全 文 ：　　　　　　　　
第26卷 第2期 作　物　学　报 V o l. 26, N o. 2
2000 年3月 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA M ar. , 2000
玉米叶片胚性愈伤组织诱导及其与内源 IAA 和 ABA 关系的
初步研究X
张东向1　张崇浩2　李杰芬2
( 1齐齐哈尔大学生命科学与工程学院, 黑龙江齐齐哈尔, 161006; 2北京师范大学生命科学学院, 北京,
100875)
提　要　玉米幼叶愈伤组织的形成能力因其形态学部位的不同而呈显著差异, 从基部向上依次递减,
幼叶外植体的内源 IAA 和ABA 水平亦相应地呈递减趋势。2, 42D 及与BA 组合对基部切段的愈伤组
织形成无显著影响, 愈伤组织生长符合L ogist ic 曲线, 单独使用BA 不利于愈伤组织形成; 采用2 m g ö
L 2, 42D 与0. 5 m g ö L BA 的组合最有利于胚性愈伤组织的诱导。培养物内源 IAA 水平随培养时间显
著下降; 2, 42D 可进一步降低 IAA 水平, 但显著提高内源ABA 水平, 2 m g ö L 2, 42D 作用最为显著。
伴随着胚性愈伤组织的发生, 内源ABA 相应地出现一个峰值。玉米胚性发生能力的大小与培养物内
源ABA 水平的高低密切相关, 2, 42D 可能是决定ABA 水平的因素之一。
关键词　玉米幼叶; 胚性愈伤组织; 2, 42D; IAA ; ABA
Em bryogen ic Ca llus Induction of M a ize L eaves and Rela ted to En -
dogenous IAA and ABA
ZHAN G Dong2X iang1　ZHAN G Cong2H ao 2　L I J ie2Fen2
( 1Colleg e of L if e S cience and T echnology , Q iqihar U niversity , Q iqihar, H eilongj iang , 161006; 2Colleg e of L if e S cience,
B eij ing N orm al U niversity , B eij ing , 100875)
Abstract　T he ca llu s fo rm at ion ab ility of m aize leaf segm en ts decreased gradually as their
po sit ion s from basa l to m iddle and upper segm en ts. It co rresponded to the change of endoge2
nou s IAA and ABA. T he ca llu s fo rm at ion s of basa l segm en ts had no associa ted w ith either
2, 42D o r com b ina t ion s of 2, 42D and BA in m edia, and co incided w ith the L ogist ic cu rve.
T he BA alone had no effect on ca llu s fo rm at ion. T he com b ina t ion of 2 m gı L - 12, 42D and 0.
5 m gı L - 1 BA w as recomm endab le fo r inducing the em b ryogen ic ca llu s. Endogenou s levels of
IAA in ca llu s cu ltu res reduced as the cu ltu re passed and the 2, 42D concen tra t ion increased.
Endogenou s levels of ABA w ere enhanced by 2, 42D , especia lly in 2 m gı L - 1. A s the endoge2
nou s level of ABA in the cu ltu res reached to m ax im um value, the em b ryogen ic ca lli fo rm ed.
T herefo re the occu rrence of em b ryogen ic ca llu s m igh t be rela te to endogenou s levels of
ABA , w h ich w as affected by 2, 42D.
