植物体脂肪酸代谢可为PHAs
的合成提供底物乙酰-CoA(合成scl-PHAs)和R-3-羟
脂酰-CoA(合成mcl-PHAs), 但植物体内并没有发现
其生物合成的完整途径。因此可以利用基因工程手
段将合成PHAs的关键酶基因转入植物, 利用植物作
生物反应器生产PHAs。Poirier等[4]率先在拟南芥细
胞质中进行聚-3-羟基丁酸酯(poly-3-hydroxybut-
yrate, PHB)合成尝试, 之后又有多个研究小组尝试
以不同的方式, 利用植物来表达PHAs, 包括将基因
产物定位到乙酰CoA丰富的白色体 [5]和过氧化物酶
体 [6]。虽然上述研究都获得了一定量的PHAs表达 ,
但远未达到商业化生产的水平。限制PHAs在转基因
植物中积累的一个瓶颈很可能是来自原核的外源目
的基因与真核表达体系之间不能很好地相互兼容, 因
此尝试将PHAs合成基因本身而不是其表达产物直
接定位到叶绿体基因组中, 利用叶绿体基因组转录
与翻译系统的原核特性[7]来解决基因相容性问题。
本文在这一设想的基础上, 通过叶绿体转化技术尝
试将来源于微生物的、未经修饰的mcl-PHAs合成关
键酶基因phaG和phaC导入烟草叶绿体中, 研究其直
接表达的可行性及转基因植株的遗传特性和生物安
全性。
1 材料与方法
1.1 试验设计
选用烟草(Nicotiana tobacum L.)品种 Wisconsin
38 无菌苗, 在不含激素的 MS 固体培养基中培养,
每 4 周切取茎段继代一次, 无菌苗生长到 4~6 叶期
时用于转化试验。水稻品种日本晴(Oryza sativa cv.
Ribenqing)种子由北京市农林科学院小麦中心洪利
方先生惠赠, 水稻种子先用 50℃左右的水浸泡 30
min, 然后播种于草碳土∶蛭石=1∶1 的营养土中,
让其萌发成苗, 取成熟叶片提取叶绿体 DNA。
1.2 质粒和菌株
含 phaG基因(编码羟酰-CoA-ACP-转移酶)的质
粒 pLGYS13及含 phaC基因(编码 PHA合酶)的质粒
pGEM-YS13-C2 由清华大学陈国强教授惠赠; 含筛
选标记基因 aadA (编码氨基糖苷-3′-磷酸转移酶)的
质粒载体 pTRV-PHB、含烟草叶绿体同源片段的质
粒载体 pTLD及大肠杆菌(E. coli) DH5α由北京农业
生物技术研究中心保存。
1.3 叶绿体基因启动子和终止子的克隆
参考 NCBI 上公布的叶绿体表达载体 pVSR326
(AF527485)序列, 确定以水稻叶绿体 16S rRNA基因
的强启动子 Prrn和 RpsbA-pro (psbA基因的 5′-端调
控序列)为启动子, 以水稻叶绿体基因组的 RrbcL-ter
(rbcL 基因的 3′端调控序列)、RpsbA-ter (psbA 的基
因 3′端调控序列 )以及烟草叶绿体基因组的
TpsbA-ter (psbA 基因的 3′-端调控序列)为终止子构
建叶绿体转化载体。根据水稻和烟草叶绿体基因组
序列设计并合成引物(表 1), 以水稻叶绿体基因组
DNA为模板扩增启动子 Prrn和 RpsbA-pro以及终止
子 RpsbA-ter 和 RrbcL-ter; 以烟草叶绿体基因组
DNA为模板扩增终止子 TpsbA-ter。
1.4 烟草叶绿体表达载体的构建
综合考虑 mcl-PHAs 合成关键酶基因 phaG 和
phaC、筛选标记基因 aadA、烟草叶绿体同源片段
(T-rbcL 和 T-accD)、启动子和终止子序列的酶切图
第 11期 王玉华等: phaG和 phaC基因在烟草叶绿体中的转化及其遗传分析 1951

