全 文 ：Vol. 30 , No. 4
pp. 403～405 　Apr. , 2004
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 30 卷 第 4 期
2004 年 3 月 　403～405 页
研究
简报 花粉管介导的水稻转 bar 基因植株后代除草剂抗性遗传
王才林　赵　凌　宗寿余　朱　镇 Ξ
(江苏省农业科学院粮食作物研究所 ,江苏南京 210014)
Inheritance of Herbicide Resistance in Offsprings of bar Transgenic Rice ( Oryza sa2
tiva L. ) Obtained by Pollen2tube Pathway Method
WANG Cai2Lin , ZHAO Ling , ZONG Shou2Yu , ZHU Zhen
( Institute of Food Crops , Jiangsu Academy of Agricultural Sciences , Nanjing 210014 , Jiangsu , China)
　　除草剂抗性基因 (如 bar 等) 的利用 ,为控制杂交稻纯
度提供了有效途径 [1 ,2 ] 。据报道 ,国内外育种工作者已成功
地将 bar 基因导入玉米 [3 ] 、小麦 [4 ] 、大麦 [5 ] 、水稻 [6 ] 、高粱 [7 ] 、
油菜和番茄 [8 ]等 20 多种作物。中国水稻研究所黄大年利用
基因枪法将 bar 基因导入到水稻品种“京引 119”中 ,并开展
了利用 bar 基因提高和快速鉴定杂交稻纯度的尝试[1 ,9 ,10 ] 。
本文报道通过花粉管通道法用 bar 基因转化两系法亚
种间杂交稻“65396(培矮 64SΠE32)”的恢复系 ,获得了 E32 的
转基因植株 ,证明了 bar 基因在转基因植株中的整合与表
达 ;研究了 E32 的转 bar 基因水稻植株后代除草剂抗性的遗
传 ,旨在探讨 bar 基因在转化植株后代的遗传特性 ,为转基
因植株后代的分离选择提供依据。
1 　材料与方法
供试的受体亲本为两系杂交稻“65396 (培矮 64SΠE32)”
的父本“E32 (籼)”。bar 基因来源于美国 Cornell 大学 Wu Ray
先生。其基因结构与 Cao et al . (1992)报道的相同 [11 ] 。
采用花粉管通道法 [12 , 13 ] 进行 bar 基因的转导。取典型
植株移栽到盆钵。在盛花期选择正在开花的稻穗 ,去除未开
过的颖花和已开过的颖花 ,每穗只留下当天刚开的颖花20～
30 朵。1. 5～2. 0 h 后剪去小穗内颖和 1Π3～1Π2 的花柱及柱
头。用微量注射器在刚剪去柱头的花柱上滴注含 bar 基因
的溶液 2～3μL ,套上杂交袋以防止水分蒸发。25～30 d 后
收获种子。
收获种子经消毒、浸种、催芽后播于盆钵内育苗。当苗
龄达到 5 叶 1 心时 ,用 0. 2 %的 Basta 除草剂进行喷雾处理。
7 d 后调查抗性。
按 SDS碱法提取总 DNA[14 ] 。所用的 bar 基因引物为 :
引物 1 :5′2AAACCCACGTCATGCCAGTTC23′
引物 2 :5′2CGAGACAAGCACGGTCAACTTC23′
以提取的总 DNA 为模板 ,加上 bar 基因引物、反应缓冲
液、dNTP和 Taq 酶后 ,进行 PCR 扩增。扩增体系 25μL ,DNA
模板 2. 5μL , 95 ℃预变性 5 min , 94 ℃变性 30 s , 56 ℃复性
1 min ,72 ℃延伸 1 min ,35 个循环后 ,72 ℃再延伸 7 min ,将扩
增产物在 1 %琼脂糖凝胶上电泳 ,检测结果并照相。
遗传研究材料为花粉管介导获得的 E32 转 bar 基因植
株后代 T2 、T3 、T4 、T5 、T6 等世代。在各分离世代的苗期 ,用
0. 2 %的 Basta 除草剂处理 ,7 d 后调查统计抗与不抗植株的
比例 ,成活苗移栽后做进一步试验与选择研究 ,如此逐代跟
踪观察。试验于 1999 —2002 年在江苏南京和海南进行。
2 　结果与分析
2. 1 　转基因植株的获得及其对除草剂抗性的表现
　　1999 年以 E32 为受体 ,以抗 Basta 除草剂的 bar 为基因
供体 ,通过花粉管通道法进行了遗传转化。共处理 1 090 朵
小花 ,获得 425 粒种子。播种后成苗 70 株 (T0 ) 。在 6 叶期经
0. 2 %的 Basta 除草剂喷雾处理 ,结果大部分植株表现不抗 ,
7 d后死亡。其中有 30 个单株呈部分抗性 ,叶片中下部有黑
褐色抗性斑点 ,上半部则发黄干枯 ,生长受阻。7 d 后逐渐恢
复生长 ,以后生长正常 ,直至抽穗结实。收获种子于 2000 年
在南京种成株系 (T1 ) 后继续用 0. 2 %的 Basta 除草剂处理鉴
定 ,结果有 4 个植株能充分表达对 Basta 除草剂的抗性。对
其进行 PCR 分析 ,检测到了与 bar 基因引物扩增片段长度相
同的 DNA 片段 (图 1) ,证实 bar 基因已整合到受体植株的基
因组中。Ξ基金项目 :江苏省高技术研究项目 (BG2001304、BG2002301) ;江苏省应用基础研究项目 (BJ2000041) ;中国水稻科学基金项目 (0003215) 。
作者简介 :王才林 (1959 - ) ,男 ,博士 ,研究员 ,主要从事水稻遗传育种研究。
Received(收稿日期) :2003201207 ,Accepted(接受日期) :2003205203.