Key words　M aize leaf; Em b ryogen ic ca llu s; 2, 42D; IAA ; ABA
2, 42D 的应用促进了禾本科植物组织培养工作、尤其是体细胞胚胎发生研究的发展。目
前禾谷类作物胚性愈伤组织的诱导, 多采用幼穗[ 1 ]、幼胚[ 2 ]和花序[ 3 ]等繁殖器官为外植体,
采用叶片的报道尚较少见。外植体的胚胎发生能力与其内源激素水平有关[ 4 ] , 低浓度的ABA
可刺激DNA 合成和细胞分裂[ 5 ]、参与细胞淀粉积累[ 3 ] , 并有利于胚性愈伤组织的长期保
X 本课题得到国家自然科学基金的资助。
收稿日期: 1998204213, 接收日期: 1998212218

持[ 6 ]。探索内源激素水平与外植体胚胎发生能力的关系及2, 42D 在其中的作用, 在理论和实
践上都具有重要意义。我们在对玉米叶片愈伤组织体细胞胚胎发生进行细胞形态学研究[ 7 ]的
基础上, 本文比较玉米幼叶不同形态学部位的愈伤组织和胚性愈伤组织形成能力, 并测定外
植体和培养物的内源 IAA 和ABA 水平, 为进一步探索2, 42D 对内源激素的作用及其与胚性
愈伤组织发生的关系提供依据。
1　材料和方法
1. 1　材料
供试材料为玉米 (Z ea m ays L. ) 品种“中单14”由中国农业科学院作物育种栽培研究所提
供。
1. 2　方法
1. 2. 1　材料的培养和取材　　玉米无菌苗的获得同前文[ 7 ]。取12～ 15天苗龄的无菌苗, 去胚
芽鞘和第一片外彼叶, 以内层剩余幼叶为外植体, 从靠近根部的顶端分生组织以上0. 5 mm
处连续切取, 分别作为基部 (0～ 5 mm )、中部 (5～ 10 mm )和上部 (10～ 15 mm ) 切段接种到培
养基上, 于24±1℃、每天光照16 h (2000 L x) 的条件下培养。记录愈伤组织形成和胚性愈伤
组织发生情况, 定期取样、精确称重, 贮于- 70℃低温冰箱中备用。
1. 2. 2　培养基的配制　　以M S 为基本培养基, 添加3% 蔗糖和500 m g ö L 水解酪蛋白, 附加
不同浓度的2, 42D 和BA 后, 调节 pH 为5. 8, 经15磅 (121℃)下高压灭菌20 m in 后备用。
图1　玉米幼叶培养物中 IAA 和ABA 的气相色谱分离
F ig. 1　Ch rom atogram s of IAA and ABA from pure standard
(1) 标准的 IAA 和ABA , (2) 样品中的 IAA 和ABA
(1) and from a cultu res of basal segm ent of young leaves of m aize (2)
1. 2. 3　内源 IAA 和ABA 水平的测定
　　采用 A2澳- 2, 3, 4, 5, 6- 五氟甲
苯 (PFB 2B r)衍生物气相色谱法[ 8 ]。取经
称重的植物样品, 加入适量丙酮在冰浴
中匀浆, 置- 20℃下避光浸提一昼夜,
砂芯漏斗抽滤, 丙酮洗残渣3次 (1 ÷ 1,
v ö v) , 弃残渣。滤液经无水M gSO 4脱水
处理, 过滤, 丙酮定容滤液至10 mL。
取滤液1 mL 于 Kı D 瓶中, 加400 LL
PFB 2B r 丙酮溶液 (340 m g ö L ) 和数粒无
水 K 2CO 3, 摇匀密封后置于55℃恒温水
浴准确回流90 m in, 取出冷却后N 2吹干
丙酮, 用正己烷定容至0. 5 mL。该样品
在V ISTA 26000气相色谱仪上测定, 测
定条件为W CO T 毛细管柱 (12 m ×0.
23 mm )、63 N i2ECD 检测器, SE230做
固定液, 高纯氮气为载气, 流速10 mL ö
m in, 尾吹40 mL ö m in, 分流比10 ÷ 1; 柱
温216℃, 气化室270℃, 检测室285℃, H P3390A 积分仪记录分析结果。以标准 IAA、ABA
作对照, 外标法计算回收率, 最后换算成含量 (ng ö gı fw ) (图1)。每个样品设3个重复。
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2　结果与分析
2. 1　玉米叶片形态学部位及内源激素水平对愈伤组织形成的影响
玉米幼叶基部、中部和上部切段愈伤组织形成的差异见图2。结果表明, 愈伤组织形成
能力自基部向上显著降低, 其中基部切段愈伤组织形成率高达80% , 愈伤组织发达; 而中部
图2　玉米不同形态学部位的叶片切段愈伤组织
诱导率、内源 IAA 和ABA 水平的比较
F ig. 2　Comparion of the induced frequncies of callus and the levels
of endogenous IAA and ABA in differen t segm ents of m aize.
