全 文 ：Vol. 30 , No. 6
pp. 608～612 　June , 2004
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 30 卷 第 6 期
2004 年 6 月 　608～612 页
利用花粉管通道法将叶片衰老抑制基因 PSAG122 IPT 导入普通小麦的研
究
奚亚军1 ,2 　林拥军1 　张启发1 　侯文胜2 　路　明2 Ξ
(1 华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室 ,湖北武汉 430070 ;2 西北农林科技大学 ,陕西杨陵 712100)
摘 　要 　利用花粉管通道法将叶片衰老抑制基因 PSAG122 IPT 导入普通小麦品种西农 1376 ,经 PCR、GUS组织化学染色、点
杂交和 Southern 杂交分析 ,证明带有特异启动子的目的基因已整合到 5 个植株的基因组中 ,且在大部分转基因植株中能
够稳定遗传。通过叶片细胞分裂素含量、叶绿素含量、叶片衰老进程及农艺性状分析 ,初步证明 PSAG122 IPT 基因在部分转
基因小麦的衰老叶片中特异表达 ,叶片衰老受到明显抑制。
关键词 　小麦 ( Triticum aestivum) ;花粉管通道法 ;叶片衰老 ;PSAG122 IPT
中图分类号 : S512. 103
Studies on Introduction of Leaf Senescence2inhibition Gene PSAG122 IPT into Common
Wheat through Pollen2tube Pathway
XI Ya2Jun1 ,2 , LIN Yong2Jun1 ,ZHANG Qi2Fa1 , HOU Wen2Sheng2 , LU Ming2
(1 National Key Lab for Crop Genetics and Improvement of Huazhong Agricultural University , Wuhan 430070 , Hubei ; 2 Northwest Science and Technology University of
Agriculture and Forestry , Yangling 712100 , Shaanxi , China)
Abstract 　The leaf senescence2inhibition gene PSAG122 IPT was used to improve wheat varieties that had disadvantage of leaf
presenility. With wheat cultivar Xinong 1376 as material , 5 transgenic plants were obtained through pollen tube pathway2
mediated transformation. By means of PCR amplification , GUS histochemical analysis , Dot and Southern blot hybridization ,
the target gene with specific promoter was demonstrated to integrate into the wheat genome already. The PSAG122 IPT gene
could inherit steadily in the most transgenic plants. The leaf cytokinin , chlorophyll , senescence development and agronomi2
cal character of transgenic plants were discussed. The results indicated that PSAG122 IPT gene might specifically express in
the senescent leaf of some transgenic plants , and the leaf senescence was obviously delayed.
Key words 　Wheat ( Triticum aestivum) ; Pollen tube pathway ; Leaf senescence ; PSAG122 IPT
　　叶片衰老是制约作物产量的重要因素之一。有
报道指出[1 ] ,在作物生育后期 ,叶片功能期每延长 1
d ,产量可增加 2 %。叶片衰老受植物激素的调节 ,
ABA 和乙烯促进衰老 ,赤霉素和细胞分裂素则延迟
衰老。Gan 等[2 ]构建的抑制叶片衰老自我调节系统
利用衰老叶片特异表达的启动子 SAG12 与编码细
胞分裂素合成的关键酶基因 IPT 融合成嵌合基因
(PSAG122 IPT) ,其原理为 :当叶片开始衰老时 ,衰老叶
片特异表达的启动子 SAG12 被激活 , IPT 基因开始
表达 ,细胞分裂素含量增加 ,使叶片衰老延缓 ;而叶
片衰老的延缓反过来又使 SAG12 启动子失活 ,从而
避免了细胞分裂素过量合成造成植物的形态和发育
异常。Gan[3 ] 、Astrid[4 ]和付永彩[5 ] 、林拥军等[6 ]分别
用 PSAG122 IPT 基因转化烟草、水稻 ,其转基因植株的
形态和生育期与对照基本一致 ,而叶片衰老得到
延缓。
本研究利用花粉管通道法将叶片衰老抑制基因
PSAG122 IPT 导入生产上存在早衰缺陷的小麦优良品
种西农 1376 ,旨在通过调控叶片衰老进程来改善西
农 1376 后期的光合功能 ,提高其产量潜力。Ξ基金项目 :华中农大作物遗传改良国家重点实验室开放课题 ;国家重点科技 (攻关)项目 (962009201214) 。
作者简介 :奚亚军 (1969 - ) ,男 ,陕西白水县人 ,博士 ,副研究员 ,主要从事小麦杂种优势利用及转基因研究 ,现在西北农林科技大学农学院
工作。Tel :02927082205 ; E2mail :xyjysc @163. net
Received(收稿日期) :2002212223 , Accepted (接受日期) :2003203230.

