全 文 ：第26卷 第5期 作　物　学　报 V ol. 26, N o. 5
2000 年9月 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA Sep. , 2000
甘蓝型油菜 Pol CM S 育性恢复基因的 RAPD 标记X
王俊霞　杨光圣　傅廷栋　孟金陵
(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室, 湖北武汉, 430070) (华中农业大学农学系, 湖北武汉, 430070)
提　要　采用恢、保回交群体和集团分离分析 (BSA ) , 筛选了860个10 m er 随机引物, 找到了与甘蓝型
油菜波里马细胞质雄性不育系 (Po l cm s)育性恢复基因 (R f )连锁的两个RA PD 标记A H 19690和A I16830。
它们位于 R f 的一侧, 与该基因的遗传图距分别为5. 9 cM 和13. 6 cM , 两标记间的遗传图距为7. 8 cM。
这两个RA PD 标记的发掘, 为进一步利用分子标记辅助选育 Po l cm s 新恢复系打下了基础。
关键词　甘蓝型油菜; 波里马细胞质雄性不育; 恢复基因; RA PD 标记; 集团分离分析
Iden tif ica tion of RAPD M arkers L inked to the Fertil ity Restor ing Gene
for the Pol ima CM S in Rapeseed (B rassica napus L. )
WAN G Jun2X ia　YAN G Guang2Sheng　FU T ing2Dong　M EN G J in2L ing3
(N ational K ey L aboratory of C rop Genetic Im p rovem ent, H uazhong A g ricultural U niversity , W uhan, 430070) (D epartm ent of
A g ronom y , H uazhong A g ricultural U niversity , W uhan, 430070)
Abstract　Bulked segregan t analysis w as used to iden tify random amp lified po lymorph ic DNA
(RA PD ) m arkers linked to the fertility resto ring gene fo r the Po lim a cytop lasm ic m ale sterility
(Po l cm s) in rapeseed (B . nap us L. ). To tally 860 random 102m er p rim ersw ere screened on the
DNA samp les of fertile and sterile bulk s. Two p rim ers, A H 19 and A I16, p roduced repeatable
po lymorph ic bands betw een the paired bulk s. DNA samp les from individual p lan ts of a back cross
population ( 1141A ö H ui5200) ö ö 1141B ) w ere then used as DNA samp les temp late fo r PCR
amp lification w ith these two p rim ers. RA PD data w as analyzed w ith p rogram of Jo inm ap. T he
results indicated that the RA PD m arkers, A H 19690 and A I16830 w ere linked to the Po l cm s R f
gene at one side, w ith a m ap distance of 5. 9 cM and 13. 6 cM , respectively. T he distance
betw een the two m arkers w as 7. 8 cM.
Key words　B rassica nap us; Po lim a cytop lasm ic m ale sterility; R esto ring gene; RA PD m arkers;
