全 文 ：第28卷 第3期 作　物　学　报 V ol. 28, N o. 3
2002 年5月　 369～ 373页 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA pp. 369～ 373　M ay, 2002
秋水仙碱及热击与低温诱导对油菜小孢子胚状体成苗率的影响Ξ
周伟军　毛碧增　顾宏辉　唐桂香
(浙江大学农业与生物技术学院, 浙江杭州, 310029)
摘　要　甘蓝型冬油菜 F 1杂种分离小孢子直接用500 m göL 秋水仙碱处理15 h, 在NLN 213培养液中培养, 并于32℃和
30℃分别热击暗培养3 d 和7 d 后转入24℃下培养, 胚胎发生好, 5周后产生大量正常胚体。将这些发育优异的胚体移入
固体M S 培养基后即进行10 d 低温诱导 (2℃) , 常温 (24℃)光下培养能很好地萌发并直接、快速地再生植株, 其萌发胚
率和成苗率分别达到89. 3% 和86. 7% 与62. 5% 和55. 4%。
关键词　甘蓝型油菜; 小孢子培养; 秋水仙碱; 胚胎发生; 植株再生
中图分类号: S565　　　文献标识码: A
Effects of Colch ic ine with Hea t Shock and Cold Induction on Plan t Regenera tion
from M icrospore-der ived Embryos in B rassica napus
ZHOU W ei2Jun　M AO B i2Zeng　GU Hong2H ui　TAN G Gui2X iang
(College of A g riculture and B iotechnology , Z hej iang U niversity , H angzhou 310029, China)
Abstract　T he effects of co lch icine treatm en t w ith heat shock and co ld induction on em bryogenesis and p lan t
regeneration from m icrospo re2derived em bryos w ere investigated in the F 1 hybrids of w in ter o ilseed rape
(B rassica nap us L. ). F resh ly iso lated m icrospo res w ere imm ediately treated w ith 500 m göL of co lch icine fo r
15 h and incubated in liquid NLN 213 m edium in darkness at 32℃ and 30℃ fo r 3 d and 7 d, respectively. L arge
amoun ts of no rm al em bryos w ere p roduced after incubated fo r 5 w eek s. A fter transferred to so lid M S m edium
and an in itial period of co ld induction (2℃) fo r 10 d, these em bryos germ inated w ell at 24℃ in the ligh t and
directly and quick ly regenerated p lan ts. T he rates of em bryo germ ination and p lan t regeneration reached
89. 3% and 86. 7% , and 62. 5% and 55. 4% , respectively.
Key words　B rassica nap us L. ; M icrospo re culture; Co lch icine; Em bryogenesis; P lan t regeneration
　　小孢子培养是作物单倍体育种的主要手段, 通
过染色体加倍可快速获得大量遗传纯合、稳定的双
单倍体再生植株, 因而大大加快了育种进程, 并被
广泛地应用在遗传研究与转基因研究中[ 1, 2 ]。甘蓝
型油菜的小孢子培养和单倍体技术是显花植物中开
展得最好的植物之一[ 3 ]。自从L ich ter[ 4 ]首次从甘蓝
型油菜小孢子培养中成功获得再生植株以来, 国内
外对影响甘蓝型油菜小孢子培养及其成苗率的诸多
因素进行了广泛的研究, 基本明确了供体基因型、
供体植株生长条件与生理状态、小孢子发育时期和
培养基组成以及培养条件, 是影响小孢子胚胎发生
和成苗的主要因素[ 5～ 8 ], 并已初步建立了一些高效
培养体系[ 9 ]。但在小孢子培养的温度条件, 尤其是
高温热击和低温诱导结合分离小孢子直接进行秋水
仙碱加倍处理, 目前尚无文献报道。本试验研究了
高温热击和低温诱导, 对秋水仙碱处理的油菜分离
小孢子胚胎发生和成苗的影响, 获得了大量再生植
株。
1　材料和方法
1. 1　供试材料
经6个甘蓝型冬油菜 F 1代杂种小孢子培养的预Ξ 基金项目: 教育部留学回国人员科研启动基金; 浙江省重点科技项目 (991102333)。
作者简介: 周伟军 (19622) , 男, 浙江鄞县, 教授, 博导, 博士, 从事油菜生理生态与品质改良研究。为本文的通讯作者。
Received on (收稿日期) : 2001 01208, A ccep ted on (接受日期) : 2001206217

