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第28卷 第2期 作　物　学　报 V ol. 28, N o. 2
2002 年3月　 175～ 178页 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA pp. 175～ 178　M ar. , 2002
转基因抗虫油菜中B t杀虫蛋白基因稳定遗传和高效表达及抗虫性研究Ξ
林良斌1　官春云2　周小云2　何业华2　杨志新1
(1云南农业大学烟草种植技术学院, 云南昆明, 650201; 2 湖南农业大学作物基因工程湖南省重点实验室, 湖南长沙, 410128)
摘　要　通过对转B t 杀虫蛋白基因油菜植株的后代进行卡那霉素抗性分析和 PCR 技术检测, 结果表明: B t 杀虫蛋白
基因是以单拷贝、杂合地整合到转基因植株 (T 01、T 02、T 03、T 05、T 06、T 07、T 08)的基因组中, 并稳定地遗传。EL ISA
检测表明: 在第3～ 第9叶期B t 杀虫蛋白基因在转基因油菜植株中高效地表达, B t 杀虫蛋白的表达量为170～ 260 ngö25
m g 鲜叶, 占植物可溶性蛋白的0. 067%～ 0. 105% , 其抗虫效果高达72. 0%～ 94. 4%。但从第11叶期后B t 杀虫蛋白表
达量显著地降低, 只有7～ 50 ngö25 m g 鲜叶, 占植物可溶性蛋白的0. 003%～ 0. 02%。
关键词　转基因油菜; B t 杀虫蛋白基因; 遗传; 表达; 抗虫性
中图分类号: S565　　　文献标识码: A
Stable Heredity and Eff ic ien t Expression of B t In sectic ida l Prote in Gene in the
Tran sgen ic Rapeseed and Its In sect-resistan t Activ ity
L IN L iang2B in1　GUAN Chun2Yun2　ZHOU X iao2Yun2　H E Ye2H ua2　YAN G Zh i2X in1
(1 Faculty of T obacco Cultivational T echnology of Y unnan A g riculture U niversity , Y unnan, K unm ing , 650201, China; 2 G rop Gene E ng ineering K ey
L aboratory of H unan P rov ince, H N A U , H unan, Changsha, 410128, China)
Abstract　T he p rogeny of transgen ic rapeseed p lan ts w ith B t in secticidal p ro tein gene w as detected by kana2
m ycin2sifting and PCR. R esults show ed that single copy of B t in secticidal p ro tein gene has been in tegrated in to
the genom e of T 0 transgen ic p lan ts and stably inherited. By EL ISA B t in secticidal p ro tein gene can efficien tly
exp ress in the transgen ic rapeseed p lan ts w ith the 3th～ 9th leaf stage, and the exp ressing quan tity is 170～
260ngö25m g fresh leaf. It amoun ts to 0. 067%～ 0. 105% of p lan t so luble p ro tein, and the insecticidal activity is
72. 0%～ 99. 4%. But exp ressing quan tity of B t in secticidal p ro tein apparen tly decreased after the 11th leaf
stage and dow n to 7～ 50ngö25m g fresh leaf, co rresponding to 0. 003%～ 0. 02% of p lan t so luble p ro tein.