图 1 　E32 转 bar 基因植株的 PCR检测结果
Fig. 1 　PCR analysis of bar transgenic plants
CK: E32 ;1～4 :转 bar 基因植株 ;
P : bar 基因引物 ;M:1 kb marker
CK: E32 ;1 —4 : bar transgenic plants ;
P : bar gene primers ;M:1 kb marker
2. 2 　转基因植株后代除草剂抗性的遗传分析
2. 2. 1 　T2 和 T3 代除草剂抗性的遗传分析 　对 2000 年获得
的 4 个抗性植株 (T1 )冬季在海南种成 4 个株系 (T2 ) ,经 Basta
处理鉴定 ,其除草剂抗性表现为 2∶1 分离比例 (表 1) 。
将 4 个株系的 386 个抗性植株 ( H004260 收获 83 个单
株)于 2001 年正季在江苏南京播种 ,苗期用 Basta 除草剂进
行抗性鉴定的结果表明 ,各系统中均有分离和不分离株系出
现 ,两者之比符合 2∶1 理论比例 (表 2) 。在 266 个分离株系
随机抽取 54 个 ,调查了株系内的分离比例。结果表明 ,多数
株系符合 2∶1 和 3∶1 分离 ,这两类株系占 68 %。此外 ,还出
现了大于 3∶1 (15 %) 、1∶1 (11 %)和 1. 5∶1 (6 %) 等各种分离比
例 (表 3) 。
表 1 　转基因植株 T2 代除草剂抗性的遗传
Table 1 　Inheritance of herbicide resistance in T2
generations of transgenic rice plants
区号
Trial No.
抗性株数
Resistant plants
不抗株数
Sensitive plants
χ2
(2∶1) P
H004258 99 50 0. 00 > 0. 90
H004259 64 27 0. 40 0. 50～0. 75
H004260 86 34 1. 13 0. 25～0. 50
H004261 140 66 0. 10 0. 75～0. 90
合计 Total 389 177 0. 99 0. 25～0. 50
表 2 　4 个转基因系统 T3 代株系间除草剂抗性的分离比例
Table 2 　Segregation of herbicide resistance among T3 lines
in four pedigrees of transgenic rice plants
系统名
Pedigree
No.