表 1 扩增叶绿体基因启动子和终止子所用引物序列
Table 1 Primer sequences used for amplifying chloroplast gene promoters and terminators
扩增产物
Fragment
引物名称
Primer
引物序列
Sequence of primers
包含的酶切位点
Enzyme site
Prrn Prrn-U 5′-TCAAAGCTTATCTGCTCCCCCGCC-3′ Hind III
Prrn-L 5′-GGCCTGCAGAAATCCCTCCCTACAACT-3′ Pst I
RpsbA-pro RpsbA-pro-U 5′-CTCGGTACCACTTTCACAGTTTCCA-3′ Kpn I
RpsbA-pro-L 5′-CAGGATCCGGTAAGATCTTG GTTTAT-3′ BamH I
RrbcL-ter RrbcL-ter-U 5′-TCAGGTACCAGACTAAGTGGATAAAAT-3′ Kpn I
RrbcL-ter-L 5′-GGCGAATTCTTGTATTTATTTATTGTAT-3′ EcoR I
RpsbA-ter RpsbA-ter-U 5′-CGCTCTAGAGGCTTTTCTGCTAACATATA-3′ Xba I
RpsbA-ter-L 5′-TAGTCG ACAAGCTTCATCATTTATTGGC-3′ Sal I
TpsbA-ter TpsbA-ter-U 5′-TATGTCGACGATCCTGGCCTAGTCT-3′ Sal I
TpsbA-ter-L 5′-GCG GGTACCTCGAATATAGCTCTTCT-3′ Kpn I

谱以及母体载体 pUC119 多克隆位点, 由母体载体
pUC119 起始, 在被克隆片段两端引入合适的酶切
位点, 随后经过一系列酶切、补平、削平、连接和
转化反应, 将各个片段与母体载体连接, 先构建包
含基本调控元件 (启动子和终止子等 )的中间载体
pARpt, 之后构建 mcl-PHAs 合成基因 phaG、phaC
表达盒和筛选标记基因 aadA表达盒, 并将它们连接
于两段叶绿体同源片段之间。
载体构建流程如图 1所示。首先, BamH I/Xba I
双酶切中间载体 pARpt, 回收大片段, 与具有相同
黏端的 phaG 基因(采用 PCR 方法从载体 pLGYS13
上扩增, 并在末端引入 BamH I/Xba I切点)连接, 得
到载体 pARpt-G。其次 , 用 PCR 方法从载体
pGEM-YS13-C2上扩增 phaC基因, 在基因上下游分
别引入 Sal I 和 Kpn I, 以此酶切位点将该基因连接
到 Prrn和 RrbcL-ter之间, 得到包含 phaC基因表达
盒的中间载体 Prrn-phaC-RrbcL-ter。将该载体用
EcoR I/Hind III双酶切, 并将黏端补平, 与经 Kpn I
酶切、黏端补平的载体 pARpt-G 连接 , 得到载体
pARpt-GC。最后, 用 Hind III 酶切载体 pARpt-GC,
回收大片段, 与经相同酶切的烟草叶绿体同源片段
载体 pTLD连接, 最终得到嵌合 phaG、phaC和 aadA
基因的烟草叶绿体表达载体 pTGC。
1.5 基因枪轰击法转化烟草叶绿体及植株再生
参照Svab和Maliga [8]的方法用Bio-Rad公司的
PSD1000/He基因枪轰击烟草无菌苗叶片, 所用参数
为: 轰击距离 9 cm, 可裂膜压力 7.58 MPa, 金粉颗
粒直径 1.0 µm。所得再生植株经 2轮 500 mg L−1壮
观霉素筛选使其达同质化, 二次筛选得到的小苗经
生根培养后移栽到温室中。使其开花、结实, 收获
种子在抗性培养基上萌发得到T1代组培苗, 为进一
步研究其同质化程度, T1代组培苗又在含有 500 mg
L−1壮观霉素的培养基上经过 1 轮抗性筛选和多次
继代。
1.6 转基因烟草的 PCR检测
根据烟草叶绿体基因组序列和 aadA(AAC77370)
序列应用 Oligo6 软件分别设计并合成如下引物, P1
为 5′-ATGGACAACTGTATGGACCGATG-3′; P2 为
5′-CGATGACGCCAACTACCTCTG-3′; P3为 5′-TGT
TCAGGAACCGGATCAAAGA-3′; P4 为 5′-CTACC
CGTGGCTTCAGGA-3′; P5 为 5′-ATAGGACCAAG
ACTGCCCATT-3′。用改进的高盐低pH法[9]提取烟草
叶绿体基因组DNA为模板, 以非转基因烟草为阴性
对照进行PCR检测(图 2)。
1.7 转基因烟草的 Southern blot分析
用限制性内切酶 Sph I 消化非转基因烟草对照
及部分转基因烟草株系的叶绿体基因组 DNA, 电泳
分离、转膜, 以经 Sph I酶切的 2.4 kb的烟草叶绿体
同源片段为探针, 按 Roche的地高辛(DIG)标记与检
测试剂盒 II说明书进行 Southern杂交。
1.8 转基因烟草的 RT-PCR检测
用 Invitrogen公司的 Trizol试剂提取转基因烟草
的总 RNA, 以筛选标记基因 aadA 的特异引物
aadA-L (5′-TTATTTGCCGACTACCTTGGTGA-3′)为
反转录的引物, 采用 Promega的M-MLV反转录酶合
成 cDNA 第一链作为 RT-PCR 的模板 , 以引物
aadA-U(5′-ACATCATTCCGTGGCGTTATC-3′)和
aadA-L进行 RT-PCR扩增, 扩增产物为 aadA的部分
片段(510 bp)。
1.9 转基因烟草的母性遗传
将叶绿体转基因烟草分别作为父本和母本与非
转基因烟草杂交, 所得种子经表面消毒灭菌后放在
含有 500 mg L−1 壮观霉素(spectinomycin, Spc)的 1/2
MS固体抗性培养基上, 使其萌发, 观察生长状况。