Key words　T ransgen ic rapeseed; B t in secticidal p ro tein gene; H eredity; Exp ression; In sect2resistan t activity
　　油菜是一种重要的油料作物, 在我国油料生产
中占有很重要的地位。目前, 应用基因工程技术改
良油菜品种已取得很大的进展[ 1 ]。油菜在生产过程
中常受菜青虫等鳞翅目害虫的危害。作者运用农杆
菌介导法和花粉管通道法把B t 杀虫蛋白基因导入
到油菜中, 获得了转基因植株[ 2, 3 ]。本文报道这些
转基因植株中的B t 杀虫蛋白基因的遗传、表达及
其抗虫性, 为选育高效抗虫油菜新品种提供依据。
1　材料和方法
1. 1　材料
转B t 杀虫蛋白基因的湘油13号植株和由此所
获得的稳定的转 B t 杀虫蛋白基因油菜株系;
EL ISA 分析用的第一抗体是B t 杀虫蛋白的兔抗血
清, 第二抗体是碱性磷酸酯酶标记的羊抗兔血清,
均为中国农科院生物技术研究中心范云六院士实验
室提供; 实验用虫为采自田间的菜青虫虫卵经人工
孵化出的幼虫。
1. 2　方法
1. 2. 1　卡那霉素筛选转基因植株后代　　将自交
套袋收获的种子用0. 1% 升汞表面消毒15分钟, 经无
菌水冲洗3次, 播在含卡那霉素 (40m göL ) 的M S 培
养基上进行萌发 (25℃, 光照16höd) , 3～ 4周后, 将
长出根系的绿色苗移栽到土壤中并进行检测。Ξ 基金项目: 湖南省科委基金项目 (97JKY1005)
作者简介: 林良斌 (19632) , 男, 湖南武冈人, 副教授, 博士, 主要从事植物分子生物学和基因工程研究; 官春云 (19382) , 男 (蒙古族) ,
湖北江陵人, 教授, 博士生导师, 中国工程院院士, 主要从事油菜遗传育种和栽培研究。
Received on (收稿日期) : 2000211207, A ccep ted on (接受日期) : 2001203222

1. 2. 2　PCR 技术检测转基因植株后代　　采用
PCR 技术扩增B t 杀虫蛋白基因这一目标序列进行
检测。油菜植株的DNA 提取参照江昌俊等[ 4 ]的方
法。5′端引物为:
5′2GGAA GTAA T GGA TAA GAA TCCGAA G23′, 3′
端引物为:
5′2CCCA CTA GT TAA CCGA T T T GA T T GGA 23′,
采用 P rom ega 的 T aq 聚合酶系统, 反应体积为25ΛL , 基因组DNA 用量为0. 2 Λg。94℃变性1 m in,
35℃复性2 m in, 72℃延伸2 m in, 共进行40次循环,
完成最后一次循环后, 72℃延伸10 m in, 扩增出的
目标DNA 带约为1. 8 kb。
1. 2. 3　转基因植株的B t 杀虫蛋白表达检测分析
(EL ISA ) 　　取0. 1 g 转基因株系的叶片组织, 加
入400 ΛL 样品抽提缓冲液研磨, 10. 000 röm in 离心
5 m in, 取100 ΛL 加入酶标板的孔中, 4℃冰箱包被
过夜。第二天用 PBST 缓冲液快速洗板5～ 6次, 加
入封闭缓冲液100 ΛL , 室温下保温1 h; 用 PBST 洗
板3次后, 加入稀释好的第一抗体100 ΛL , 室温下反
应2 h; 用 PBST 快速洗板5～ 6次, 加入已用 EC I缓
冲液稀释好的碱性磷酸酯酶标记的抗兔第二抗体
100 ΛL , 室温下反应2 h; 用 PBST 快速洗板5～ 6
次, 加入显色底物100 ΛL , 在室温下闭光反应3～ 10
m in, 用50 ΛL 3 molöL N aOH 终止反应, 在酶联仪
上测405 nm 光吸收, 并照相。
1. 2. 4　转基因植株中B t 杀虫蛋白含量的测定　　
称取纯化的B t 杀虫蛋白晶体10 m g, 加入100 ΛL 0.