1 　材料与方法
1. 1 　材料
1. 1. 1 　植物材料 　普通小麦品种西农 1376 ,由西北
农林科技大学小麦中心提供。
1. 1. 2 　菌株和质粒 　　大肠杆菌菌株 DH5α由华
中农业大学作物遗传改良国家重点实验室分子育种
室 保 存。质 粒 pCMLA3521 ( 原 始 载 体 为
pCAMBIA1301)能在大肠杆菌 DH5α中扩增 ,由曹孟
良博士构建[7 ] ,简图如下 :
1. 2 　方法
1. 2. 1 　用花粉管通道法转化西农 1376 　　提取和
纯化质粒 DNA (质粒 DNA 纯化采用 PEG 法) ,以
ddH2O 为溶液介质 ;西农 1376 开花前人工去雄 ,套
袋 ;人工授粉后 1～2. 5 h 内剪去柱头 ,用微量注射
器滴加 10μL 质粒 DNA ,其中质粒 DNA 浓度设 100、
400 和 700μg/ mL 3 种处理 ;套袋 ,注明转化时期及
质粒 DNA 浓度 ;小麦成熟后收获转化种子 ;春化处
理后 (云南南繁种子)播于大田 ,管理同常规品种。
1. 2. 2 　PCR 检测 　　PCR 引物依据叶片衰老启动
子 PSAG12序列设计 ,引物序列为 : PSAG122R :5′2TGGCT2
GAAGTGATAACCGTC23′, PSAG122F : 5′2GCAAAGAGA
CGAGGAAGAAA23′。PCR 循环参数为 94 ℃预变性 3
min →94 ℃1 min , 56 ℃1 min , 72 ℃115 min , 35 个循
环 →72 ℃延伸 7 min ,4 ℃保存。
1. 2. 3 　点杂交、Southern 杂交和 GUS 基因表达的组
织化学法 　　检测参照《分子克隆实验指南》[8 ]和稍
加修改后的 Rueb[9 ]方法。
1. 2. 4 　转基因植株的表达分析 　　根据转基因植
株衰老叶片叶绿素含量、细胞分裂素含量 (叶片衰老
抑制基因 PSAG122 IPT 表达产物为异戊烯基腺嘌呤)
及形态学特征研究目的基因的表达。其中叶绿素含
量测定采用丙酮法 ,细胞分裂素含量测定采用高压
液相色谱法[10 ] ,叶片衰老进程级别记载标准为 0
级 :全叶青绿 ;1 级 :叶尖缺绿坏死 ;2 级 :叶尖叶缘缺
绿坏死 ;3 级 :半叶失绿坏死 ;4 级 :全叶坏死。
1. 2. 5 　转基因植株后代 ( T1) 的遗传分析 　　T0 代
套袋自交 ,从收获单株种子中随机取少量 T1 代种子
进行盆栽 ,提取单株 DNA 进行 PCR 检测 ,分析 T1 代
植株中 PSAG122 IPT 基因的遗传。
2 　结果与分析
2. 1 　转基因植株的 PCR和 GUS 检测
　　从表 1 可以看出 ,利用花粉管途径转化后当代
小麦的结实率与质粒浓度呈负相关 ,随着质粒浓度
的增加小花结实率下降 ,说明质粒 DNA 可能对小麦
的正常受精结实过程有抑制作用。
由于湖北武汉当年春季干旱少雨 ,加之土壤黏
度较大 ,春化处理后的小麦种子田间出苗情况普遍
较差 ,有接近一半的种子未能出苗。对田间所有植
株苗期提取叶片 DNA ,以质粒 pCMLA3521 为阳性对
照 ,利用 PSAG12引物进行 PCR 扩增 ,其结果有 5 个单
株和阳性对照能扩增出预期大小的目标片段 (526
bp) ,在未转化的阴性对照中未能扩增出相应的片段
(图 1) 。进一步对这 5 个单株采用 GUS 染色检测 ,
其结果与 PCR 扩增结果完全一致 ,初步证明在西农
1376 的这 5 个单株 (田间编号为 : TH21 ,TH22 ,TH23 ,
TH24 ,TH25) 的基因组中可能插入了 PSAG122 IPT 基因
序列。同时 ,表 1 结果显示 ,在 100～700μg/ mL 浓
度范围内 ,花粉管通道法转化植株的 PCR 和 GUS 阳
性率随着质粒 DNA 浓度的升高而增加。