1952 作 物 学 报 第 35卷



图 1 烟草叶绿体表达载体 pTGC的构建
Fig. 1 Construction of chloroplast expression vector pTGC in tobacco
第 11期 王玉华等: phaG和 phaC基因在烟草叶绿体中的转化及其遗传分析 1953



图 2 烟草叶绿体同源片段(A)和转化载体 pTGC (B)结构图
Fig. 2 Schematic diagrams of chloroplast homologous fragments (A) and transformation vector pTGC(B)

2 结果与分析
2.1 烟草叶绿体转化及转化植株的筛选和再生
用包裹有质粒 pTGC 的金粉制作子弹轰击烟草
无菌苗叶片(图 3-A), 将轰击后的叶片先在MS固体
培养基中弱光下过渡培养 1周, 然后切成约 0.5 cm2
小块(图 3-B), 转入选择分化培养基(MS+6-BA 1.0
mg L−1+IBA 0.1 mg L−1+Spc 500 mg L−1)中继续培养,



图 3 基因枪转化烟草、再生植株的获得及转基因植株的表型
Fig. 3 Transformation by gene-gun, regeneration and morphology of transformed tobacco
A: 轰击前的烟草叶片在预处理培养基中; B: 轰击后的叶片切成小块放入选择分化培养基中; C: 轰击后的叶片在选择分化培
养基中培养 2周后; D: 抗性植株再生; E: 转基因植株在生根培养基上; F: 转基因植株的二次筛选; G: 二次筛选植株的再生;
H: 盆栽的转基因烟草。
A: tobacco leaves on pretreatment medium before transformation; B: little pieces of tobacco leaves on selection differentiation medium
after bombardment; C: little pieces of tobacco leaves on selection differentiation medium after two-week culture; D: shoots regeneration
from transformed leaves; E: transgenic plants on root regeneration medium; F: transgenic plants on the second round selection different-
tiation medium; G: shoots regeneration from transformed leaves after the second round selection; H: transgenic plants in pots.