135 molöL N aOH , 在室温下碱解5 h, 10, 000 röm in
离心5 m in, 上清液即为可溶性B t 杀虫蛋白, 在紫
外分光光度计上测260 nm 和280 nm 的光吸收, 计
算出纯B t 杀虫蛋白的含量 (1, 600 ngöΛL )。取2 ΛL
可溶性B t 杀虫蛋白, 加入到198 ΛL PBS 溶液中,
制成原液, 然后依次稀释11次, 每次稀释1倍。每一
浓度溶液分别取100 ul 与待测定的转基因株系样品
一起做 EL ISA。根据浓度和 405 nm 的光吸收
(OD 405) 的关系做标准曲线。在标准曲线上即可查
得转基因植株中B t 杀虫蛋白的含量, 同时也可计
算出B t 杀虫蛋白占植物可溶性蛋白的比例。
1. 2. 5　转基因植株的杀虫活性分析　　用第3～ 第
9叶期的转基因油菜株系的叶片和未转基因油菜植
株的叶片持续饲喂菜青虫幼虫, 直到幼虫化蛹。试
验时, 将24 h 内孵化的幼虫饲养于培养皿中 (5头ö
皿) , 放入25±1℃光照培养箱中培养, 每天观察记
载各培养皿中幼虫的存活、取食、蜕皮及生长情
况, 统计各处理的幼虫和蛹的死亡率及虫龄, 并隔
两天饲喂新的叶片。
2　结果和分析
2. 1　转基因植株后代的筛选
将收获的种子播在含卡那霉素的M S 培养基上
进行发芽, 长出4种苗: 白色苗、紫色苗、无根系的
绿色苗和有根系的绿色苗, 只有最后一种是卡那霉
素抗性植株, 有可能具有B t 杀虫蛋白基因。实验结
果表明: 在 T 0代中, 有7株 (T 01、T 02、T 03、T 05、
T 06、T 07、T 08) 的后代 (T 1代) 的卡那霉素抗性植株
和卡那霉素敏感植株的分离比约为3÷ 1, ς 2测验符
合一对基因分离的预期比例。仅有1株 (T 04) 的后代
的卡那霉素抗性植株的比例超过3÷1, 约占87.
23%。在 T 1代中 (选择其它性状表现优异的 T 1代植
株进行研究) , 有近2ö3植株, 其后代 (T 2代) 的卡那
霉素抗性植株和卡那霉素敏感植株的分离比约为3÷
1, 有1ö3植株, 其后代几乎不发生分离, 卡那霉素
抗性植株的比例约占98. 63%。由此说明B t 杀虫蛋
白基因是以单拷贝、杂合地整合到这7株转基因植
株的基因组中, 有1株是以多拷贝、多位点、杂合地
整合到其基因组中, 对此株予以淘汰。
2. 2　转基因植株后代的 PCR 检测
对经过卡那霉素筛选获得的 T 1、T 2代卡那霉
素抗性植株及纯合的 T 3代植株进行 PCR 检测, 在
所检测的植株中, 几乎都获得了B t 杀虫蛋白基因
的特异扩增带 (见图1)。结果表明B t 杀虫蛋白基因
在转基因植株中能稳定地遗传, 卡那霉素抗性可作
为转基因植株后代是否具有目的基因的判断指标。
并且在第3代我们就获得纯合的转基因植株, 作为
转基因抗虫油菜的育种材料。
2. 3　转基因植株的 EL ISA 分析及转基因植株中B t
杀虫蛋白含量的测定结果
每次选择第3、第5、第7⋯⋯第13叶期的转B t
杀虫蛋白基因油菜株系做 EL ISA 检测, 未转基因
植株做阴性对照 (即空白对照) , 不同浓度的纯B t
杀虫蛋白做阳性对照。EL ISA 检测结果 (见表1) 表
明B t 杀虫蛋白基因在转基因植株中得到了表达。
根据 EL ISA 检测中转基因植株的405 nm 光吸收
值, 即可从B t 杀虫蛋白的浓度标准曲线上查得转
基因植株中B t杀虫蛋白的含量 , 并计算出其占植
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表1　转基因抗虫油菜不同叶期B t 杀虫蛋白表达的检测结果
Table 1　Expression of B t insectic ida l prote in in the transgen ic insect-resistant rapeseed at difference leaf stage
株系编号
N um ber of line
第3叶期OD 405
OD 405 of the
