全 文 ：Vol. 31 , No. 7
pp. 876 - 881 　July , 2005
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 31 卷 第 7 期
2005 年 7 月 　876～881 页
导入反义 Wx 基因改良杂交籼稻保持系直链淀粉含量
高方远1 　王宗阳2 　李浩杰1 　陆贤军1 　任光俊1 , 3
(1 四川省农业科学院作物研究所 ,四川成都 610066 ; 2 中国科学院上海植物生理生态研究所 ,上海 200032)
摘 　要 : 水稻胚乳中的直链淀粉含量是影响稻米蒸煮和食味品质的重要性状。本试验研究了适合水稻冈 46B 和 Ⅱ232B
品种进行遗传转化的外植体、培养基及光温条件 ,采用遗传转化技术将反义 Wx 基因导入生产上大面积应用的籼稻保持
系冈 46B 和 Ⅱ232B ,获得了转基因植株。PCR 检测证明 ,外源基因已整合进水稻的基因组。分析结果表明 ,纯合转基因
水稻植株成熟种子直链淀粉含量发生了不同程度的变异。
关键词 : 反义 Wx 基因 ;转基因水稻 ;籼稻 ;保持系 ;直链淀粉含量
中图分类号 : S511
Antisense Wx Gene Insertion into Maintainer Lines of Indica Hybrid Rice Results in
Amylose Content Reducing
GAO Fang2Yuan1 ,WANG Zong2Yang2 ,LI Hao2Jie1 ,LU Xian2Jun1 ,REN Guang2Jun1 , 3
(1 Crop Research Institute , Sichuan Academy of Agricultural Sciences , Chengdu 610066 , Sichuan; 2 Shanghai Institute of Plant Physiology and Ecology , Chinese A2
cademy of Sciences , Shanghai 200032 , China)
Abstract : Amylose content of endosperm is a key determinant for edible and cooking quality in rice1 And the Wx gene of
rice ecodes a granule2bound starch synthase( GBSS) that plays a key role in the synthesis of amylose in endosperm1 With
the help of Agrobacterium tumefaciens EHA105 containing p13W4 , the antisense Wx gene was transferred into mature em2
bryos calli from indica maintainer lines Gang 46B and Ⅱ232B1 The suitable explants , medium , light and temperature for
tissue culture were studied1 PCR analysis verified that antisense Wx gene was transferred into the genome of the receptor
varieties(Fig. 2) 1 Furthermore , varying degrees of reduction in amylose content were found in mature seeds of transgenic
lines1 Compared with 2615 % of the original cultivar , in the transgenic lines of Ⅱ232B , the average and the lowest amylose
content were 1918 % and 815 % respectively(Table 5) 1Similarly , the amylose content in the transgenic lines of G46B were
117 % - 1019 % lower than that of control (Table 4) 1These results indicate that genetic manipulation of amylose content in