1954 作 物 学 报 第 35卷

约 2周后叶片逐渐失绿变白, 并且膨大至原来的 3~4
倍(图 3-C), 继续生长 2~3 个月后, 有些叶块边缘长
出绿色小芽(图 3-D), 待小芽长到 1 cm左右转入MS
选择生根培养基(1/2MS+Spc 500 mg L−1)中(图 3-E)。
将初次筛选得到的抗性小苗叶片再切成小块 ,放入
相同的选择分化培养基中进行二次筛选(图 3-F), 约
1 个月后得到二次筛选的抗性苗(图 3-G), 经炼苗后
移入温室盆栽(图 3-H)。
2.2 转基因烟草的 PCR检测
通过外源基因两侧的同源片段与被转化的烟草
叶绿体基因组中的相应部分发生同源重组, 将外源
基因整合至叶绿体中。将上游引物 P1设在同源片段
rbcL上游 200 bp处的烟草叶绿体基因组序列上, 下
游引物 P2、P3 分别设在 aadA 基因的不同位置, 两
者相距 400 bp (图 2-B)。由图 4的 PCR结果可知, 如
预期的那样, 分别以引物对 P1~P2 和 P1~P3 扩增,
非转基因烟草均没有扩增产物, 6个转基因株系分别
扩增得到 1 854 bp和 2 272 bp的条带, 说明外源基
因已经通过同源重组的方式定点整合进入烟草的叶
绿体基因组。
众所周知, 植物细胞所含叶绿体数目众多, 不
可能通过一次转化在所有叶绿体基因组中引入外源
基因, 为了检测叶绿体型转基因烟草的同质化程度
(已整合进外源基因的叶绿体在选择压下取代野生
型叶绿体的程度), 设计合成引物P4和P5, 它们分别
位于外源基因插入位点(Hind III, 人为引入的插入
位点)两侧的烟草叶绿体同源片段上 , 两者相距约
1.2 kb (图 2)。图 5的PCR结果显示: 非转基因烟草
扩增出一条 1 194 bp的带(lane 7); T0代转基因烟草株
系同时扩增出 1 194 bp和 6 515 bp两条带(lane 1~6),
说明T0代转基因株系虽然经过 2 轮壮观霉素筛选和
再生, 已整合进入叶绿体基因组的外源基因尚未达
到完全同质化, 即同时存在被转化的和野生型的两
种叶绿体DNA模板。T1 増代转基因烟草株系仅扩 出
一条 6 515 bp的带(lane 8~13), 说明T1代转基因烟草
已完全同质化, 这是由于T1代株系比T0代株系多一
轮抗性筛选和多次继代, 被转化的叶绿体完全取代
了野生型叶绿体。该结果和图 2 预期理论扩增产物
相同, 进一步说明外源基因确实得到了整合, 而且
是整合到了烟草叶绿体基因组中。
2.3 转基因烟草的 Southern blot分析
分别制备非转基因及部分转基因烟草株系的叶
绿体基因组 DNA, 用 Sph I酶解, 以经 Sph I酶切的
2.4 kb 的烟草叶绿体同源片段为探针进行 Southern
图 4 叶绿体型转基因烟草的 PCR检测
Fig. 4 PCR detection of transplastomic tobacco plants
M: DNA标记 DL2000+DL15000; 1: 野生型烟草; 2~7: 叶绿
体型转基因烟草株系。
M: DNA marker DL2000+DL15000; 1: wild-type tobacco;
2–7: six independent transplastomic tobacco plants.



图 5 叶绿体型转基因烟草同质化的 PCR检测
Fig. 5 PCR detection of homogenization of transplastomic
tobacco plants
M: DNA标记DL2000+DL15000; 1~6: T0代叶绿体型转基因
株系; 7: 非转基因烟草; 8~13: T1代叶绿体型转基因株系。
M: DNA marker DL2000+DL15000; 1–6: T0 generation trans-
plastomic tobacco plants; 7: wild-type tobacco;
8–13: T1 generation transplastomic tobacco plants.

blot分析。从图 2可以看出, 理论上野生型烟草应产
生 2.4 kb的杂交带, 转基因烟草应产生 7.2 kb的杂交
带。图 6的杂交结果显示, 阳性对照质粒pTGC仅出
现约 7.2 kb的一条带, 阴性对照非转基因烟草仅有
2.4 kb的一条带 , T0代转基因烟草株系同时出现约
2.4 kb和 7.2 kb两条带(lane 10~14), 表明这些转基因
株系中还存在部分野生型的叶绿体基因组, 尚未完
全同质化。而T1代转基因烟草仅出现 7.2 kb的杂交信
号(lane 3~7), 说明它们已经基本同质化。Southern
blot分析进一步验证了图 5的PCR结果, 该结果进一
步说明外源基因的表达盒已整合进叶绿体基因组。
2.4 转基因烟草的RT-PCR分析
用 Trizol试剂提取转基因烟草的总 RNA作模板
进行反转录, 由于叶绿体 RNA 和原核生物的 RNA
第 11期 王玉华等: phaG和 phaC基因在烟草叶绿体中的转化及其遗传分析 1955