备试验, 采用2个对小孢子培养有较好反应的 F 1代
杂种 (5396和5395)作为供体材料。供体植株生长在
光周期16 h、营养丰富的温室条件下。在3叶期进行
春化处理 (4℃、光周期8 h, 处理8周)。于现蕾前移
入人工气候室, 温度设定为12℃ö10℃ (昼ö夜)。每
个材料选用5株供体植株 (每盆1株)。
1. 2　小孢子培养和秋水仙碱处理
参照 F letcher 等[ 9 ]和周伟军等[ 10～ 11 ]方法进行。
从油菜主花序和上部一次分枝花序上摘取处于单核
晚期的花蕾16个, 经表面消毒后用无菌水洗3次。
在10 mL B 5211培养液 (含B 5大量、微量、铁盐和有
机成分、11% 蔗糖, pH 6. 0) 中轻轻匀浆, 并经40Λm 尼龙网过滤, 滤液用750 röm in 离心5 m in, 去上
清液后直接进行500 m göL 秋水仙碱处理 (15 h) ,
于30℃或32℃的恒温箱中黑暗培养。处理完毕后用
NLN 213培养液 (含NLN 大量、微量、铁盐和有机
成分、13% 蔗糖, pH 6. 0) 洗二次, 然后加 8 mL
NLN 213培养液于小孢子悬浮液中。取0. 5 mL 小孢
子悬浮液于16个6 cm 培养皿中, 用NLN 213培养液
加至底部, 另加1滴混合活性碳 (活性碳溶解于
NLN 213培养液和琼脂糖中)。密封后培养皿置于
30℃或32℃的恒温箱中继续黑暗培养至所需的3～ 7
d, 之后移至24℃黑暗条件下培养。当肉眼可见胚
状体时, 将培养皿转移至摇床继续培养 (45 röm in,
24℃, 黑暗)。
1. 3　植株再生
在后鱼雷期, 胚状体移入1ö2浓度M S22固体培
养基 (含M S 大量、微量、铁盐和有机成分、2% 蔗
糖、0. 1 m göL GA 3、0. 9% 琼脂, pH 5. 8) , 先在2℃
低温生长箱中低温诱导5～ 10 d, 再在24℃、16 h 光
周期和弱光下进行光培养。3～ 4周后切取试管苗
(切除愈伤组织与分生组织) 于15 cm 高的塑料培养
盆中, 继续在24℃、16 h 光周期和弱光下培养并进
行发根等。待试管苗长出3～ 5片叶子并形成根系
后, 将该小植株移至土壤培养钵中, 并定期浇水或
营养液。待小植株成活后再移到温室, 逐渐适应大
田条件。
2　结果
2. 1　秋水仙碱与热击处理对胚产率的影响
在本试验条件下, 用500 m göL 浓度秋水仙碱
直接处理甘蓝型冬油菜分离小孢子15 h, 并在30℃
和32℃分别热击暗培养7 d 和3 d 后转入24℃下培
养, 胚胎发生好, 5周后产生了较多发育正常的黄
色胚体 (图1、表1)。这些胚体多为后鱼雷形胚和子
叶形胚, 已经发育成熟, 具有较长的根 (茎)轴及清
图1　经500 m göL 秋水仙碱直接处理15 h、并于30℃热击暗培养7 d 的甘蓝型油菜 F1杂种
5396 (左)和5395 (右)分离小孢子, 在NLN 213培养液中培养5周时胚的发育状况
F ig. 1　5 w eeks o ld em bryos from iso lated m icrospores imm ediately treated w ith 500 m göL colch icine for 15 h and incubated
in liquid NLN 213 m edium in darkness at 30℃ fo r 7 d in F1 hybrids 5396 ( left) and 5395 ( righ t)of B rassica napus
073　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　28卷

表1　秋水仙碱与热击处理对甘蓝型油菜分离小孢子胚产率的影响3
Table 1　Effects of colch ic ine treatment and heat shock on embryo
yield of isolated m icrospores in B rassica napus3
基因型
Genotype
热击温度
Heat shock
(℃)
培养时间
Duration
(d)
正常胚产率3 3
Norm al em bryo yield3 3
(Em bryosöbud)
5396 30 3 60. 5
30 7 79. 8
32 3 84. 0
32 7 38. 3
5395 30 3 56. 0
30 7 74. 8
32 3 73. 3
32 7 44. 8
　3 分离小孢子直接用500 m göL 秋水仙碱处理15 h, 在NLN 213培
养液中培养, 并于30℃和32℃分别热击暗培养3 d 和7 d.
　3 F resh ly iso lated m icrospores w ere imm ediately treated w ith 500
m göL of co lch icine for 15 h and incubated in liquid NLN 213
m edium in darkness at 30℃ and 32℃ fo r 3 d and 7 d,
respectively.3 3 在NLN 213培养液中培养5周和移入固体M S 培养基前获得的
大量正常胚体。3 3 L arge and healthy2look ing em bryos obtained after cultured in
liquid NLN 213 m edium for 5 w eeks and before transferred to
so lid M S m edium.