rice is possible using antisense technique1
Key words : Antisense Wx gene ;Transgenic rice ; Indica ; Maintainer line ; Amylose content
　　育种实践证明 ,籼稻保持系及其不育系胚乳中
直链淀粉含量偏高 ,将严重影响杂交稻米的蒸煮和
食味品质。但是 ,单纯依靠传统育种方法 ,往往难以
实现品质与产量、抗性等重要优良性状的有机结合 ,
这也正是我国杂交籼稻品质改良进展缓慢的原因之
一。而现代分子生物学手段的飞速发展 ,为杂交籼
稻品质改良提供了新的技术途径。
已知水稻胚乳中的直链淀粉合成是由第 6 染色
体上的蜡质基因 (简称 Wx 基因) 控制的。中国科学
院上海植物生理研究所洪孟明等成功分离、克隆了水
稻的 Wx 基因 ,并构建了包含反义 Wx 基因的载体[1 ]。
已有研究证明 ,采用遗传转化技术将反义 Wx 基因导
入水稻品种 (包括籼稻和粳稻) ,可引起直链淀粉含量
不同程度的降低 ,而且这些导入的外源基因以及改良
的直链淀粉含量都能稳定遗传[2～7] 。
本研究通过农杆菌介导 ,将反义 Wx 基因导入
籼稻保持系冈 46B 和 Ⅱ232B 中 ,引起直链淀粉含量
的广泛变异。
基金项目 : 国家转基因植物研究与产业化开发专项 (J Y032B211)和四川省应用基础研究项目。
作者简介 : 高方远 (1971 - ) ,女 ,硕士 ,副研究员 ,研究方向 :分子生物学。E2mail : chaojidao @1631net 3 通讯作者 :任光俊。Tel : 0282
84794737
Received(收稿日期) : 2004207205 , Accepted(接受日期) : 20042112191

1 　材料和方法
111 　试验材料
　　选用籼稻保持系冈 46B 和 Ⅱ232B 的成熟胚和
幼胚作为遗传转化的受体材料。冈 46B 和 Ⅱ232B
的相应不育系为我国中籼稻区和部分晚稻区的主要
不育系。
112 　农杆菌菌株及质粒
根癌农杆菌 ( Agrobacterium tumefaciens ) 菌株
EHA105 和含有反义 Wx 基因的载体 p13W4 均由中
国科学院上海植物生理生态研究所王宗阳教授提
供 ,其 T2DNA 区的结构见图 1。以特异引物 W4P1 :
5′2TGGCAAGAACAAGCATAGACC23′(在反义 Wx 的
BamH Ⅰ片段中 ) 和 W4P2 : 5′2TAACATACGGCGT2
GACATCG23′(在 GUS 基因编码区中) 可扩增出 626
bp 的片段 ,被用于转基因 T0 代及后代的遗传鉴定。
113 　培养基
用于试验的主要培养基见表 1。
图 1 p13W4 载体的 T2DNA区结构
Fig11 The structure of T2DNA region in the vector of p13W4
B : BamHⅠ; E : EcoR Ⅰ; H : Hind Ⅲ; P : Pst Ⅰ; S : Sal Ⅰ; X: Xba Ⅰ; N : Not Ⅰ; TSS: transcription start site ; ATG: translation start codon ;
TGA : transcription termination codon ; AATAAA : polyadenylation site1
表 1 愈伤组织培养基
Table 1 Medium used for calli culture in the study
培养基 Medium MS1 AAM MS2 NB1 NB2 1/ 2MS
基本成分 Composition MS AA + MS MS NB NB MS
CH(g/ L) 500 500 500 1000 1000
2 ,42D(mg/ L) 210 210 210
KT(mg/ L) 2 2
NAA(mg/ L) 1 1
Hyg(mg/ L) 35 - 50 50 25
Cef (mg/ L) 250 250 200
As(μmol/ L) 100
蔗糖 Sucrose (g/ L) 30 6815 30 30 30 15
葡萄糖 Glucose (g/ L) 36
pH 518 512 518 518 518 518
778　第 7 期 高方远等 :导入反义 Wx 基因改良杂交籼稻保持系直链淀粉含量 　　　

114 　水稻成熟胚愈伤组织的诱导
以水稻成熟种子胚、幼胚作为外植体。成熟种