图 6 转基因烟草的 Southern blot分析
Fig. 6 Southern blot analysis of transplastomic tobacco plants
M: 1kb ladder; 1, 8: 质粒pTGC; 2, 9: 野生型烟草; 3~7: T1代叶绿体型转基因烟草; 10~14: T0代叶绿体型转基因烟草。
M: 1kb ladder; 1, 8: plasmid pTGC; 2, 9: wild-type tobacco; 3–7: T1 generation transplastomic tobacco plants;
10–14: T0 generation transplastomic tobacco plants.

一样不具有真核生物的成熟mRNA特有的Poly(A)尾
巴, 不能使用Oligo dT进行反转录, 所以采用筛选标
记基因aadA的下游引物aadA-L(该引物起始于aadA
基因的终止密码子)进行反转录 , 以引物aadA-U和
aadA-L对 5 个转基因株系及其相应的T1 代株系进
行RT-PCR扩增。由图 7 可以看出, 无论是T0代还是
T1代转基因株系均扩增出预期大小的片段 (510 bp,
aadA基因的部分片段 ), 而对照 (以转基因植物的
RNA或非转基因植物RNA的cDNA第一条链为模板)
则没有扩增出相应产物, 说明aadA基因在T0代叶绿
体型转基因烟草及其后代中都实现了转录水平上的
稳定表达。
2 .5 外源基因在叶绿体转基因后代中的遗传
规律
为了研究外源基因是否能够稳定遗传及其在转



图 7 转基因烟草的 RT-PCR分析
Fig. 7 RT-PCR analysis of transplastomic tobacco plants
M: DNA标记 DL2000+DL15000; 1: 未转基因的烟草对照;
2: 转基因植株RNA对照; 3~7: T0代转基因烟草株系;
8~12: T1代转基因烟草株系。
M: DNA marker DL2000+DL15000; 1: nontransgenic tobacco; 2:
control of RNA; 3–7: T0 generation transplastomic tobacco plants;
8–12: T1 generation transplastomic tobacco plants.

基因后代中的遗传规律, 将叶绿体型转基因株系和
非转基因烟草进行正反交, 收获F1代正反交种子和
自交种子, 进行表面消毒, 接种在含 500 mg L−1 Spc
的MS培养基上, 10 d左右种子萌发, 拍照。结果如图
8所示, 以转基因烟草为母本、野生型烟草为父本的
F1代种子以及转基因烟草自交F1代种子在抗性培养
基上都呈绿色; 反之, 以野生型烟草为母本、转基因
烟草为父本的F1代种子以及野生型烟草自交F1代种
子则不具壮观霉素抗性, 在抗性培养基上都呈白化
苗, 表明外源基因转入受体植物叶绿体后, 能稳定
遗传给后代, 遗传传递方式遵循母性遗传规律, 而
不能通过花粉传递给子代, 说明叶绿体转化技术可
以使转基因植物的生物安全性提高。



图 8 外源基因在叶绿体型转基因烟草中遵循母性遗传规律
Fig. 8 Maternal inheritance of the foreign gene in transplas-
tomic tobacco line
1: TT♀×WT♂; 2: WT♀×TT♂; 3: TT♀×TT♂; 4:WT♀×WT♂;
WT: 野生型烟草; TT: 转基因烟草。
1: TT♀×WT♂; 2: WT♀×TT♂; 3: TT♀×TT♂; 4: WT♀×WT♂;
WT: wild type; TT: transplastomic tobacco.


