全 文 ：Vol. 30 , No. 4
pp. 304～307 　Apr. , 2004
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 30 卷 第 4 期
2004 年 4 月 　304～307 页
玉米细胞质雄性不育材料 WBMs 的胞质分类研究
李小琴1 　万邦惠1 　刘纪麟2 　李建生3 　徐尚忠2 　郑用琏2 , 3 Ξ
(1 华南农业大学农学院 , 广东广州 510642 ; 2 华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室 , 湖北武汉 430070 ; 3 中国农业大学农学院 , 北京
100094)
摘 　要 　利用雄花育性恢复专效性测定、mtDNA 的 RFLP分析、类质粒鉴定等 3 种玉米不育细胞质分类的方法 ,对华中农
业大学从人工混合群体 WBM中发现的玉米新细胞质雄性不育材料“WBMs”进行了胞质分类的研究 ,3 种分析鉴定的结
果一致表明 ,WBMs 的不育胞质属于 S 组雄性不育细胞质 ,研究结果为拓展我国玉米细胞质雄性不育种质 ,有效利用
WBMs 材料提供了理论依据。
关键词 　玉米 ;WBMs ;细胞质雄性不育 ;胞质分类
中图分类号 : S513103511
Classif ication of Male Sterile Cytoplasms of WBMs in Maize( Zea mays L1)
LI Xiao2Qin1 , WAN Bang2Hui1 , LIU Ji2Lin2 , LI Jian2Sheng3 , XU Shang2Zhong2 , ZHENG Yong2Lian2 , 3
(1 Huanan Agricultural University , Guanzhou 510642 , Guangdong ; 2 National Key Laboratory of Crop Genetic Improvemen , Huazhong Agricultural University , Wu2
han 430070 , Hubei ; 3 China Agricultural University , Beijing 100094 , China)
Abstract 　Classification of WBMs cytoplasm of CMS( Cytoplasmic Male Sterility) maize which selected from the WBM
population developed by Huazhong Agricultural University , China have been performed by the combined methods with male
fertility restoration testing , RFLP of mtDNA and S1 , S2 plasmid2like DNA analysis1 The results indicated that the cytoplasm
of WBMs was classified into S2type of CMS maize1
Key words 　Maize ; WBMs ; CMS; Cytoplasm classification
　　自 1970 年玉米 T型细胞质雄性不育 ( T Type of
Cytoplasmic Male Sterility , T2CMS)材料受到玉米小斑
病 T生理小种专化性浸染事件发生以来 ,以避免不
育胞质单一化、扩大遗传种质基础为目的 ,创造和发
掘新的不育胞质类型材料已成为玉米 CMS 杂交种
利用的重要研究领域[1 ] 。
Beckett 1971 年依据植物 CMS核、质育性基因专
一性互作的遗传学原理 ,提出了不育胞质分类的育
性恢复专效性方法 ,并将供试的 30 种不同胞质来源
的 CMS 材料划分为 T、C、S 三种胞质类型[3 ] ,郑用
琏[4 ] 、温振明[5 ]在对我国常用自交系广泛测交鉴定
的基础上 ,提出了适合我国利用的育性恢复专效性
测验系统 ,李小琴[6 ]对这一系统进行了更新和补充。
玉米 T、C、S 三种胞质类型的细胞质雄性不育 (Cyto2
plasmic Male Sterility , CMS)材料 ,各自具有不同的遗
