全 文 ：新疆陆地棉转化雪莲XLPEBP 基因的研究
吕秀娟1 ,危晓薇2 ,艾秀莲3 ,罗淑萍1
(1.新疆农业大学农学院 ,乌鲁木齐　830052;2.新疆农科院核生所 ,乌鲁木齐　830091;3.新疆农科院微生物所 ,乌鲁木齐　830091)
摘　要:研究构建了一个含有除草剂基因和雪莲 XLPEBP 基因的重组质粒 pXLPEBP , 以新疆陆地棉(新石 K5
和新陆早17 号)为材料 , 采用花粉管通道法进行转基因研究 , 对转基因后代进行除草剂筛选和 PCR鉴定 , 结果
表明 ,除草剂基因及雪莲 XLPEBP基因已经整合到陆地棉基因组中。
关键词:雪莲;XLPEBP基因;花粉管通道法
中图分类号:S562.035.3　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001-4330(2007)01-0047-03
Study on Cotton Cultivar Transformed with XLPEBP
Gene in Xinjiang Upland Cotton
Lǜ Xiu-juan1 , WEI Xiao-wei2 ,AI Xiu-lian3 , LUO Shu-ping1
(1.College of Agronomy , Xinjiang Agricultural University , Urumqi 830052 , China;2.Institute of Nuclear and
Biological Technologies , Xinjiang Academy of Agricultural Sciences , Urumqi 830091 , China;3.Institute of Microbiol-
ogy , Xinjiang Academy of Agricultural Science , Urumqi 830091 , China)
Abstract:By pollen-tube pathway , plasmid pXLPEBP cotaining XLPEBP and selective marker gene of
bar were transformed into two cotton cultivars(XSK5 and XLZ17).Cotton offspring were used to be examined by
herbicide and PCR , and the result indicated that XLPEBP and herbicide had integrated with cotton genome.
Key words:Sasussured involucrata Kar.et Kir;XLPEBP;pollen-tube pathway
花粉管通道法是利用植物授粉后 ,所形成的天然的花粉管通道(又叫花粉管引导组织),经珠心通
道 ,将外源 DNA携带入胚囊 ,以达到遗传转化之目的 。周光宇等 1983年提出了花粉管通道介导的遗传
转化[ 1] 。随着生物基因工程的发展 ,高效抗病虫基因的构建 ,优质品质基因的发现和利用 ,该项技术越
来越多地用于棉花等作物育种中 ,创造了抗病虫棉花新品种和丰富的棉花品种资源 。在我国首批批准
释放大田的转基因作物中 ,中国农科院[ 2]培育的具有 Bt杀虫蛋白基因和豇豆胰蛋白酶抑制剂基因的双
价抗虫转基因棉花 ,正是利用花粉管通道法进行转化 ,将表达载体转入我国栽培棉品种中获得成功的 ,
经分子检测 ,证实了双价杀虫基因在棉花基因组中的整合与表达 。由此证明 ,花粉管通道法可以用于基
因表达载体和总 DNA等多种形态的遗传物质的转化 。新疆作为我国主要优质棉生产基地 ,也在开展该
项技术的应用研究。
为了拓宽棉花的栽种范围 ,提高产量 ,减轻低温伤害对棉花产量造成的不良影响 ,研究在成功分离
雪莲特殊功能基因磷脂酰乙醇胺结合蛋白(Phosphatidy lethanolamine-binding protein , PEBP)基因的基础
上 ,将此基因与载体 pCAMBIA3301连接构建植物表达载体(pXLPEBP),并试图采用花粉管通道法将此重
组质粒 pXLPEBP 导入受体棉花材料中。初步显示 ,雪莲磷脂酰乙醇胺结合蛋白基因经低温诱导的产物
有改变细胞质膜流动性的作用 。将此基因导入受体材料棉花中 ,以期提高棉花的抗寒力 ,解决当前生产
中存在的低温伤害的问题 。
收稿日期:2006-11-20
基金项目:国家自然科学基金项目(30160039);编号新疆维吾尔自治区高技术研究与发展计划项目(200511103)
作者简介:吕秀娟(1981-), 女 ,山东人 , 在读硕士生 ,研究方向:生物化学与分子生物学 , (E-mai l)cxjlxj@126.com;通讯作者:艾秀莲
(1951-),女 ,山东人 ,研究员 ,硕士生导师 ,从事分子生物学研究 ,(E-mai l)aixiulian@yahoo.com.