晰的2片子叶 (图1)。30℃培养7 d 和32℃培养3 d 后
转入24℃下培养, 具有较高的正常胚产率, 其分别
达到79. 8与74. 8和84. 0与73. 3胚ö花蕾 (表1)。其中
又以32℃热击处理3 d 效果较好, 而且其处理时间
短。30℃培养3 d 后转入24℃下培养次之, 而32℃
培养7 d 后转入24℃下培养较差。
2. 2　秋水仙碱与低温诱导对胚萌发与成苗的影响
将上述这些发育优异的胚体移入固体M S 培养
基、并立即进行低温诱导处理 (2℃) , 常温 (24℃)
光下培养能很好地萌发, 并直接、迅速地再生成苗
(图2)、继代后长成完全正常的再生植株 (图3) , 这
些再生株具有完整的根、茎、叶和茎端, 可以移入
土壤。低温诱导处理10 d, 其萌发胚率和成苗率分
别达到89. 3% 和86. 7% 与62. 5% 和55. 4% , 均显著
高于无低温对照 (表2)。低温诱导处理5 d 的效果不
及处理10 d, 但未达显著差异。低温处理的再生植
株其生长状况与对照植株无明显区别。
图2　移入固体M S 培养基后即进行10 d 低温诱导 (2℃)、24℃
光下培养4周的、经500 m göL 秋水仙碱直接处理15 h 的
甘蓝型油菜 F1杂种5396小孢子胚体直接成苗状况
F ig. 2　D irect p lant regeneration after cultured at 24℃ fo r 4 w eeks
from m icrospore2derived em bryos imm ediately treated w ith 500 m göL
colch icine for 15 h and transferred to so lid M S m edium at
2℃ fo r 10 d in F1 hybrid 5396 of B rassica napus
图3　移入固体M S 培养基后即进行10 d 低温诱导 (2℃)、
经500 m göL 秋水仙碱直接处理15 h 的甘蓝型油菜
F1杂种5396小孢子胚体继代成苗状况
F ig. 3　Norm al p lants subcultured from regenerated p lants from
m icrospore2derived em bryos imm ediately treated w ith 500 m göL
colch icine for 15 h and transferred to so lid M S m edium at
2℃ fo r 10 d in F1 hybrid 5396 of B rassica napus
3　讨论
本试验及其它研究表明, 对油菜分离小孢子直
接用50～ 500 m göL 秋水仙碱处理15～ 24 h, 在液 体NLN 培养基中胚胎发生好、获得了大量正常胚体, 将这些发育优异的胚体移入固体M S 培养基后能很好地萌发、并迅速长成完全正常的再生植
1733期　　　　　　　　　周伟军等: 秋水仙碱及热击与低温诱导对油菜小孢子胚状体成苗率的影响　　　　　　　　　

表2　秋水仙碱与低温诱导对甘蓝型油菜分离小孢子
胚萌发和成苗的影响3
Table 2　Effects of colch ic ine treatment and cold induction
on embryo germ ination and plant regeneration from
isolated m icrospores in B rassica napus3
基因型
Genotype
低温诱导
Cold induction
(℃)
处理时间
Duration
(d)
萌发胚率3 3
Rate of em bryo
germ ination (% ) 33 成苗率P lants regen2erated (% )
5396 2 5 80. 5 a＄ 49. 4 ab＄
2 10 89. 3 a 62. 5 a
2 (CK) # 0 63. 0 b 36. 7 b
5395 2 5 75. 6 a 47. 8 ab
2 10 86. 7 a 55. 4 a
2 (CK) # 0 58. 2 b 41. 9 b
　3 分离小孢子直接用500 m göL 秋水仙碱处理15 h, 在NLN 213培
养液中培养, 并于30℃和32℃分别热击暗培养3 d 和7 d。
　3 F resh ly iso lated m icrospores w ere imm ediately treated w ith 500
m göL of co lch icine for 15 h and incubated in liquid NLN 213
m edium in darkness at 30℃ and 32℃ fo r 3 d and 7 d,
respectively.3 3 在固体M S 培养基培养3周后获得的正常萌发胚率。3 3 Norm al germ inated em bryos obtained after cultured in so lid M S
m edium for 3 w eeks.
　# 无低温诱导处理, 直接进行24℃光下培养。
　 # W ithout co ld induction and directly incubated at 24℃ in the
ligh t.
　＄ 相同小写字母表示在0. 05水平下差异不显著。
　＄W ith in co lum ns, m eans fo llow ed by the sam e sm all letter are not
significantly different at the 0. 05 level of p robability.