表 1 　转基因植株的 PCR和 GUS 分析
Table 1 　PCR and GUS analysis of transgenic plants
质粒浓度
Plasmid
concentration
(μg/ mL)
转化小花数
No. of
transgenic
spikelets
结实率
Seedset
rate ( %)
出苗数
No. of
seedlings
PCR 阳性
株数
No. of PCR
positive plants
GUS阳性
株数
No. of GUS
positive
plants
100 1905 63. 46 514 0 0
400 1943 53. 11 499 1 1
700 1967 49. 57 536 4 4
2. 2 　转基因植株的点杂交和 Southern 杂交验证
对 PCR 和 GUS 初步检测为阳性的单株 TH21、
TH22、TH23、TH24、TH25 提取叶片 DNA ,以 PCR 扩增
的 PSAG122 IPT 基因片段 (526 bp)为探针 ,进行点杂交
和 Southern 杂交分析 ,以进一步确证是否为转化体。
从图 2 可见 ,PCR 和 GUS 检测为阳性的 5 个单
株点杂交均有杂交信号 ,与 PCR 和 GUS检测结果完
全吻合。采用 Xba Ⅰ限制性内切酶酶切总 DNA 后
进行 Southern 杂交 ,其结果与点杂交结果相同 (图
3) ,5 个植株在 3. 2 kb 处均有杂交带 ,与 PSAG122 IPT
906　6 期 奚亚军等 :利用花粉管通道法将叶片衰老抑制基因 PSAG122 IPT 导入普通小麦的研究 　　　

图 1 　转基因植株的 PCR分析
Fig. 1 　PCR analysis of transgenic plants
1 :DNA 分子量标准 ;2 :阳性对照 ;3 :阴性对照 ;
4～8 :转基因植株
1 :Ladder DNA ;2 :positive control ;
3 :negative control ;4 - 8 :transgenic plants
基因大小基本一致 ,说明带有特异启动子的目的基
因已完整整合到小麦基因组中。
图 2 　转基因植株的点杂交分析
Fig. 2 　Dot blot analysis of transgenic plants
1 :阳性对照 ;2 :阴性对照 ;3～7 :转基因植株
1 :Positive control ;2 :Negative control ;3 - 7 :Transgenic plants
图 3 　转基因植株的 Southern 杂交分析
Fig. 3 　Southern blot analysis of transgenic plants
1 :阳性对照 ;2 :阴性对照 ;3 :DNA 分子量标准 ;4～8 :转基因植株
1 :Positive control ;2 :Negative control ;3 :Ladder DNA ;
4 - 8 :Transgenic plants
2. 3 　转基因植株的叶片细胞分裂素含量、叶绿素含
量及衰老进程分析
　　在小麦开花后 20 d (对照西农 1376 小麦的倒二
叶、倒三叶外观已呈明显的衰老迹象)测定转基因植
株叶片细胞分裂素 (异戊烯基腺嘌呤)含量。结果显
示 (图 4) ,TH21、TH25 倒二叶的细胞分裂素含量显著
高于旗叶、倒三叶和对照 ,说明 PSAG122 IPT 基因在衰
老叶片中特异表达 ,增加了衰老叶片的细胞分裂素
含量 ;而倒三叶的细胞分裂素含量低于倒二叶和旗
叶 ,可能是由于测定时间较迟 ,部分细胞分裂素发生
降解所致。TH23 植株表现较为特殊 ,与对照相比 ,
叶片细胞分裂素含量大幅度升高 ,表现趋势为 :旗叶