Bulked segregan t analysis
傅廷栋 (Fu T. D )于1972年在甘蓝型油菜品种波里马中首次发现波里马细胞质雄性不育
(Po l cm s) [ 1 ] , 国际上认为是“第一个有实用价值的油菜细胞质雄性不育类型”, 被广泛应用于
杂交种选育[ 2, 3 ]。由此, 各国学者对 Po l cm s 恢复基因的筛选和遗传的研究十分重视, 做了大
量工作。结果表明: Po l cm s 的育性恢复受一对显性基因 (R f ) 所控制, 主要存在于欧洲甘蓝
型油菜品种中, 而在中国、日本、加拿大的甘蓝型品种中很少或没有。由于甘蓝型油菜
(AA CC)、白菜型油菜 (AA )和芥菜型油菜 (AABB ) 中都发现了 Po l cm s 的恢复基因 (R f ) , 因
X 国家高技术研究发展计划 (101202203201)资助项目
收稿日期: 1998212210, 接受日期: 1999204212

此R f 可能位于A 组染色体上[ 4～ 7 ]。
在油菜细胞质雄性不育 (CM S)研究中, D elourm e, R. 等用138个10 m er 随机引物筛选到
与油菜O gura cm s 的育性基因紧密连锁的4个RA PD 片段[ 8 ]。Jean, M. 等采用3个甘蓝型油菜
回交群体, 鉴定出与 Po l cm s 的育性位点连锁的10个R FL P 标记和1个RA PD 标记, 并将 R f
定位到甘蓝型油菜的第18连锁群上, 但其RA PD 标记距离目的基因偏远[ 7 ]。本研究以优质杂
交种华杂3号的恢复系与保持系构建的回交群体为基础, 在恢5200的背景中, 寻找与波里马
育性恢复基因更为紧密连锁的RA PD 标记, 以期为恢复系的遗传改良提供辅助手段, 并为进
一步分离、克隆波里马育性恢复基因 (R f )打基础。
1　材料与方法
1. 1　材料　　Po l cm s 恢复系恢5200和不育系1141A 及其保持系1141B , 均由华中农业大学
油菜研究室提供。恢5200的基因型为R f R f , 1141A、1141B 的基因型均为 rf rf 。
1. 2　方法
1. 2. 1　群体的获得及育性调查　　用不育系1141A 作母本与恢复系恢5200杂交得 F 1 (即华
杂3号) , 以 F 1为母本与保持系1141B 回交得恢保回交群体BC1。1997年8月在青海夏繁时, 于
花期分3次逐株调查恢保回交群体的育性, 每次至少检查单株上的3～ 5朵开放花朵。
1. 2. 2　DNA 提取及 PCR 反应　　参照李佳等修改后的 SD S 法提取叶片总DNA [ 9 ]。PCR 反
应体系如下: 1×扩增缓冲液, 1. 35 mmolö L M gC l2, 0. 08 mmolö L dN T P s, 1. 2U T aq 酶, 0. 4
Lmolö L 10 m er 引物 (购自美国Operon 公司) , 60 ng 模板DNA , 加 ddH 2O 至终体积20 LL。反
应于 PE4800扩增仪上进行。热循环程序为: 95℃ (3 m in) , 50℃ (1 m in) , 70℃ (1. 5 m in) , 1个
循环; 94℃ (1 m in) , 50℃ (1 m in) , 70℃ (1 m in) , 2个循环; 94℃ (1 m in) , 40℃ (1 m in) , 72℃
(1. 5 m in) , 38个循环; 94℃ (1 m in) , 40℃ (1 m in) , 72℃ (10 m in) , 1个循环; 4℃保存。
1. 2. 3　亲本间多态性的评估　　苗期从恢5200和1141B 两个亲本材料中随机选取典型株10
株, 提取叶片总DNA , 于DNA F luorom eter 上测定浓度后等量混合, 构成两个亲本的DNA
样本。然后以其为模板进行 PCR 扩增, 扩增产物用1. 4% 琼脂糖凝胶电泳。根据电泳谱带的
异同, 估测两亲本间的多态性。
1. 2. 4　集团构建及群体 RA PD 分析　　在恢保回交群体中, 随机选取138株提取叶片总
DNA。根据育性调查结果, 分别选取10个可育单株和10个不育单株的总DNA 等量混合, 构
成可育集团 (BF) 和不育集团 (BS)DNA 样品。用在两亲本间有差异的引物对其进行 PCR 扩
增, 然后用在两集团间也表现多态性的引物对回交群体各单株的DNA 样品逐个进行 PCR 扩
增和电泳检测。