1956 作 物 学 报 第 35卷

3 讨论
叶绿体起源于蓝绿藻, 其基因的转录和翻译机
制类似于原核生物 [7], 是高等植物细胞中一种特殊
的具有原核特性的细胞器, 这一特性恰好为原核基
因在高等植物中的表达提供了一个理想场所, 来自
原核生物的基因无须经过修饰改造即可在叶绿体中
高水平表达[10]。此外, 叶绿体基因工程还能有效解
决当前转基因植物中存在的两大主要问题, 即外源
基因表达量过低问题和环境安全问题, 叶绿体基因
组的高拷贝特性决定其可高效表达外源基因, 而其
单亲母性遗传特点决定了外源基因不会随花粉传
播。本研究中转基因烟草和非转基因烟草的正反交
试验证实了外源基因的母性遗传特点, 这样转基因
植物进行环境释放时对环境可能造成的风险就大大
降低。由于叶绿体基因工程具有上述核转化不具备
的独特优势, 因此自问世以来迅速在基础研究和实
践应用等方面显示出旺盛的生命力。除了可以进行
叶绿体结构、叶绿体基因转录、翻译等相关基础性
研究 [11]外, 在应用研究领域也得到了迅速发展, 如
可进行农作物改良[12-16]; 外源基因在叶绿体中表达
效率高, 植物的叶绿体可用作工业用酶或药用蛋白
等产品的生物反应器[17-22], 使医药工业的产品真正
成为“绿色产品”; 叶绿体是许多代谢反应的发生
场所, 对这些代谢反应的关键酶基因进行改造, 或
者直接导入外源蛋白基因, 可望在蔬菜叶子中大幅
度提高人类必需氨基酸、脂肪酸、糖类和蛋白质含
量。欧洲进行的“质体工厂”项目[23], 联合了欧洲
10 个实验室, 工作核心是叶绿体转化, 目标是利用
这一技术生产食用疫苗、高效表达抗病虫害基因 ,
增加转基因植物的安全性。
到目前为止 , 通过叶绿体基因工程已经实现
PHB在烟草叶绿体中的定位合成[24-25]。而mcl-PHAs
在转基因植物中的合成研究相对较少, 且仅限于通
过核转化加叶绿体导肽的方式在叶绿体中定位合
成[26-27]。在许多假单胞杆菌中, 脂肪酸的从头合成
途径也可为mcl-PHAs的合成提供前体物 [3], 植物体
脂肪酸生物合成主要在质体中进行, 相对于脂肪酸
的β氧化代谢只在发育的特定阶段旺盛 , 质体内的
脂肪酸合成代谢在植物生长发育的整个周期内都旺
盛进行, 可为mcl-PHAs的合成提供丰富的底物前体
物。连接脂肪酸从头合成途径和mcl-PHAs合成途径
的关键酶是ACP-CoA-转酰酶(由phaG基因编码), 它
可将脂肪酸合成途径的中间物R-3-羟酰-ACP转化成
mcl-PHAs合成的直接底物R-3-羟酰-CoA[3], 然
后再由 II 型 PHA 合酶催化合成 mcl-PHAs, 所以同
时将 phaG 和 phaC基因转入烟草叶绿体, 在叶绿体
中利用脂肪酸生物合成途径的中间产物合成
mcl-PHAs存在巨大潜力。因此, 本研究尝试通过叶
绿体转化技术将 mcl-PHAs合成的关键酶基因 phaG
和 phaC转入烟草叶绿体, 试图利用植物脂肪酸合成
途径的中间产物为底物在植物中合成 mcl-PHAs, 并
且对转基因植株的同质化程度以及转化基因的遗传
规律进行了研究。笔者认为用叶绿体作生物反应器
合成生物可降解的羟基脂肪酸聚酯比单纯的在叶绿
体中表达一个外源蛋白具有更大的挑战性, 因为它
的目标不仅限于实现外源蛋白在叶绿体中的超量表
达, 更进一步的目标是在所表达的外源蛋白的催化
下利用植物代谢中间产物合成所需要的目标产物。
因此, 本研究虽然能够实现 phaG 和 phaC基因在烟
草叶绿体中的稳定转化和表达, 但要最终能够高产
率地合成目标产物, 尚有很多工作要做。
4 结论
构建了嵌合 phaG和 phaC基因的烟草叶绿体表
达载体 pTGC, 通过基因枪轰击法转化烟草叶绿体,
获得 6个转基因烟草株系, 分子检测外源基因整合
进烟草叶绿体基因组, 遗传分析证明外源基因稳定
遗传, 且遵循单亲母性遗传规律。
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