子去壳后用乙醇 (75 %) 表面消毒 2～3 min ,洗净后
再用次氯酸钠溶液 (2 %活性氯) 浸泡 30 min ,无菌水
冲净后置诱导培养基上。幼胚取自受精后 12～15 d
的幼穗 ,乙醇 (75 %)消毒后 ,用 011 %的升汞灭菌 15～
20 min ,无菌水冲净后 ,剥离幼胚置培养基上诱导愈伤。
115 　根癌农杆菌介导的水稻转化
将 50 mL 培养至对数期的农杆菌离心去上清
后 ,再用 AAM 培养基 (其中加 100μmol/ L 乙酰丁香
酮)重悬 ,并立即浸染愈伤组织 ,浸泡时间为 20～30
min。愈伤组织与农杆菌共培养 2～3 d 后 ,转入MS2
培养基 (含 35 mg/ L 潮霉素和 250 mg/ L 头孢) 筛选 2
周左右。新长出的抗性愈伤组织转移至含 50 mg/ L
潮霉素和 250 mg/ L 头孢的 MS2 培养基继代 2 次 ,每
次 2 周左右。经 3 次继代后的抗性愈伤组织转入
NB1 培养基 ,置暗处预分化 1 周 ,再转入 NB2 培养基
光照培养分化幼芽 ,待幼芽长至 2～3 cm 时转入 1/ 2
MS生根培养基 ,随后转入温室。
116 　转基因水稻植株总 DNA的提取及 PCR分析
11611 　DNA 的提取 　　参照 Murray 等的方法[6 ] ,
略作修改。
11612 　PCR 分析 　　反应体积为 25μL ,反应体系
包括 Tris2HCl (pH 813) 10 mmol/ L、KCl 50 mmol/ L、
MgCl2 210 mmol/ L、dNTP 每种 012 mmol/ L、前后引物
各 50 ng、Taq 酶 115 U、基因组 DNA 100 ng。反应程
序为 94 ℃变性 5 min ,以后 94 ℃变性 45 s、56 ℃退火
45 s、72 ℃延伸 1 min ,循环 45 次 ,最后在 72 ℃延伸 10
min。产物在 112 %琼脂糖凝胶上电泳 , GDS Doc
1000 成像系统成像 ,并记录结果。
117 　转基因水稻植株后代的遗传分析
11711 　潮霉素抗性遗传分析　　单株收取 T0、T1 代
植株的套袋自交种子 ,消毒后接种于含 50 mg/ L 潮
霉素的 1/ 2MS培养基上光照培养 2 周后 ,统计种子
对潮霉素的抗性情况。
11712 　目的基因的 PCR 扩增及 PCR2Southern 分析
　　经潮霉素抗性筛选为阳性的转基因 T1 和 T2 代
小苗 ,按单株取叶片提取 DNA ,进行反义 Wx 基因的
PCR 扩增 ,方法同 11612。
以质粒 p13W4 为模板的 PCR 扩增产物回收、纯
化后 ,用作探针 ,按 Roche 公司 DIG DNA Labeling and
Detection Kit 上的方法 ,对质粒 DNA、未转基因植株
和部分 PCR 阳性植株 DNA 的 PCR 扩增产物进行
PCR2Southern 杂交。
118 　直链淀粉含量测定
参照中国水稻研究所的改进简化法测定样品的
直链淀粉含量 ,2 次重复。标准样品 (其直链淀粉含
量预先经 ISO 664721987 或 GB 7648 方法准确测定)
购自农业部稻米及制品质量监督检验测试中心。
2 　结果与分析
211 　不同外植体和培养基对水稻愈伤组织诱导率
和分化率的影响
　　本研究同时使用成熟胚和幼胚为接种对象 ,结
果显示 Ⅱ232B 和冈 46B 的成熟胚在 2 种培养基上的
平均分化率略低于幼胚 ,但以培养率 (平均出愈率 ×
平均分化率)来衡量 ,成熟胚的分化效果好于幼胚。
加之成熟胚操作简单 ,取材不受季节限制 ,在后续实
验中 ,确定以成熟胚作为遗传转化的主要受体材料。
表 2 不同培养基对水稻愈伤组织诱导率和分化率的影响
Table 2 Effects of medium on induction and differentiation of calli
外植体
Explant
品种
Cultivar
基本培养基
Basic medium
诱导胚总数
Total embryo
总愈伤数
Total callus
分化愈伤数
Total differentiated
callus
平均出愈率
Average rate of
callus induction
( %)
平均分化率
Average rate of
differentiation
( %)
培养率
Average rate
of culture
( %)
成熟胚
Mature
embryo
Ⅱ232B
Gang 46B
MS 140 127 25 9014 1917 1718