新疆农业科学　2007 ,44(1):47-49
Xinjiang Agricultural Sciences
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
1　材料与方法
1.1　材　料
1.1.1　转化受体
以新疆早熟棉花品种新石 K5和新陆早 17号为转化受体材料 ,分别由新疆农垦科学院和新疆农科
院经作所提供。
1.1.2　质 粒
pXLPEBP 为除草剂标记基因质粒 ,由新疆农科院微生物所实验室保存 。
1.2　方 法
1.2.1　质粒提取
雪莲 XLEPBP基因插入植物表达载体 pCAMBIA3301中 ,组成重组质粒 pXLPEBP。质粒 DNA的提取
参照《分子克隆实验指南》采用碱裂解法提取质粒 DNA。提取的质粒 DNA经紫外线检测(751分光光度
计)和 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定 ,OD260/OD280约为 1.8 ,质粒片段总长度约为 12 000 bp。
1.2.2　微量注射外源XLPEBP 基因
采用花粉管通道法[ 3]进行质粒 DNA的转导 。首先选择次日将要开花的花做自交 ,24 h后 ,用 50 μL
微量进样器(宁波市镇海玻璃仪器厂产)将质粒 DNA溶液从子房顶部纵轴向下插入胎座 5 mm 处注入外
源DNA溶液(质粒),注射量为 10μL/铃 ,作标记 。收获后的当代为 T0 代。
1.2.3　除草剂抗性鉴定
在棉花苗期 3 ～ 4片真叶时 ,涂抹 0.05%的 Basta除草剂涂抹筛选抗性幼苗 ,5 d后调查抗性 ,重复 3
次 ,第 4次用0.1%的Basta除草剂涂抹 。调查结果显示 ,抗性植株生长正常 ,敏感植株的涂抹叶片变色。
1.2.4　PCR分析
取抗性植株中经除草剂初筛不变色植株生长幼嫩的叶片 , 按 SDS 碱法提取总 DNA 。所用的
XLPEBP 基因特异引物为:
引物 1　5′-CCA TCT CCA ACA ACC CAA-3′;
引物 2　5′-GCC GCG AGT ACA AAA TCA A-3′。
以提取的总 DNA为模板 ,加上XLPEBP 引物 、反应缓冲液 、dNTP 和 Taq酶后 ,进行 PCR扩增 。94℃
预变性3 min ,95℃变性 30 s ,54.7℃复性 30 s ,72℃延伸 1 min ,35个循环后 ,72℃再延伸 10 min。将扩增
产物在1%琼脂糖凝胶上电泳并照相。
2　结果与分析
2.1　利用花粉管通道转化技术获得转化种子
将2005年 7和 12月分别在新疆农科院玛纳斯试验站和海南南繁育种基地用微量进样器将包含外
源基因XLPEBP 的重组质粒pXLPEBP注入新陆早 17号及新石K5两个棉花品种受体 ,共10 000朵花 ,收
获种子约 15 000粒(T0)。
2.2　抗除草剂植株筛选
2006年 4月下旬 ,将收获的 T0代种子全部播种于新疆农科院玛纳斯试验站育种基地中 ,出苗率大
约为 80%。3 ～ 4片真叶时涂抹 0.05%～ 0.1%除草剂 ,涂抹 4次后 ,两个受体共获得 16株抗除草剂植
株。而对表现抗性的 16 株棉花单株进行分子检
测 ,以便进一步验证外源基因是否导入棉花体内。
2.3　转基因植株后代的 PCR检测分析
　　为了验证 XLPEBP 基因的导入与否 ,将除草
剂处理后表现抗性的 16株棉株进行 PCR分子检
测 ,结果有 4株产生了扩增片段 ,长度约为 700