3th leaf stage
第5叶期OD 405
OD 405of the
5th leaf stage
第7叶期OD 405
OD 405 of the
7th leaf stage
第9叶期OD 405
OD 405 of the
9th leaf stage
第11叶期OD 405
OD 405 of the
11th leaf stage
第13叶期OD 405
OD 405 of the
13th leaf stage
阴性对照
N egative contro l
0 0 0 0 0 0
T 1 0. 403 0. 405 0. 402 0. 404 0. 348 0. 342
T 2 0. 385 0. 386 0. 384 0. 387 0. 331 0. 332
T 3 0. 391 0. 392 0. 389 0. 388 0. 338 0. 336
T 4 0. 394 0. 392 0. 391 0. 393 0. 335 0. 332
T 5 0. 382 0. 385 0. 386 0. 384 0. 329 0. 328
T 6 0. 378 0. 381 0. 379 0. 377 0. 331 0. 330
T 7 0. 396 0. 397 0. 395 0. 398 0. 341 0. 337
T 8 0. 401 0. 399 0. 396 0. 397 0. 343 0. 341
T 9 0. 388 0. 389 0. 391 0. 387 0. 333 0. 329
T 10 0. 376 0. 379 0. 382 0. 381 0. 330 0. 328
T 11 0. 375 0. 378 0. 385 0. 384 0. 329 0. 331
T 12 0. 402 0. 403 0. 398 0. 399 0. 341 0. 342
T 13 0. 398 0. 401 0. 395 0. 397 0. 345 0. 338
T 14 0. 374 0. 378 0. 382 0. 381 0. 324 0. 321
T 15 0. 385 0. 387 0. 384 0. 386 0. 333 0. 328
T 16 0. 392 0. 391 0. 395 0. 394 0. 335 0. 336
T 17 0. 384 0. 383 0. 386 0. 385 0. 331 0. 329
T 18 0. 381 0. 385 0. 391 0. 387 0. 332 0. 330
T 19 0. 397 0. 396 0. 392 0. 394 0. 334 0. 333
T 20 0. 392 0. 394 0. 395 0. 393 0. 332 0. 335
T 21 0. 398 0. 395 0. 396 0. 397 0. 336 0. 335
T 22 0. 395 0. 397 0. 398 0. 391 0. 332 0. 331
T 23 0. 401 0. 403 0. 397 0. 398 0. 342 0. 344
T 24 0. 398 0. 402 0. 401 0. 399 0. 339 0. 338
T 25 0. 399 0. 401 0. 395 0. 397 0. 335 0. 332
T 26 0. 387 0. 392 0. 389 0. 388 0. 331 0. 330
T 27 0. 396 0. 394 0. 395 0. 393 0. 336 0. 335
T 28 0. 397 0. 395 0. 398 0. 396 0. 338 0. 339
物可溶性蛋白的比例。B t 杀虫蛋白基因在转基因
抗虫油菜植株的第3～ 第9叶期表达是比较高的, 并
且较稳定, B t 杀虫蛋白的表达量为170～ 260 ngö25
m g 鲜叶, 占植物可溶性蛋白的0. 067%～ 0. 105%。
但从第11叶期后B t 杀虫蛋白的表达量显著地降低,
只有7～ 50 ngö25 m g 鲜叶, 占植物可溶性蛋白的0.