NB 157 132 37 8411 2810 2315
MS 303 278 62 9117 2213 2014
NB 233 192 50 8214 2610 2114
幼胚
Immature
embryo
Ⅱ232B
Gang 46B
MS 210 150 33 7114 2210 1517
NB 193 96 29 4917 3012 1510
MS 116 71 20 6112 2812 1713
NB 156 78 22 5010 2812 1411
　　注 : 平均出愈率 ( %) = 总愈伤数/ 诱导胚总数×100 ; 平均分化率 ( %) = 分化愈伤数/ 总愈伤数×100 ; 培养率 ( %) = 平均出愈率×平均分
化率
Notes : Average rate of callus induction( %) = Total callus/ Total embryo ×100 ; Average rate of differnetiation( %) = Total differentiated callus / Total callus
×100 ; Average rate of culture ( %) = Average rate of callus induction ×Average rate of differentiation1
878 　　　　作 　　物 　　学 　　报 第 31 卷 　

　　此外 ,将同一水稻品种接种在 2 种不同的培养
基上 ,诱导和分化能力表现较大差异。由表 2 可见 ,
两个水稻品种的幼胚和成熟胚在 MS 培养基上的平
均出愈率高于在 NB 培养基上。但从平均分化率来
看 ,NB 培养基的分化效果好于 MS 培养基。因此 ,
本研究针对 Ⅱ232B 和冈 46B 受体品种 ,选用 MS 作
为诱导培养基 ,NB 作为分化培养基 ,将有助于水稻
高效转化体系的建立。
212 　不同光温条件对抗性愈伤分化率的影响
将Ⅱ232B 和冈 46B 来源的抗性愈伤组织置不同
强度的光照和温度下分化培养 ,平均出苗率有很大差
异。表 3 的统计结果显示 ,Ⅱ232B 来源的抗性愈伤组
织在 3 000μmol·m - 2·s - 1和 30 ℃条件下分化平均出苗
率最高 ,达 3414 % ,在 2 000μmol·m - 2·s - 1条件下分化 培养 ,出苗率最低 ,仅为 2414 %。而来源于冈 46B 的抗性愈伤组织刚好相反 ,在 2 000μmol·m - 2·s - 1和26 ℃条件下出苗率最高 ,在 3 000μmol·m - 2·s - 1和30 ℃条件下平均出苗率最低 ,仅为 2313 %。由此看出 ,不同材料的分化条件存在很大的差异。213 　农杆菌介导转化及转基因植株的获得以籼稻保持系冈 46B 和 Ⅱ232B 的成熟种子和幼胚为受体材料 ,在 MS 和 NB 培养基上预培养 1 d后 ,用农杆菌 EHA105/ p13W4 转化。在 Ⅱ232B 中 ,共转化 340 个愈伤组织 ,经筛选获得 103 个抗性愈伤组织 ,转化率为 3013 %。抗性愈伤组织在 NB1 培养基上预分化 1 周 ,再转入 NB2 培养基进行植株再生 ,最终分化绿苗 30 株。在冈 46B 中也获得了相似的转化率 (2812 %) ,最后获得 11 个转基因植株。
表 3 不同光温条件对抗性愈伤分化率的影响
Table 3 Effects of light and temperature on regeneration of resistant calli
品种
Cultivar
光照
Light
(μmol·m - 2·s - 1)
温度
Temperature
( ℃)
抗性愈伤数
No. of resistant
callus
出苗数
No. of
plantlets
平均出苗率
Average rate
of regeneration
( %)
Ⅱ232B 2 000 26 45 11 24143 000 26 40 10 25102 000 30 37 11 2917
3 000 30 32 11 3414
冈 46B
2 000 26 50 18 3610
3 000 26 41 13 3117
2 000 30 30 8 2617
3 000 30 43 10 2313
　　注 : 平均出苗率 ( %) = 出苗数/ 抗性愈伤数×100。
Note : Average rate of regeneration( %) = No. of plantlets/ No. of resistant callus ×100.