1. 基部; 2. 中部; 3. 上部
1. basal segm ent; 2. m iddle segm ent; 3. upper segm ent
和上部愈伤组织形成能力低, 愈伤组
织仅限于切口边缘, 在继代培养中不
能增殖、褐变。气相色谱分析表明,
玉米叶片愈伤组织形成能力表现出的
这种形态部位差异, 可能与其内源激
素水平的高低有关 (图2)。叶片外植
体自基部向上其内源 IAA 和ABA 水
平显著下降, 基部切段的内源激素水
平均最高。但ABA 在叶片部位间的
差异又高于 IAA , 例如基部 IAA 和
ABA 水平分别是中部的2倍和2. 5倍。
外植体内源激素水平的这种差异可能
是导致愈伤组织形成能力不同的内部
因素。
2. 2　2, 4-D 和 BA 对胚性愈伤组织
发生的影响
以基部切段为外植体, 比较2, 42D 和BA 的不同浓度组合对愈伤组织和胚性愈伤组织形
成的影响。愈伤组织在培养的4～ 6天出现, 胚性愈伤组织则在第12～ 16天发生。2, 42D 及与
BA 组合对愈伤组织形成无显著影响, 而对胚性愈伤组织的诱导则表现出显著差异, 0. 5 m g ö
L BA 与2, 42D 组合都能诱导出胚性愈伤组织, 其中2 m g ö L 2, 42D 诱导率最高, 单独使用2,
　表1　6种培养基中玉米幼叶基部愈伤组织的形成和分化
　Table 1　Formation and differen tiation of ca llus der ived
from basal segmen ts of young leaves of ma ize in six induction media
植物生长物质含量
Conten t of p lan t
grow th regulato rs (m gı L - 1)
2, 42D BA
愈伤组织
形成率
Callus (% )
　
胚性愈伤组织
诱导率
Em bryogenic
callus (% )
愈伤组织不定
根形成率
Callus w ith
adventit ious roo ts (% )
　　　2. 0 　　　0 　 71. 7±8. 3 　　 4. 0±0. 5 　　　20. 0±3. 6
1. 0 0. 5 85. 3±10. 6 10. 8±2. 4 0
2. 0 0. 5 73. 2±7. 4 27. 3±5. 3 2. 3±0. 3
4. 0 0. 5 74. 5±8. 1 14. 6±2. 8 0
2. 0 1. 0 90. 2±11. 2 2. 4±0. 6 0
0 0. 5 5. 0±1. 5 0 0
42D 或提高BA 浓度
均显著降低胚性发生
能力, 前者更有利于
不定根形成。单独使
用BA 对愈伤组织形
成不利 (表2)。进一
步分析表明, 愈伤组
织生长曲线符合L o2
gist ic 方程, 愈伤组
织鲜重增长的临界值
为176 m g, 日平均增
长率为0. 23 (图3)。
2. 3　2, 4-D 对培养物内源 IAA 和ABA 水平的影响
　　用不同浓度的2 , 42D 附加0. 5m g ö L BA , 测定了培养物内源 IAA 和ABA 的水平 , 以分
7912期　　　　张东向等: 玉米叶片胚性愈伤组织诱导及其与内源 IAA 和ABA 关系的初步研究　　　　　

图3　玉米幼叶基部切段愈伤组织生长曲线
F ig. 3　Grow th curve of callus derived
from basal segm ents of m aize leaves
析内源激素与胚性愈伤组织发生的联系。表2显
示培养物中 IAA 水平随培养时间显著下降, 增
加2, 42D 浓度, IAA 水平下降更明显, 这表明2,
42D 可能是降低培养物中 IAA 水平的一个因素。
从内源ABA 变化来看, 对照组培养物不仅愈伤
组织形成率低 (5% ) , 而且内源ABA 水平较低,
并随培养时间不断下降 (表2) ; 同对照相比, 2,
42D 可提高相应的ABA 水平, 其中2 m g ö L 2, 42
D 作用尤为显著。伴随着胚性愈伤组织的发生,
内源ABA 水平均出现一个峰值, 其中1 m g ö L 2,
42D 出现在第16天; 而2和4 m g ö L 2, 42D 则出现
在第12天, 虽在第16天回落, 但第21天又有所提
高, 这可能与胚性细胞的进一步发育有关。相关
