全 文 ：Vol. 30 , No. 2
pp. 104～107 　Feb. , 2004
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 30 卷 第 2 期
2004 年 2 月 　104～107 页
甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育基因的 AFLP标记
陆光远　杨光圣 3 　傅廷栋 Ξ
(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室 ; 国家油菜武汉改良分中心 , 湖北武汉 430070)
摘 　要 　用甘蓝型油菜双基因显性细胞核雄性不育系 Rs1046A 和欧洲油菜品种 Samourai 构建了一个回交分离群体。在
群分法 (BSA)构建的不育池和可育池中共筛选了 256 对 AFLP 引物组合 ,找到了与不育基因紧密连锁的两个 AFLP 标记
( EA03MC1599和 EA07MC01235 ) , 它们与不育基因的遗传图距分别是 3. 5 cM和 5. 5 cM ,而且位于不育基因的同一侧 ,标记
间相距 2. 0 cM。这两个标记的发掘 ,对运用分子标记辅助选择技术来改良显性细胞核雄性不育两型系及其恢复系具有
重要意义。
关键词 　甘蓝型油菜 ; 显性细胞核雄性不育基因 ; AFLP标记
中图分类号 :S565
Identif ication of AFLP Markers Linked to the Dominant Genic Male Sterility Gene
in Brassica napus L.
LU Guang2Yuan , YANG Guang2Sheng , FU Ting2Dong
( National Key Lab of Crop Genetic Improvement ; National Center of Rapeseed Improvement in Wuhan , Huazhong Agricultural University , Wuhan 430070 , Hubei ,
China)
Abstract 　One backcross population was constructed from the dominant genic male sterile line Rs1046A in Brassica napus
L. and the rapeseed cultivar Samourai . Sterile bulk(BS) and fertile bulk(BF) prepared from above population using BSA
strategy were subjected to AFLP analysis. A total number of 256 primer combinations were used and two markers
( EA03MC1599 and EA07MC01235) tightly linked to the dominant genic male2sterile gene( Ms) were identified , with a map
distance of 3. 5 cM and 5. 5 cM , respectively. These two markers , 2. 0 cM away from each other and residing at the same
side of Ms , would play an important role in the genetic improvement of this GMS line through marker aided selection
(MAS) .
Key words 　Brassica napus L. ; Dominant genic male sterility gene ( Ms) ; AFLP markers
　　大量研究证明 ,利用杂种优势可以大幅度提高
油菜的产量[1～3 ] 。目前油菜杂种优势利用的主要途
径有细胞质雄性不育 ( CMS) 、细胞核雄性不育
( GMS) 、自交不亲和 (SI) 、化学杀雄等 (CHA) [4 ] 。在
世界范围内 ,细胞质雄性不育 (如 Pol CMS 等) 是第
一个研究比较深入而且应用最广泛的类型[5 ,6 ] ,对杂
交油菜的发展起了巨大的推动作用。但是它的局限
性也不容忽视 : (1) 某些类型的 CMS 易受环境因素
影响而产生微量花粉 ,导致杂交种纯度下降 ; (2) 不
育胞质可能存在负效应 ; (3)大面积推广单一胞质的
杂交种具有一定的潜在风险。因此有必要加强其他
杂种优势利用途径的研究。1972 年 ,四川省宜宾地
区农科所在甘蓝型油菜中发现了一种新型的细胞核
雄性不育材料宜23A ,李树林等[7 ,8 ] 的研究认为这种
材料的不育性状受控于一对显性基因 ,而且另有一
对显性基因可以通过上位作用抑制其表达 ,使育性Ξ基金项目 :国家重点基础研究发展规划项目 (2001C13108807) ;国家自然科学基金 (30080012) ; 湖北省自然科学基金 (2000J110) ; 教育部博
士点基金。
作者简介 :陆光远 (1974 - ) ,男 ,广西贵港人 ,华中农业大学植物科学技术学院在读博士生。3 通讯作者 :杨光圣。Tel : 027287281507 ; E2mail : rapelab @public. wh. hb. cn
Received(收稿日期) :2002212202 ,Accepted (接受日期) : 2003201222.