214 　转基因 T0 代水稻植株的分子检测
提取转基因 T0 代植株和对照植株 (未经转基因
的亲本) 的叶片 DNA ,以 p13W4 质粒 DNA 作阳性对
照 ,用 W4P1 和 W4P2 引物进行 PCR 扩增。41 个单株
中有 37 株出现预期的 626 bp 的扩增片段 ,与阳性对
照完全相同 ,只有 4 株与阴性对照一样 ,无扩增片段
(图 2) 。
PCR2Southern 杂交结果显示 ,所有 PCR 阳性植
株都有杂交信号 ,与阳性对照相同 ,而未转基因植株
无条带出现 (图 3) 。
215 　转基因水稻后代的遗传分析
21511 　转基因水稻植株 T1 和 T2 代潮霉素抗性筛选
　　未转基因植株和 PCR 检测为阳性的 37 个 T0 代
植株的部分套袋自交种子经潮霉素抗性筛选 ,结果
显示 ,所有 T0 植株的自交种子都发生了对潮霉素抗
性的分离 ,χ2 检验表明 ,抗与不抗大多符合 3∶1 的
分离比。推测外源基因大多以单拷贝方式插入。T1
图 2 部分转反义 Wx 基因植株总 DNA的 PCR分析
Fig12 PCR analysis of total DNA in some transgenic plants
M: DNA 分子量标准 ;1 : 质粒 p13W4 ;2 : 未转化植株 ;
3～14 : 转基因植株。
M: DNA marker ;1 : Plasmid p13W4 ;2 : Non2transgenic plant ;
3 - 14 : Transgenic plants1
植株上收获的种子按相同的办法筛选潮霉素抗性 ,
以获得对潮霉素抗性纯合的转基因株系。
21512 　转基因水稻植株 T1 和 T2 代 PCR 分析 　　
经潮霉素筛选获得的抗性小苗分单株提取 DNA 用
于 PCR 扩增。绝大部分单株能扩增出 626 bp 的条
带 ,只有个别单株有潮霉素抗性而无扩增条带。两
个基因连锁不稳定的原因有待进一步分析。
978　第 7 期 高方远等 :导入反义 Wx 基因改良杂交籼稻保持系直链淀粉含量 　　　

图 3 部分转基因植株 PCR2Southern 分析
Fig13 PCR2Southern analysis of antisense Wx
gene in some transgenic plants
1 :质粒 p13W4 ;2 :未转化植株 ; 3～8 :转基因植株。
1 :Plasmid p13W4 ;2 :Non2transgenic plant ;
3 - 8 :transgenic plants1 216 　转基因稳定株系直链淀粉含量分析从 T2 代纯合转基因植株和相应的未转基因植株上收获种子 ,用改进简化法测定直链淀粉含量。结果显示 ,与未转化对照相比 ,纯合转基因植株成熟种子直链淀粉含量均有不同程度的降低。由表 5 可见 ,对照为 2615 % ,最低值 815 % ,平均为 1918 %。由冈 46B 来源的纯合转基因植株成熟种子直链淀粉含量与对照相比 ,也出现了不同程度的降低 ,降低幅度在 117 %～1019 %之间 (表 4) 。
表 4 冈 46B来源的纯合转基因水稻植株成熟种子的直链淀粉含量
Table 4 Amylose content in mature seeds of transgenic rice derived from Gang 46B
编号
Line
直链淀粉含量
Amylose content
( %)
编号
Line
直链淀粉含量
Amylose content
( %)
编号
Line
直链淀粉含量
Amylose content
( %)
编号
Line
直链淀粉含量
Amylose content
( %)
B121 2118 B126 2212 B1211 2113 B1216 1819
B122 2115 B127 2112 B1212 2115 B1217 1818
B123 2112 B128 2416 B1213 2110 B1218 2015
B124 1514 B129 2019 B1214 1717 Control 2613
B125 1613 B1210 2112 B1215 2011
表 5 Ⅱ232B来源的纯合转基因水稻植株成熟种子的直链淀粉含量
Table 5 Amylose content in mature seeds of transgenic rice derived from Ⅱ232B