1. 2. 5　资料分析　　用 Jo inm ap V ersion 1. 4 (Stan, P. 1993) 程序计算交换值和遗传连锁图
距, 并作显著性检验。
2　结果与分析
2. 1　Pol cm s 恢复基因的遗传分析　　调查恢保回交群体BC1各单株的育性, 可育株: 不育
株为72 ÷ 66, 卡平方检验符合1 ÷ 1的分离比, 表明 Po l cm s 育性恢复基因受一对显性基因控制,
与前人的研究是一致的[ 4～ 6 ]。
2. 2　亲本间的多态性　　在160个随机引物中, 能在恢复系恢5200与保持系1141B 两亲本间
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扩增出多态性DNA 片段的引物共85个, 占总引物数的53. 1%。共扩增出差异性片段120条,
平均每引物产生0. 75条多态性片断, 这表明两亲本DNA 间的多态性还是较丰富的。
2. 3　集团间多态性引物的筛选　　用在亲本间有差异的引物及700个尚未在两亲本间筛选的
引物 (A～ Z、AA～AQ )对可育和不育集团DNA 进行了 PCR 扩增。结果几乎所有引物在两集
团间的扩增带型完全相同, 只有A H 19 (5′GGCA GT TCTC3′)、A I16 (5′AA GGCA CGA G3′) 两
个引物在两亲本及两集团间检测到多型性。多型性片段大小分别为690 bp 和830 bp, 标记为
A H 19690、A I16830, 它们只出现在亲本恢复系恢5200和可育集团 (BF)的扩增产物中, 表明这两
个RA PD 片段所揭示的特异DNA 序列可能与育性恢复基因连锁 (图1、2)。
图1　　用随机引物AH 19扩增的RA PD 条带
F ig. 1　　RA PD p rofiles amp lified by P rim er AH 19
1. 亲本1, 恢5200; 2. 可育集团; 3. 不育集团; 4. 亲本2, 1141B;
5. 分子量标记, KDNA ö E coR É + H ind¸ ; 6～ 23. BC1群体中的单株
1. P1, Hui5200; 2. Bulk of fertile p lants; 3. Bulk of sterile p lants; 4. P2, 1141B;
5. DNA molecular w eigh t m arker, KDNA ö E coR É + H ind¸ ; 6～ 23. Individuals from BC1 population
图2　　用随机引物A I16扩增的RA PD 条带
F ig. 2　　RA PD p rofiles amp lified by P rim er A I16
1. 亲本1, 恢5200; 2. 可育集团; 3. 不育集团; 4. 亲本2, 1141B;
5. 分子量标记, KDNA ö E coR É + H ind¸ ; 6～ 23. BC1群体中的单株
1. P1, Hui5200; 2. Bulk of fertile p lants; 3. Bulk of sterile p lants; 4. P2, 1141B;
5. DNA molecular w eigh t m arker, KDNA ö E coR É + H ind¸ ; 6～ 23. Individuals from BC1 population
2. 4　群体各单株 RAPD 分析　　用上述两个引物A H 19、A I16对回交群体的138个单株
DNA 进行 PCR 扩增。结果两引物扩增产物中特异带有无的比值分别为69 ÷ 69和79 ÷ 59, 均符
合1 ÷ 1的分离比。其中绝大部分可育株都表现为有A H 19690和A I16830带型, 仅有少数可育株表
现为零带型, 应是交换类型; 绝大部分不育株都表现为零带型, 仅有少数表现为有带型的交换
类型。这表明A H 19690和A I16830与可育基因连锁 (表1)。
2. 5　Polcm s育性恢复基因的遗传图谱　　将回交群体各单株的育性及两引物扩增产物中
7755期　　　　　　　　王俊霞等: 甘蓝型油菜 Po l CM S 育性恢复基因的RA PD 标记　　　　　　　　　　　

表1　　育性恢复基因Rf 与 RAPD 标记的连锁关系
Table 1　　L inkage relationsh ips between the
restorer gene and the RAPD markers
RA PD 标记
(M arker)
育性 (R f ö rf )
可育株 (R f rf )
+ 3 　　- -
不育株 ( rf rf )