恢复正常。因此理论上 ,宜23A 有全不育系、临时保
持系和恢复系 ,可以采用“三系法”生产杂交种。这
种不育系的显著优点是败育彻底、稳定 ,不受细胞质
限制 ,而且通过常规的育种手段就可以把不育基因
和恢复基因转移到具有不同遗传背景的优良育种材
料中 ,从而选育出符合育种目标的显性细胞核雄性
不育三系。不过利用常规育种方法来选育核不育三
系的效率很低 ,因为在回交转育过程中 ,后代的基因
型变得较为复杂 ,用传统的育种手段难以对后代个
体的基因型进行快速有效的筛选 ,因此必须借助现
代生物技术手段 ,即首先找到与不育基因和恢复基
因紧密连锁的分子标记 ,然后借助于分子标记来辅
助选择。目前尚未见到这方面的研究报道。笔者以
双基因显性细胞核雄性不育两型系 Rs1046AB 和欧
洲油菜品种“Samourai”构建的回交分离群体为基础
材料 ,展开了筛选与不育基因连锁的分子标记的工
作 ,旨在为今后的分子标记辅助选择育种奠定基础。
1 　材料与方法
1. 1 　材料
　　甘蓝型油菜双基因显性细胞核雄性不育两型系
Rs1046AB 为本课题组保存材料 ,派生于宜23A 不育
系 ,另一个亲本“Samourai”为欧洲冬性甘蓝型油菜 ,
至少套袋自交 6 代以上 ,基因型未经鉴定。
1. 2 　方法
1. 2. 1 　群体构建 　双基因显性纯合两型系
Rs1046AB 已经连续通过兄妹交保存 10 代以上 ,兄
妹交后代的育性分离稳定在 1∶1 ,而且可育单株自
交后代又发生 3∶1 的育性分离 ,因此该材料在保存
过程中未发生混杂或变异 ,可以用于本研究。其中
不育株的基因型为 MsMsrfrf , 可育株的基因型为
MsMsRfrf 。以不育株为母本 ,与“Samourai”杂交 , F1
单株全部不育 ,与“Samourai”回交得到的 BC1 群体中
育性正常的有 176 株 ,彻底败育的有 158 株 ,卡方测
验表明育性分离比例符合 1∶1 (χ2c = 0. 8653 , P >
01250) 。由以上结果可知 ,“Samourai”的基因型很可
能是 msmsrfrf ,这个回交群体可以用于定位显性核不
育基因。
1. 2. 2 　DNA 提取 　对亲本及群体各单株编号挂牌 ,
然后采集嫩叶提取总 DNA , 具体过程参照李佳
等[10 ]的方法。
1. 2. 3 　不育池和可育池的构建 　根据花期育性调
查结果 ,随机选取 10 个可育单株和 10 个不育单株 ,
分别将其 DNA 等量混合构成可育池 (BF) 和不育池
(BS) 。
1. 2. 4 　AFLP 分析 　AFLP 的操作方法见前文报
道[11 ] ,选用的两种限制性内切酶是 EcoR Ⅰ和 Mse Ⅰ
(New England Biolab) ,对应的预扩增引物为 EA (5′2
GACTGCGTACCAATTCA23′)和MC (5′2GATGAGTCCT2
GAGTAAC23′) ,选择性扩增引物是在预扩增引物的
3′末端增加两个选择性碱基所得。对于在两个亲本
和两个样品池之间都有多态性的引物组合 ,用定位
群体检测其与目标性状的连锁遗传关系。
1. 2. 5 　数据分析 　数据处理用 MAPMAKERΠEXP
Version 3. 0 软件进行。
2 　结果与分析
2. 1 　AFLP引物筛选
　　本实验共用到 256 对引物组合。在亲本间筛选
了部分引物 ,发现所用的每对引物在亲本间均能检
测到多态性 ,说明亲本间的遗传差异较明显 ,而且
AFLP 标记技术具有很强的检测多态性的能力 ,这些
引物组合平均可以扩增出 60. 2 条清晰的带纹 ,表现
出多态性的有 7. 9 条 (13. 12 %) ,其中差异片段来源
于 Rs1046A 的占 48. 10 % ,来源于“Samourai”的占
51190 % ,两者基本相当 ,但仅有来源于 Rs1046A 的
差异片段才有可能成为与不育基因连锁的标记。鉴
于以上结果 ,为加快实验进度 ,直接用不育池和可育
池来筛选引物。筛选结果表明 ,能在两个池间揭示
出多态性的引物组合仅有 8 对 ,而且有两对明显地
表现为假阳性[表现为在可育池 ( msmsrfrf ) 有带而不
育池 ( Msmsrfrf ) 无带 ] ,其余的 6 对引物组合经 3 次
重复 后 仍 有 3 对 ( EA03MC15、EA07MC01 和
EA15MC04)可以稳定、清晰地扩增出差异片段 ,这很
可能是与目标基因连锁的标记。
2. 2 　与不育基因连锁的 AFLP标记
选用 定 位 群 体 的 部 分 单 株 对 引 物 组 合
EA03MC15、EA07MC01 和 EA15MC04 做进一步的筛
选 ,结果发现 , EA03MC15、EA07MC01 与不育基因紧
密连锁 ,分别能扩增出分子量为 99 bp 和 235 bp 的
差异片段 (图 1 ,图 2) ,而 EA15MC04 与目标性状呈
现出松散的连锁关系 ,予以剔除。对于紧密连锁的
标记 EA03MC1599和 EA07MC01235 ,用样本容量为 254
株的定位群体进行单株 PCR 检测 ,统计结果见表 1。
将分子标记和形态性状的统计数据输入电脑并运行
Mapmaker 程 序 , 结 果 表 明 标 记 EA03MC1599 、
501　2 期 陆光远等 :甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育基因的 AFLP标记 　　　

EA07MC01235与不育基因 Ms 的遗传图距分别为 3. 5
cM和 5. 5 cM ,对应的 LOD 值为 59. 57 和 52. 93。以
上两个标记位于不育基因的同一侧 ,标记间相距
210 cM ,LOD 值为 65. 78 (图 3) 。
图 1 AFLP标记 EA03MC1599在 BC1 群体中的分离情况
Fig. 1 Segregation of AFLP marker EA03MC1599 in the BC1 population
Arrow (right) indicates a 99 bp fragment associated with the male sterility. M: 100 bp DNA ladder ;
P1 : Rs1046A ; P2 : Samourai ; F : fertile plant ; S : sterile plant . Recombinant plant is labeled with 3 .