> 倒二叶 > 倒三叶 > 对照 ,这可能是由于 PSAG122 IPT
基因在转基因植株体内受整合位置、结构及其他因
素影响导致 SAG12 启动子丧失特异性而产生了过
量的细胞分裂素[5 ] 。TH22、TH24 植株的叶片细胞分
图 5 　转基因植株叶片叶绿素含量(花后 20 d)
Fig. 5 　Leaf chlorophyll content in transgenic plants
( 20 days after flowering)
1 :CK;2 :TH21 ;3 :TH22 ;4 :TH23 ;5 :TH24 ;6 :TH25
裂素含量与对照无明显差异。
图 4 　转基因植株叶片细胞分裂素含量(花后 20 d)
Fig. 4 　Leaf cytokinin content in transgenic plants
( 20 days after flowering)
1 :CK;2 :TH21 ;3 :TH22 ;4 :TH23 ;5 :TH24 ;6 :TH25
转基因植株叶片叶绿素含量与细胞分裂素含量
表现趋势基本一致 (图 5) :TH21、TH25 植株的叶绿素
含量显著高于对照 ,TH22、TH24 与对照差异不明显 ,
而 TH23 较对照有较大幅度升高。由于在武汉春播
小麦灌浆成熟期正值梅雨季节 ,高温寡照多雨 ,田间
植株普遍发生早衰迹象。但与对照相比 ,TH21、TH25
植株的绿叶面积增加 ,叶片功能期延长 ,成熟时呈现
穗黄叶绿 ,叶片衰老受到明显抑制。TH22、TH24 植
株与对照无明显差异 ,而 TH23 表现叶色浓绿 ,贪青
016 　　　作 　　物 　　学 　　报 30 卷 　

晚熟 (表 2) 。
表 2 　小麦生长后期叶片衰老进程分析
Table 2 　Analysis of wheat leaf senescence development at old stage
时间
Time (day/ month)
材料
Material
旗叶
Flag leaf
倒二叶
The second leaf
倒三叶
The third leaf
20/ 5 CK 2 2 3
TH21 1 1 2
TH22 2 2 2
TH23 1 1 2
TH24 2 2 3
TH25 1 2 2
5/ 6 CK 3 4 4
TH21 2 2 4
TH22 3 3 4
TH23 2 2 3
TH24 3 4 4
TH25 2 3 3
2. 4 　转基因植株农艺性状分析
对转基因植株 T0 代的农艺性状调查表明 (表
3) ,转基因植株 TH21、TH22、TH24、TH25 的抽穗期、开
花期、成熟期、株高、穗数、穗粒数等与对照基本一
致 ,说明在这些植株中导入叶片衰老抑制基因
PSAG122IPT 对其生育期和植株形态没有明显影响。
而对 TH23 植株导入 PSAG122 IPT 基因则影响较大 ,表
现植株矮小、生长发育异常 ;这可能是由于 PSAG122
IPT 基因非特异性表达而产生了过量的细胞分裂
素 ,从而破坏了植株的正常生长发育。
与叶片细胞分裂素、叶绿素含量测定结果相似 ,
转基因植株 TH21、TH25 的千粒重、籽粒产量和生物
学产量明显高于对照 , TH22、TH24 植株与对照基本
一致 ,而 TH23 植株则低于对照 ,说明在转基因植株
TH21、TH25 中 PSAG122 IPT 基因在衰老叶片中特异表
达 ,增加了衰老叶片的细胞分裂素含量 ,使叶片衰老
延缓 ,延长了小麦叶片的功能期 ,从而提高千粒重和
单株产量 ;在 TH22、TH23 植株中 PSAG122 IPT 基因可
能不表达或表达量不足 ;而在 TH23 植株中可能非特
异性表达。
表 3 　转基因植株( T0 代)主要农艺性状
Table 3 　Main agronomic characters in T0 transgenic plants