+ 　　- -
AH 19690 65 7 4 62
A I16830 68 4 11 55
　　3 + ö - 有ö 无 特异带
　　p resence ö absence of the specific m arker
特异带的有无情况输入计算机。运行
Jo inm ap 程序, 结果表明, 育性恢复基因 R f
与两个RA PD 标记A H 19690、A I16830的遗传
图距分别为5. 9 cM 和13. 6 cM ; 两个RA PD
标记间的遗传距离为7. 8 cM ; LOD 值分别
为24. 9、20. 9和21. 9 (图3)。
3　讨论
3. 1　甘蓝型油菜 RAPD 标记筛选方法的探
讨　　Jean, M. 等在3个甘蓝型油菜回交群体中筛选了140个10 m er 随机引物, 只在1个
群体中找到了1个RA PD 标记与目的基因 (R f 1) 连锁, 且遗传图距为26. 5cM , 与目的基因
图3　甘蓝型油菜 Pol
cm s 恢复基因有关的
遗传图谱左边图距
的单位为 cM
F ig. 3　The genetic m ap
concerning R f gene
for Pol cm s of B rassica
napus M ap distances,
show n at the left, are
in centiM organs
距离偏远。造成这种现象的原因可能是其亲本间的多态性偏低和筛选的
引物数目太少。鉴于此, 本研究首先对亲本间的多态性进行了评估, 确认
多态性较丰富后, 才确定采用本组合; 其次本实验加大了筛选引物的数
目, 由140个增加到860个, 结果将 R f 基因与标记的遗传图距缩小到
5. 9 cM , 为恢复系辅助选择提供了有价值的分子标记。
3. 2　RAPD 标记转换的必要性及方法　　RA PD 分析是以 PCR 技术为
基础, 在全基因组水平上检测DNA 变异的一种简单、快速、有效的分析
方法。它灵敏度高却稳定性差。有时某一扩增子的序列在不同遗传背景的
材料间有所不同, 从而使该引物不能在不同的材料间通用。例如, Jean,
M 筛选到的RA PD 标记O PF14, 在本实验的两个集团中却无多态性。另
外, RA PD 标记多为显性标记, 不能将显性纯合体与杂合体基因型区别开
来。因此, 有必要将 RA PD 标记进行转换。转换的方法主要有: 1. 将
RA PD 特异片段直接制作为探针进行分子杂交, 转化为 R FL P 标记; 2.
将 PCR 产物克隆, 然后制备成探针、进行分子杂交, 转化为 R FL P 标记;
3. 将 PCR 产物克隆、测序, 根据两端序列设计20或24 bp 的 PCR 引物,
对总 DNA 进行扩增反应, 获得其共显性效应的 ST S 标记 (Sequence2
tagged Site) 或 SCA R 标记 (Sequence Characterized Amp lified R egion)。本
研究中的两个RA PD 标记正在向R FL P 标记和 SCA R 标记转化, 以期为
辅助选育出新的 Po l cm s 恢复系提供更为可靠的分子标记。
参　考　文　献
1　Fu T D. C rucif erae N ew sletter, 1981, 6: 6～ 7
2　Fan Z, B. R. Stefansson. Can J P lant S ci, 1986, 66: 221～ 227
3　Robbelen G. P roc 8 th Int R apeseed Cong (1991, Saskatoon Canada) , Vol. 1: 2～ 5
4　崔德欣, 邓锡兴. 中国油料, 1979, (2) : 15～ 20
5　杨光圣, 傅廷栋. 作物学报, 1990, 17 (2) : 151～ 156
6　傅廷栋主编. 杂交油菜的育种与利用. 武汉: 湖北科学技术出版社, 1995, 55～ 59
7　Jean M , G G B row n, B S L andry. T heor A pp l Genet, 1997, 95: 321～ 328
8　Delourm e R , A Bouchereau, N Hubert et al. T heor A pp l Genet, 1994, 88: 741～ 748
9　李　佳, 沈斌章, 韩继祥等. 华中农业大学学报, 1994, 13 (5) : 521～ 523
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