图 2 AFLP标记 EA07MC01235在 BC1 群体中的分离情况
Fig. 2 Segregation of AFLP marker EA07MC01235 in the BC1 population
Arrow (right) indicates a 235 bp fragment associated with the male sterility. M: 100 bp DNA ladder ; P1 : Rs1046A ;
P2 : Samourai ; F : fertile plant ; S : sterile plant . Recombinant plant is labeled with 3 .
601 　　　作 　　物 　　学 　　报 30 卷 　

表 1 AFLP标记在 BC1 群体中的扩增情况统计
Table 1 Segregation of AFLPs in the BC1 population
标记
Marker
可育 Fertile 不育 Sterile
+ 3 - + -
EA03MC1599 5 123 122 4
EA07MC01235 8 120 120 6
　　注 : 3 + Π- 有Π无特异带。Note : PresenceΠabsence of specific frag2
ment .
图 3 甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育基因的 AFLP标记连锁图
Fig. 3 A linkage group of AFLP
markers surrounding Ms locus in Brassica napus L.
3 　讨论
目前 ,关于甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育的
报道仅有两例 ,即 Mathias R[11 ]报道的单基因显性细
胞核雄性不育和李树林等[8 ]报道的双基因显性细胞
核雄性不育。一般说显性细胞核雄性不育是找不到
恢复系的 ,但是李树林报道的材料则不同 ,它除了不
育基因之外 ,还有一对抑制基因 ,该基因通过显性上
位作用来抑制不育基因的表达从而恢复育性 ,起到
恢复基因的作用 ,因而可以采用“三系”法制种。本
课题组保存的其他育种材料均未发现携带有显性核
不育基因 ,但 1999 年在 14 份农艺性状较好的品系
(品种)中却筛选到 3 份 (21. 42 %) 带有抑制基因 (恢
复基因)的材料 ,这说明恢复系可以从优良育种材料
中直接筛选到 ,而优良的细胞核雄性不育系则必需
进行回交转育。杂合两型系 ( 1Π2 Msmsrfrf + 1Π2
msmsrfrf )的转育工作相对比较简单 ,只需用优良亲
本不断地与细胞核雄性不育株回交即可 ,但在制种
时必须及时拔除 50 %的可育株 (1Π2 msmsrfrf ) ,十分
费时费力 ,而利用纯合两型系 (1Π2 MsMsrfrf + 1Π2
MsMsRfrf ) 则可避开这些麻烦 ,不过纯合两型系的选
育难度要大得多 ,因为转育过程中要同时兼顾到不
育基因和恢复基因 ,而且用传统的选育方法很难对
回交后代个体的基因型进行有效的选择 ,这也是到
目前为止利用该不育系统还没有选育出大面积推广
的双低杂交组合的原因之一。本文在一个回交分离
群体中找到了两个与不育基因紧密连锁的 AFLP 标
记 ,为利用分子标记辅助选择技术选育纯合两型系
打下了良好的基础。尽管这两个标记是显性遗传
的 ,与目标基因之间还有一定的距离 ,而且它们分布
于不育基因的同一侧 ,但在种质资源评估和标记辅
助选择育种中仍然具有一定的应用价值。下一步工
作是将获得的 AFLP 标记转化为稳定性更好、特异
性更高、使用更加方便的 SCAR ( Sequence Character2
ized Amplified Region) 标记 , 以期为育种工作提供一
个可靠实用的检测手段。
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701　2 期 陆光远等 :甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育基因的 AFLP标记