编号
Line
直链淀粉含量
Amylose content
( %)
编号
Line
直链淀粉含量
Amylose content
( %)
编号
Line
直链淀粉含量
Amylose content
( %)
编号
Line
直链淀粉含量
Amylose content
( %)
B221 2110 B229 2010 B2217 2116 B2225 2112
B222 1919 B2210 1512 B2218 2117 B2226 2017
B223 1910 B2211 2012 B2219 2019 B2227 1915
B224 2014 B2212 1817 B2220 1914 B2228 2117
B225 1913 B2213 1915 B2221 815 B2229 2016
B226 1919 B2214 2210 B2222 2112 B2230 2014
B227 1913 B2215 2015 B2223 2014 B2231 2112
B228 2010 B2216 2111 B2224 1913 Control 2615
3 　讨论
311 　遗传转化体系的优化
　　成功的遗传转化有赖于良好的受体系统、转化
系统以及最佳的愈伤组织诱导、筛选和分化条件。
选择合适的受体材料将直接影响遗传转化的效
率[4 ,8 ] 。幼胚在以前的研究中被认为是一种较理想
的转化受体材料 ,利用幼胚转化已有许多成功的报
道[2～7 ] 。但本研究结果显示 ,选择成熟胚作为转化
受体 ,同样可获得较高的出愈率和分化率 ,而且取材
不受季节限制 ,操作简单、重复性好 ,极大方便了农
杆菌介导的基因转化。
此外 ,培养基是愈伤组织诱导以及植株再生的
营养来源 ,合理选择培养基同样重要。许多研究表
明 ,以 NB 作为诱导愈伤组织的基本培养基 ,MS 作
为植株分化的基本培养基能获得高的遗传转化效
率[4 ,8 ] 。而国际水稻研究所 Tu 等则在遗传转化实
验中 ,采用 MS 培养基诱导愈伤组织 ,NB 培养基分
化绿苗[9 ] 。本研究通过比较发现 ,选择后一种培养
基更适合冈 46B 和 Ⅱ232B 的遗传转化。这可能与
不同受体材料在愈伤组织诱导或植株再生阶段所需
的营养存在差异有关。
同时 ,植株再生的光温条件 ,也是影响水稻遗传
转化效率的因素之一。这在以前的研究中很少报
道。本研究结果显示 , Ⅱ232B 适合在高光强 (3 000
μmol·m - 2·s - 1) 和高温 (30 ℃) 条件下分化 ,而冈 46B
则在中等光照强度 (2 000μmol·m - 2·s - 1) 和温度
(26 ℃)下获得最高分化率。推测光温条件选择不
当 ,可能是一些遗传转化实验失败或植株再生频率
低的主要原因。因而在对某个材料进行遗传操作以
前 ,应首先了解它的特征、特性 ,再根据实际情况有
针对性地选择合适的光照和温度。
088 　　　　作 　　物 　　学 　　报 第 31 卷 　

312 　反义 Wx 基因导入水稻改良稻米品质
反义 RNA 抑制法和转基因的方法是利用基因
工程技术改良植物品种的常用策略和方法 ,目前已
在改变花卉颜色、果蔬保鲜、抗病虫害等方面取得重
要进展。改良稻米品质方面 ,Terada 等 (2000) 、Cheng
等 (2002) 、Yu 等 (2002) 、Liu 等 (2003)先后将反义 Wx
基因导入水稻品种 (包括籼稻和粳稻) 中 ,均引起成
熟种子直链淀粉含量的降低[2～7 ] 。这些结果证明导
入反义 Wx 基因可以改变稻米直链淀粉含量。本研
究通过农杆菌介导法将反义 Wx 基因转入在生产上
推广应用的杂交籼稻的两个保持系冈 46B 和 Ⅱ232B
中 ,同样引起直链淀粉含量的广泛变异 ,进一步验证
了前人的结果。此外 ,从纯合转基因株系中选择直
链淀粉含量中等 (17 %～21 %) ,其他农艺性状接近
受体亲本的材料 ,用基因敲除手段排除潮霉素抗性
基因后 ,再与相应不育系回交 ,以获得米质改良的新
不育系。这一手段为杂交籼稻优质育种目标的实现
提供了新思路。
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188　第 7 期 高方远等 :导入反义 Wx 基因改良杂交籼稻保持系直链淀粉含量