bp ,4 个抗性植株均产生了扩增片段 ,表明雪莲
XLPEBP 基因确已整合到棉花基因组中。图 1
图 1　转基因植株棉叶 PCR
Fig.1　Map of transfering gene PCR
1.XLPEBP 基因片段(阳性对照);2.阴性对照;3 、4 、5 、6转基
因植株 PCR产物;7.DNA 分子量标准
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3　讨 论
3.1　花粉管通道法作为一种颇具特色的转基因技术 ,由于其具备无基因型限制[ 4]和易于实现大规模基
因转化的特点 ,可以在任何开花植物和不同物种之间实现基因的转移 ,使得受体物种在获得新的基因型
的同时 ,也获得转基因所表达的新的表型性状 ,由此为农作物育种提供了创造新种质 ,拓宽基因库的新
技术途径 ,并且已经成功应用于作物育种 。1981年我国科学家首次利用花粉管通道法 ,成功地将外源
海岛棉 DNA导人陆地棉 ,培育出抗枯萎病的栽培品种[ 5] 。台湾缪芳心等[ 6]利用花粉管通道法 ,建立了
甘蓝基因转育系统并通过外源总 DNA的导入 ,将抗白粉病性状导入甘蓝受体 。曾君祉[ 7]利用花粉管通
道法将报告基因 、目的基因等转入小麦 。
3.2　实验利用花粉管通道转化技术将带有雪莲 XLPEBP 基因的重组质粒 pXLPEBP 导入受体材料新陆
早17号及新石 K5中 ,收获 T0 代种子约 15 000粒 ,播种后长成的植株经除草剂检测后仅有 16株表现出
抗性 ,PCR检测得到 4株转化植株 ,收获 400多粒转化种子(T1)。造成转化率低的原因可能是在用除草
剂进行花粉管初筛时 ,除草剂的浓度没有建立一个完整的控制体系 ,所以很可能是除草剂浓度过高 ,致
使很多已转化的植株丢失了。
今后将继续对转基因株系后续世代中XLPEBP 基因遗传稳定性进行跟踪研究 ,并将通过Southern杂
交判断XLPEBP基因在受体中的拷贝数和插入位点 ,为进一步探讨XLPEBP 基因在提高转化植株抗寒力
方面提供理论依据。
参考文献:
[ 1] Zhou GY ,Weng J , Zheng Y.Introduction of exogenous DNA into cotton s embryos[ J] .Meth Enzym , 1983 , 10l:433-438.
[ 2] 郭三堆 ,崔洪志 ,夏兰芹等.双价柱虫转基因棉花研究[ J] .中国农业科学 ,1999 , 32(3):1-7.
[ 3] 龚蓁蓁 ,沈慰芳 ,周光宇 ,等.授粉后外源 DNA导人技术— DNA通过花粉管通道进入胚囊[ J] .中国科学 B辑 , 1988 ,(6):611-614.
[ 4] 曾君祉 ,吴有强 ,王东江 , .花粉管通道(或运载)法转化的植株后代遗传表现及转化机理的探讨[ J] .科学通报 , 1998, 43(6):561-566.
[ 5] 黄骏麒 ,钱思颖 ,周光宇 ,等.外源抗枯萎病棉 DNA 导人感病棉的抗性转移[ J] .中国农业科学 , 1986, 19(3):32-36.
[ 6] 缪芳心 ,黄鹏林.利用花粉管导入法建立甘蓝基因转殖系统之研究[ J] .中国园艺 ,1995 , 41(3):201-214.
[ 7] 曾君祉 ,王东江.用花粉管途径获得小麦转基因植株[ J] .中国科学(B辑), 1993 ,23(3):256-263.
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