传规律和表型效应[2 ] 。研究者对新发现的玉米 CMS
材料 ,需研究其不育胞质类型的归属 ,育种者在组配
三系杂交组合时 ,需首先明了所利用的 CMS 材料的
胞质类型。随着生物技术的发展 ,20 世纪 80 年代
以来 ,Sisco [7 ] 、韦桂旺[8 ]和李小琴[9 ] 分别发展了基于
不同探针Π酶组合的 RFLP 技术的胞质分类法 ,可以
在较短的时间内对玉米 N、T、C、S 四种细胞质进行
准确的分类。线粒体内特异质粒与类质粒鉴定也可
用于辅助 C、S 胞质类型的分类[10～12 ] 。
WBMs 是华中农业大学玉米研究室近年来从利
用我国地方玉米品种“巫溪”与美国群体 BSSSC9 、热
带种质“墨黄九”等组配的人工合成群体中发现的新
不育胞质材料。经几年初步观察 ,WBMs 育性稳定、
抗病 ,表现出较好的利用潜力 ,研究其胞质类型的归
属分类 ,对我国玉米 CMS不育胞质遗传基础的拓宽Ξ基金项目 :国家自然科学基金倾斜项目 (39670465) ,广东省重大专项科技计划 (A2020402) ,广东省教育厅自然基金 ,国家“948”项目
(201010) 。
作者简介 :李小琴 (1967 - ) ,女 ,湖北当阳人 ,副教授 ,博士 ,主要从事玉米遗传育种研究。Tel :020285281903、13602822296 , E2mail :xiaoqin2
li2000 @hotmail1com。3 通讯作者 :郑用琏 ,E2mail :zhyl @mail1hzau1edu1cn
Received(收稿日期) :2003205219 ,Accepted(接受日期) :20032112031

及有效利用具有重要意义。
1 　材料与方法
111 　材料
　　以 Mo17 为核背景的 6 个同核异质系为研究试
材 (表 1) 。其中 ,编号为 a、b 的试材是带 WBMs 不育
胞质的 BC5 F1 代姐妹系 ,田间表现为雄花完全不育。
供试材料均由华中农业大学玉米研究室提供。
表 1 供试材料
Table 1 Materials
材料编号 材料名称 细胞质类别
No1of material Name of material Types of CMS
a Mo17cms2WBMs64 待测
b Mo17cms2WBMs62 待测
c Mo17cms2T T
d Mo17cms2EL C
e Mo17cms2唐徐 (Tangxu) S
f Mo17 N
112 　方法
11211 　WBMs 不育胞质雄花育性恢复专效性鉴定
　　1998 年秋 ,按同核异质系 (表 1) ×测验种 (表 2)
方式配制测交组合 ,1999 年春在华中农业大学试验
站鉴定 F1 雄花育性表现。田间采用顺序排列 ,不设
重复 ,一行区 ,行长 6 m ,行距 0167 m ,株距 0127 m ,
每行种 23 株。4 月 17 日播种 ,在雄花开花的中、末
期逐株参照 Duvick 的五级育性分类标准进行 2～3
次雄花育性调查[13 ] 。根据郑用琏[4 ] 、李小琴等[6 ] 提
出的玉米 CMS 育性恢复专效性鉴定方法 , 对 WBMs
进行不育胞质分类。
表 2 大田育性恢复专效性鉴定测验种
Table 2 Tester of flied fertility restoration identification
测验种集团 测验种成员 专效恢复组别
Group of test
cultivars
Member of test
cultivars
Type of specific
restorer
Ⅰ
牛 221 ,恢群 222121 ,S7913
Niu221 ,Huiqun222121 C ,S
Ⅱ
五 151 ,77294 ,P111 ,吉 6759
Wu151 ,Ji6759
C
Ⅲ 恢 313 ,801 ,Hui313 S
11212 　mtDNA RFLP 分析　　将表 1 材料暗培养获
得黄化苗约 5 g , 采用 CTAB 法提取黄化苗总
DNA[8 ] 。线粒体 DNA 探针由华中农业大学作物遗
传改良国家重点实验室玉米研究室提供 (表 3) 。利
用 BamH Ⅰ/ cox Ⅱ、BamH Ⅰ/ pHJ22721、Pst Ⅰ/ atp9、
Hind Ⅲ/ pBcmH 3、BamH Ⅰ/ atp9 等 5 套酶/ 探针组
合进行 RFLP 分析[8 ,9 ] 。