株系总数
Total
lines
分离株系数
Segregated
lines
稳定株系数
Non2segre2gated lines χ2(2∶1) 实际比例Observedratio
H004258 99 70 29 0. 56 2. 41
H004259 64 46 18 0. 56 2. 56
H004260 83 51 32 0. 80 1. 59
H004261 140 99 41 0. 86 2. 41
合计 Total 386 266 120 0. 78 2. 22
表 3 　T3 代株系内除草剂抗性的分离情况
Table 3 　Segregation of herbicide resistance within T3
lines of transgenic rice plants
分离比例
Segregation ratio
株系数
No. of lines
%
> 3∶1 8 15
3∶1 13 24
2∶1 24 44
1. 5∶1 3 6
1∶1 6 11
合计 Total 54 100
2. 2. 2 　T4～T6 代除草剂抗性的遗传分析 　在 T3 代
的 5 个稳定株系和 3 个分离株系中各选择 5 个单株 ,2001 年
冬季在海南种植 40 个株系 (T4 ) ,苗期继续用 Basta 除草剂进
行抗性鉴定的结果表明 ,5 个抗性稳定系统的 25 个株系均不
分离 ,表明在 T3 代就分离出了抗性稳定的株系。3 个分离系
统的 15 个株系中 4 个株系抗性不分离 ,11 个株系表现 3∶1
分离 (表 4) ,分离株系数与不分离株系数之比符合 2∶1 理论
比例。
2002 年春继续在 11 个稳定株系中各选择 3 株 ,在 3 个
分离株系中共选择 10 株 ,2002 年正季在南京种植 43 个株系
(T5 ) ,抗性鉴定的结果表明 ,11 个抗性稳定系统的 33 个株系
抗性均不分离。3 个分离系统的 10 个株系中 2 个株系抗性
不分离 ,8 个株系表现 3∶1 分离 (表 4) ,分离株系数与不分离
株系数之比符合 2∶1 理论比例。继续从不分离株系中选择
综合性状似受体亲本 E32 的单株 ,2002 年冬季在海南种植
30 个株系 ,苗期鉴定结果 26 个株系表现抗性稳定不分离 ,4
个株系出现抗性分离 ,其中 1 个株系呈 3∶1 分离 ,1 个呈 2∶1
分离 ,2 个呈 1∶1 分离 (表 4) 。
表 4 　4 个转基因系统 T4～T6 代株系内除草剂抗性的分离比例
Table 4 　Segregation of herbicide resistance within T4～T6 lines
in four pedigrees of transgenic rice plant
世代
Gener2
ation
株系数
No. of
lines
植株数
Total
plant
抗性株数
Resistant
plant
不抗株数
Sensitive
plant
χ2
(3∶1)
P
T4 4 595 466 129 3. 32 0. 05 —0. 10
3 1223 923 300 0. 12 0. 50 —0. 75
4 741 542 199 1. 26 0. 25 —0. 50
T5 3 863 633 230 1. 17 0. 25 —0. 50
5 1382 1028 354 0. 25 0. 50 —0. 75
T6 1 250 180 70 1. 05 0. 25 —0. 50
1 244 168 76 0. 43(2∶1) 0. 50 —0. 75
2 533 284 249 2. 17(1∶1) 0. 10 —0. 25
404 　　　作 　　物 　　学 　　报 30 卷 　

3 　讨论
外源基因能否在受体植物中稳定遗传和表达是转基因
育种成败的关键。已有研究结果表明 ,外源基因在受体植物
内的整合、遗传和稳定性十分复杂 [15 ] 。自 1988 年首次获得
水稻转基因植株以来 ,已有不少关于外源基因在转基因水稻
后代中的遗传报道。多数研究表明外源基因在受体植物中
的遗传表达符合孟德尔遗传规律 ,但也观察到不少转基因后
代外源基因的异常分离现象。Shimamoto 等 [16 ]第一次系统报
道了 hph 基因在转基因水稻后代中的遗传分离现象。
Christou[17 ] 、Toki [18 ]的研究表明 , bar 基因导入水稻后 ,转基因
后代 (R1 )对除草剂 Bialaphos (双丙氨膦) 的抗感分离符合 3∶
1 比例。Cooley等发现大部分转基因水稻后代的 bar 基因表
达呈 3∶1 分离 ,个别转基因水稻的后代呈现 1∶1 或 15∶1 等不
规则的分离 [19 ] 。朱冰等和章善庆等对转 bar 基因水稻后代
的遗传研究发现 ,转基因株 T0 代表现抗 Basta ,T1 、T2 代出现
抗性分离 ,但分离比不符合孟德尔遗传 [9 , 10 ] 。
本研究通过花粉管介导用 bar 基因转化 E32 ,获得了抗
除草剂的转基因植株。对转 bar 基因后代 ( T0 ～T6 ) 的除草
剂抗性进行连续跟踪观察的结果表明 ,在 T0 代获得 30 个部
分抗性的植株 ,在 T1 代才获得 4 个完全抗性植株 ,而抗性稳
定株系则在 T3 代才出现。因此 ,为了提高花粉管通道法的
转化效率 ,要注意对早期世代中部分抗性植株的分离选择。
对分离世代除草剂抗性的遗传分析表明 ,T2 代株系内的呈
2∶1分离 ,T3 代表现为不规则分离。究其原因可能是外源基
因插入后受体亲本遗传上出现暂时性不平衡 ,导致雌雄配子
分离异常所致。经过 2 个世代的繁殖适应 ,外源基因与原基
因组达到平衡状态 ,其遗传也表现正常 ,因而 T4～T5 代株系
内除草剂抗性的分离比例符合一对显性基因的遗传规律。
由此看来 ,利用花粉管通道法将外源基因 bar 导入水稻后是
可以稳定遗传的 ,且为一对显性基因的单基因遗传。至于
T6 代开始少数株系又出现不同类型分离的现象 ,将对其在
后续世代及其在杂交后代中的遗传稳定性作进一步的跟踪
研究。
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