株[ 12～ 14 ]。我们还发现, 用秋水仙碱直接处理分离小
孢子能显著提高再生株中双单倍体植株频率, 其加
倍效果均好于用秋水仙碱处理正常胚体或再生植
株, 并且后者还产生大量待特殊处置的秋水仙碱废
液、推迟了再生株的生育进程以及种子数量少需要
加 代 繁 种 等[ 11 ]。 此 外, H ansen 等[ 15 ] 报 道 了
T rifluralin、O ryzalin 和 Am ip rophos2m ethyl 等三种
微管解聚除草剂, 在油菜分离小孢子培养中能促进
胚胎形成与成苗、并提高染色体加倍频率, 具有较
好的应用前景。
本试验条件下, 对油菜分离小孢子分别进行
32℃和30℃热击暗培养3 d 和7 d 处理后转入常温
(24℃) 下培养, 其胚胎发生好、产胚率高, 获得了
大量正常胚体。Chen 等[ 12 ]、Zhao 等[ 16 ]、H ansen
等[ 15 ]、周永明等[ 5 ]、余凤群等[ 6 ]和牛应泽等[ 7 ]对油
菜分离小孢子进行了32℃热击暗培养1～ 3 d 处理,
取得了较好结果。本试验结果与这些报道相一致,
也证实了前人的结果。而 Iqbal 等[ 13 ]、M ollers 等[ 14 ]
和 F letcher 等[ 9 ]对油菜分离小孢子进行30℃暗培养
5 d 至14 d, 也取得了较为理想的结果, 表明一定温
度 (30℃～ 32℃)的热击处理均能获得良好胚体。
从小孢子胚体中直接、快速地再生植株是双单
倍体育种应用的重要环节。F letcher 等[ 9 ]研究表明,
对培养三周龄以上的子叶形胚进行特定的逆境胁迫
能明显提高植株再生能力。采用40 ΛmolöL ABA 处
理其再生能力提高了50% , 切除子叶能使胚体的再
生能力提高20%～ 65% , 而胚干燥45 m in 则能使处
理胚体的再生能力提高到95%～ 100%。但对于育
种应用来说具有一定的操作难度, 并且也增加了成
本。而本试验结果表明, 在胚体移入固体再生培养
基后即进行10 d 的低温诱导处理 ( 2℃) , 常温
(24℃) 光下培养就能很好地萌发, 并直接、快速地
再生成苗, 表明对胚体的低温诱导是一种很有效的
提高植株再生能力的简便、实用方法。同时, 这些
再生植株的生长状况与无低温诱导的再生植株无明
显区别。而低温 (春化) 处理通常能提早冬油菜植株
的发育进程, 至于对发育成熟的胚体进行低温诱导
能否促进冬油菜的发育、提早现蕾开花, 值得进一
步研究。
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668～ 671
书讯
《水稻生物技术育种》一书问世
主编: 李梅芳、周开达
出版: 中国农业科技出版社
　　《水稻生物技术育种》是由中国农业科技出版社
邀请李梅芳研究员, 诚聘国内有关专家、学者组织
撰写而成。全书共分: 四篇, 18章, 55. 6万字, 于
2001年12月首版, 精装, 每册定价: 98元, 国内、外
公开发行。
九届全国人大常委、农业与农林委员会副主
任、原农业部副部长洪绂曾教授和中国作物学会理
事长、原中国农业科学院院长王连铮研究员为本书
题词, 我国著名水稻遗传育种学家、工程院院士黄
耀祥先生作序。
第一篇水稻细胞工程育种包括: 花培育种、体
细胞无性系变异及突变体筛选、生物技术在水稻远
缘杂交育种中的应用, 体细胞融合、孤早生殖。第
二篇: 水稻染色体组工程育种, 包括同源四倍体水
稻育种研究, 异倍体杂种早代稳定研究, 染色体原
位杂交。第三篇水稻转基因育种, 包括水稻转基因
育种的基本原理, 水稻遗传转化及技术鉴定, 水稻
遗传转化研究进展, 转基因抗螟虫水稻的培育及研
究。第四篇, 包括DNA 分子标记的种类及其基本
原理、重要性状的分子标记与基因定位, 分子标记
辅助选择及其在水稻育种中的应用, DNA 分子标
记在水稻遗传育种中的其它应用。
每篇、每章除综述国内、外最新研究进展外,
着重介绍本篇、章的基本原理, 技术和成败关键,
特别注重介绍作者的研究进展和成就。每章后均附
参考文献。本专著对从事水稻遗传育种, 细胞工程、
基因工程等学科的科研、教育工作者均有很好的参
考价值。
欲购者请与中国农业科学院、作物所、水稻细
胞工程组张丽娟同志联系。电话: (010) 68918606
3733期　　　　　　　　　周伟军等: 秋水仙碱及热击与低温诱导对油菜小孢子胚状体成苗率的影响