表 3 用于 RFLP分析的探针及克隆
Table 3 Probes and clones used for RFLP
克隆
Clone
基因
Gene
来源
Source
插入片段
Insert size (kb)
克隆位点
Insert ends
载体
Vector
选择标记
Selecting
pHJ22721 cox Ⅱ 小麦 117 BamHⅠ pUC9 Amp r
pBcmH3 油菜 117 Hind Ⅲ pDPLl13 Amp r
atp6 atp6 玉米 217 Hind Ⅲ pUC Amp r
B30 atp9 大麦 119 Bam HⅠ pUC9 Amp r
11213 　类质粒鉴定 　　取表 1 材料暗培养黄化苗
约 200～300 g ,参照赖菁茹[12 ] 的方法提取线粒体
DNA(mtDNA) 。各取 5μg mtDNA 在 018 %琼脂糖凝
胶、TBE电泳缓冲液、50 V/ 30 cm 电压下电泳 12 h ,
EB (溴化乙锭) 染色 30 min ,在紫外灯下直接观察质
粒或类质粒并照相。
2 　结果与分析
211 　WBMs 胞质 CMS 的雄花育性恢复专效性分析
　　所有测交 F1 组合的雄花育性表现列于表 4。参
照 Duvick 的五级育性分类标准 ,将 F1 雄花育性表现
为 1、2 级的确定为育性被保持 ,表现为 4、5 级的确
定为育性被恢复。两个含 WBMs 胞质的姊妹不育系
Mo17cms2WBMs64 、Mo17cms2WBMs62 在 9 个测验种下
的雄花育性表现一致 ,即其不育性均能被牛 221、恢
群 22212、S7913、恢 313、801 等测验种恢复 , 被五
151、77294、P111、吉 675 等测验种保持 ,说明 WBMs
胞质是一个雄花育性反应稳定的核质互作型不育
胞质。　　　
503　4 期 李小琴等 :玉米细胞质雄性不育材料 WBMs 的胞质分类研究 　　　

表 4 不育系×测验种 F1 雄花育性表现
Table 4 The male fertility in F1( sterile line ×inbred)
不育系
Sterile line
牛 221
Niu 221 恢群 22212Huiqun 22212 S7913 五 151Wu 151 77294 P111 吉 6759Ji6759 恢 313Hui313 801
Mo17cms2T - - - - - - - - -
Mo17cms2EL + + + + + + + - -
Mo17cms2唐徐 Mo17cms2Tangxu + + + - - - - + +
Mo17cms2WBMs64 + + + - - - - + +
Mo17cms2WBMs62 + + + - - - - + +
　　注 : + ,育性恢复 ; - ,保持雄性不育。Notes : + ,Restoring fertility ; - ,Maintaining male sterility1
　　结果表明 ,WBMs 不育系 ×恢 313 的 F1 育性表
现为完全恢复 ;WBMs 不育系 ×牛 221、恢群 222121、
S7913 的 3 个 F1 育性均表现为恢复 , WBMs 不育
系 ×五 151、77294、P111、吉 6759 的 4 个 F1 育性均表
现为保持 ,WBMs 型不育系 ×恢 313、801 的 2 个 F1
的育性表现为完全恢复。在 9 个测验种下 ,WBMs
胞质与 S 组的对照胞质“唐徐”的恢复专效性表现基
本一致 ,而与 T( T组) 、EL (C 组) 胞质的恢复专效性
表现明显不同 ,按郑用琏[4 ] 、李小琴等[6 ] 提出的玉米
CMS育性恢复专效性分类系统 (表 2) ,WBMs 不育系
符合 S 组的育性表现特点 ,据此可将其分类于 S 组
不育胞质类型。
212 　WBMs 胞质的 mtDNA RFLP分析
对表 1 中 6 个同核异质系采用 BamH Ⅰ/ pHJ22
721、BamH Ⅰ/ cox Ⅱ、Hind Ⅲ/ pBcmH3、Pst Ⅰ/ atp9、
BamH Ⅰ/ atp9 等 5 套酶/ 探针组合进行 mtDNA RFLP
分析 ,图 1 (A2D)结果显示 :2 个具 WBMs 胞质的姊妹
不育系 (a ,b 号材料) 具有完全相同的 mtDNA RFLP
图谱 ,说明 WBMs 胞质的 mtDNA 结构较为稳定。