材料
Material
抽穗期
Heading
stage
开花期
Flowering
stage
成熟期
Mature
stage
株高
Plant height
(cm)
穗数
No. of
spikes
穗粒数
Grains/
spike
千粒重
1 0002grain
weight (g)
籽粒产量
Grain yield
(g)
生物学产量
Biological yield
(g)
CK 29/ 4 4/ 5 8/ 6 72. 6 6 33. 5 32. 81 6. 13 13. 08
TH21 29/ 4 4/ 5 8/ 6 74. 0 7 34. 0 36. 09 8. 27 17. 41
TH22 29/ 4 4/ 5 8/ 6 75. 1 6 34. 5 33. 46 6. 65 13. 67
TH23 4/ 5 10/ 5 13/ 6 58. 7 1 18. 0 26. 12 0. 44 0. 89
TH24 30/ 4 4/ 5 8/ 6 70. 3 6 34. 0 32. 67 6. 46 14. 03
TH25 29/ 4 4/ 5 9/ 6 72. 9 6 34. 5 35. 72 7. 39 15. 96
2. 5 　转基因植株后代( T1)遗传分析
对转基因植株 T1 代的 PCR 分析结果表明 (表
4) ,PSAG122 IPT 基因在 TH21、TH22、TH23、TH25 的植株
中能稳定遗传 ;而 TH24 植株 T1 代 PCR 检测全为阴
性 ,可能是外源基因发生了丢失。同时 ,将部分 T1
代种子在陕西杨陵按株系种植 ,在小麦生长后期 ,观
察到有些植株的叶片衰老受到明显抑制。
表 4 　转基因植株 T1 代 PCR分析
Table 4 　PCR analysis of T1 transgenic plants
材 料
Material
T1 代种子数
No. of T1 seeds
出苗数
No. of seedling
PCR 阳性株数
No. of PCR
positive plants
TH21 20 18 15
TH22 20 20 16
TH23 10 10 5
TH24 20 17 0
TH25 25 21 15 3 　讨论根据目前的研究结果 ,花粉管通道法的转化效率受许多因素影响 ,如外源 DNA 的状态 ,缓冲液的成分 ,质粒 DNA 的浓度和体积 ,转化时间 ,转化方法 ,处理强度 ,注射深度 ,注射次数等。其中在质粒DNA 的浓度研究方面 ,目前多倾向于在小麦上用100～300μg/ mL [11 ,12 ]。而本试验发现在 100～700μg/ mL 浓度范围内 ,花粉管通道法在小麦上的转化效率随着质粒 DNA 浓度的增加而增加 ,以 700μg/mL 的转化效率最高。但质粒 DNA 浓度的增加会导致转化当代结实率下降 ,较高的质粒 DNA 浓度可能抑制小麦的正常受精结实过程。在本试验中 ,叶片衰老抑制基因 PSAG122 IPT 导入西农 1376 ,获得了 2 株 (TH21 ,TH25)叶片早衰现象
得到明显改善的转基因植株 ,其千粒重、籽粒产量和
生物学产量均较对照显著增加 , 表明可以利用
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PSAG122 IPT 基因对生产上有早衰缺陷的小麦品种进
行遗传改良 ,最大程度地发挥现存品种的生产潜力
及为育种创造新种质 ,这也可能是挖掘小麦产量潜
力的一条新的途径。同时 ,从 PSAG122 IPT 基因在小
麦中的表现及结合其他植物的转化经验 ,说明植物
转基因研究必须保证大量转基因植株群体的获得 ,
才能有利于优良目标植株的筛选。
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