分析表明, 在2, 42D 的调节下, 玉米叶片胚性愈
伤组织诱导率与培养物内源ABA 水平呈显著的正相关 ( r= 0. 98413 3 )。因而玉米叶片胚性发
生能力与培养物内源ABA 水平密切相关, 2, 42D 浓度可能是决定ABA 水平的重要因素之
一。
表2　2, 4-D 对玉米幼叶基部切段愈伤组织中内源 IAA 和ABA 水平的影响
Table 2　Effects of 2, 4-D on endogenous levels of IAA and ABA in callus
cultures dur ing cultured per iod of basa l segmen ts of ma ize leaves
2, 42D 浓度
Conc. of 2, 42D
(m gı L - 1)
内源 IAA 水平
Endogenouse levels of IAA (ngı g- 1fw )
3rd day 21th day D rop ratio s (% )
内源ABA 水平
Endogenouse levels of ABA (ngı g- 1fw )
3rd day 12th day 16th day 21th day
CK 　 52. 87　 　 16. 38 　　 69. 0 　　8. 94 　　4. 17 　　2. 82 　　2. 20
1 41. 06 9. 00 78. 1 8. 72 7. 30 10. 30 9. 61
2 30. 38 2. 20 92. 7 20. 25 24. 56 19. 46 21. 37
4 16. 93 1. 21 92. 9 14. 48 15. 82 12. 63 13. 46
3　讨论
禾本科植物组织培养和体细胞胚胎诱导中2, 42D 的应用十分普遍[ 9 ]。R ay 等利用2 m g ö L
2, 42D 从玉米幼叶获得的松散、白色的愈伤组织, 继代在8 m g ö L 2, 42D 的培养基中才能诱
导出黄色的胚性愈伤组织[ 10 ]; 添加细胞分裂素对小麦胚性愈伤组织的形成和分化有利[ 11 ]。本
文结果表明, 2, 42D 在玉米幼叶愈伤组织形成和胚性愈伤组织诱导中必不可少, 它与低浓度
的BA 结合可不经继代培养直接获得一定比例的胚性愈伤组织 (表1) ; 单独使用BA 不利于愈
伤组织形成。本实验还发现, 玉米叶片的脱分化能力存在着品种差异, “中单14”愈伤组织形
成率高达80% , 而“中单120”仅为25% , 这可能是基因型差异的表现。
据报道, 狼尾草叶片的胚性发生能力和内源 IAA、ABA 水平因其形态学部位而异, 内源
激素水平高的幼叶基部, 其愈伤组织和胚性发生能力也较强[ 4 ] , 这与我们的结果相一致 (图2、
表1)。然而, 玉米叶片培养物 IAA 水平随时间而下降, 2, 42D 能导致 IAA 水平的进一步降
低 (表2) , Zam skaya 也观察到2, 42D 能降低玉米胚芽鞘切段内源 IAA 水平[ 12 ]。IAA 参与细
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胞伸长和胞壁沉积[ 13 ] , 但小麦胚芽鞘细胞伸长却明显被高水平的内源ABA 抑制[ 14 ] , 这表明
IAA 对植物细胞的作用行为与ABA 不同。IAA 水平随培养时间下降的原因及其与2, 42D 对
愈伤组织形成和胚性发生能力的影响的关系值得探讨。
ABA 单独或与 ZT、GA 3结合能有效抑制畸形胚的发生[ 15 ] , 内源ABA 参与体细胞胚胎
发生[ 4 ] , 低浓度的2, 42D 可提高玉米胚芽鞘ABA 水平[ 12 ]。本文结果表明, 伴随着胚性愈伤
组织发生, 培养物内源ABA 水平相应地出现一个峰值, 2, 42D 能提高内源ABA 水平, 并促
进胚性能力表达, 而且胚性愈伤组织诱导率与内源ABA 水平呈正相关, 2, 42D 可能通过调
节内源ABA 水平, 进而影响培养物胚性能力的表达。在合子胚发育过程中, ABA 可促进同
化产物的分配, 并在胚性基因表达中发挥重要作用[ 16 ]。ABA 在玉米叶片体细胞胚胎发生中
是否存在类似机制, 将做进一步研究。
参　考　文　献
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