图 1 mtDNA RFLP图谱
Fig1 1 mtDNA RFLP pattern of Bam HⅠ/ pHJ22721
　　A : BamHⅠ/ pHJ22721 酶/ 探针组合 ;B : BamHⅠ/ cox Ⅱ酶/ 探针组合 ;C : Hind Ⅲ/ pBcmH3 酶/ 探针组合 ;D : BamHⅠ/ atp9 酶/ 探针组合。
　　M:Marker1 a :Mo17cms2WBMs64 ;b :Mo17cms2WBMs62 ;c :Mo17cms2T;d :Mo17cms2EL ;e :Mo17cms2 Tangxu ;f :Mo171
　　A : BamHⅠ/ pHJ22721 ;B : BamHⅠ/ cox Ⅱ;C : Hind Ⅲ/ pBcmH3 ;D : BamHⅠ/ atp91
603 　　　作 　　物 　　学 　　报 30 卷 　

　　BamH Ⅰ/ pHJ22721 酶/ 探针组合下的 mtDNA
RFLP 图谱 (图 12A) 显示 ,WBMs 胞质具有 616 kb 与
213 kb RFLP 带纹。BamH Ⅰ/ cox Ⅱ酶/ 探针组合下
的 RFLP 图谱 (图 12B) 显示 ,WBMs 胞质具有 519 kb
与 210 kb RFLP 带纹。图 12C 显示 Hind Ⅲ/ pBcmH3
酶/ 探针组合下的 RFLP 图谱 ,图 12D 显示 BamH Ⅰ/
atp9 酶/ 探针组合下的 mtDNA RFLP 图谱。以上图
谱的结果均显示 ,WBMs 胞质的 mtDNA 在多种酶 Π
探针组合下的 RFLP 带型与 S 组对照材料 Mo17cms2
唐徐 (e 号材料) 相同 ,而与 T、C、N 胞质材料有明显
的差异。参考郑用琏等[8 ] 、李小琴等[9 ] 提出的玉米
CMS mtDNA RFLP 分类标准 ,可将 WBMs 不育胞质归
为 S 组。
213 　WBMs 胞质的类质粒分析
6 个 Mo17 同核异质系的 mtDNA 在未经酶切的
条件下 ,电泳结果 (图 2) 显示 : Mo17cms2WBMs64 、
Mo17cms2WBMs62 、Mo17cms2唐徐等 3 个自交系除了
具有一条大分子量的 mtDNA 主带外 ,还观察到 2 条
分子量分别约 614 kb、514 kb 的 S 组胞质所特有的
S1 、S2 类质粒 DNA 带纹[12 ] ,而 Mo17cms2T、Mo17cms2
EL、Mo17 只观察到一条 mtDNA 主带。据此判断
WBMs 不育胞质实属 S 组。
图 2 mtDNA中类质粒分析
Fig1 2 Analysis of plasmid2like DNA in mtDNA
M: Marker ; a : Mo17cms2WBMs64 ; b : Mo17cms2WBMs62 ; c :
Mo17cms2T;d :Mo17cms2EL ;e :Mo17cms2Tangxu ;f :Mo17
3 　讨论与结论
自 Beckett 1971 年提出对玉米 CMS 分类的育性
恢复专效性方法后 ,mtDNA RFLP 分析、质粒或类质
粒鉴定、小孢子败育细胞学观察、专化感病性鉴定等
也被用于 CMS的胞质分类。其中 ,育性恢复专效性
鉴定最为经典 ,它是根据育性恢复专效性原理对不
育胞质进行分类的 ,其最大优点是可测用结合 ,但周
期长、用工量大 ,而且育性表现易受环境影响。根据
不同胞质的 mtDNA 可发生不同方式重组的遗传特
点 ,利用 mtDNA 的 RFLP 分析进行胞质分类 ,不仅快
速准确 ,而且重复性好 ,周期短。检测不同胞质线粒
体内的特殊质粒或类质粒 ,也可快速准确地鉴定
CMS细胞质类型 ,但存在一定的局限性 ,而且需要获
得较大量的黄化苗及 mtDNA。
本研究综合采用育性恢复专效性测定 ,mtDNA
RFLP分析和类质粒鉴定等 3 种不同的胞质分类方
法 ,对 WBMs 不育胞质进行分类 ,获得了一致的结
果。即 WBMs 胞质具有 S 组 CMS 的育性恢复专效
性表现 ,具有典型的 S 组 CMS 线粒体 DNA 的 RFLP
图谱 ,具有 S 不育胞质线粒体特有的 S1 、S2 类质粒 ,
研究结果不仅表明这 3 种方法的可靠性 ,而且较为
肯定地将 WBMs 胞质确定为 S 组不育胞质。
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