003%～ 0. 02%。
2. 4　转基因株系的杀虫活性分析结果
取 T 1、T 6转基因油菜株系的叶片, 用室内培
养法检测转基因株系对菜青虫幼虫的抗性, 同时以
未转基因湘油13植株做对照。实验结果 (见表2) 表
明转基因株系的杀虫效果明显。虽然大部分被饲喂
了转基因株系叶片的一龄或二龄菜青虫幼虫没有立
即死亡, 但生长明显被抑制了, 虫体变小, 延缓了
蜕皮, 增加了每龄幼虫的历期。由于杀虫蛋白的量
在虫体内不断累积, 因此, 到三龄期以后幼虫死亡
率大大地提高。
3　讨论
外源基因在转基因植株中丢失[ 5, 6 ]和沉默[ 7, 8 ]是
植物基因工程应用中存在的问题。克服外源基因丢
失的对策是: 1) 通过转基因植株自交尽快获得纯
合的转基因植株; 2) 建立植物小孢子转化体系 (小
孢子具备了单细胞、单倍体两个特性) , 以它作为
转化受体易获得纯合的转基因植株; 3) 建立一套
将外源基因定点、定量地整合到受体基因组中的遗
传转化技术。我们在第3代就获得纯合的转基因植
株, 实验结果表明B t 杀虫蛋白基因在转基因植株
中都能稳定地遗传。
在转基因油菜植株的第3～ 9叶期B t 杀虫蛋白
基因的表达是比较高的, 并且较稳定, 但从第11叶
期后显著地降低。这可能与栽培的外界环境条件变
化有关, 也可能与外源基因整合的位点有关。当外
源基因整合到与生长发育有关的基因附近 , 外源
7712期　　　　　　　林良斌等: 转基因抗虫油菜中B t 杀虫蛋白基因稳定遗传和高效表达及抗虫性研究　　　　　　　　　　

表2　转基因株系的杀虫活性分析
Table 2　　Insectic ida l activ ity of transgen ic plant l ines
虫期
Stage
项目
Item
未转基因植株
Non2transgenic p lants 转基因株系 T 1T ransgenic line T 1 转基因株系 T 6T ransgenic line T 6
1龄 起始虫数No. of insects tested 20 18 25
F irst instar 死亡数 No. of dead insects 0 2 0
死亡率% Dead frequency 0 11. 11 0
2龄 起始虫数No. of insects tested 20 16 25
Second instar 死亡数 No. of dead insects 1 2 0
死亡率% Dead frequency 5 12. 50 0
3龄 起始虫数No. of insects tested 19 14 25
Third instar 死亡数 No. of dead insects 0 5 4
死亡率% Dead frequency 0 35. 71 16. 00
4龄 起始虫数No. of insects tested 19 9 21
Forth instar 死亡数 No. of dead insects 1 6 5
死亡率% Dead frequency 5. 26 66. 67 23. 81
5龄 起始虫数No. of insects tested 18 3 15
F ifth instar 死亡数 No. of dead insects 1 1 6
死亡率% Dead frequency 5. 56 33. 33 40. 00
蛹期 起始虫数No. of insects tested 17 2 8
Pupa instar 死亡数 No. of dead insects 0 1 3
死亡率% Dead frequency 0 50. 00 37. 50
总死亡数 Total num ber of dead insects 3 17 18
总死亡率% Total dead frequency 15. 00 94. 44 72. 00
图1　　转基因植株 PCR 检测结果
F ig. 1　　The result of analyzing transgenic p lants by PCR
1～ 7. T 2代卡那霉素抗性植株的DNA 经 PCR 扩增结果, 目标带
为1. 8 kb; 8. 阴性对照, 未转化油菜的DNA 经 PCR 扩增结果;
9. 阳性对照, 表达载体质粒 pFW Z10的B t 杀虫蛋白基因经 PCR
扩增, 目标带为1. 8 kb; 10. 分子量标记 (ΚDNA öE coR É + H indË )
L ane 1～ 7. amp lification band of DNA of anti2kanam ycin p lants
T 2 by PCR respectively; L ane 8. N egative contro l, DNA of
non2transgenic p lant; L ane 9. Positive contro l,
amp lification band of the p lasm id pFW Z10 w ith B t
insecticidal p ro tein gene by PCR; L ane 10.
M olecular m arker (ΚDNA öE coRÉ + H indË )
因的表达就可能受生长发育基因的调控序列调控,
随着生长时期的不同而发生变化。Perlak 等[ 9 ]测得
转B t 杀虫蛋白基因抗虫棉叶片中B t 杀虫蛋白含量
为总可溶性蛋白的0. 05%～ 0. 10% , 就表现出较强
的抗虫性。在转基因油菜植株中B t 杀虫蛋白占植
物可溶性蛋白的比例达到了0. 067%～ 0. 105% , 符
合了转基因植物具有杀虫活性时对B t 杀虫蛋白表
达量的要求, 抗虫试验的结果也说明了这一点, 转
B t 杀虫蛋白基因油菜具有很强的杀虫活性, 其抗
虫效果高达94. 4%。
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