全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(10): 1679−1687 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
基金项目: 国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2002AA2Z1001-05, 2006AA10Z106)
作者简介: 张小红(1982−), 女 , 内蒙古包头人 , 在读硕士研究生 , 研究方向为农业生物技术; 王春连(1962–), 女 , 北京人 , 博士 , 副研究员 ,
主要从事水稻遗传育种、生物技术研究。** 共同第一作者
*
通讯作者(Corresponding author): 赵开军, 男, 研究员, 博士生导师, 研究方向为水稻遗传育种、分子生物学。E-mail: zhaokj@mail.caas.net.cn
Received(收稿日期): 2008-02-26; Accepted(接受日期): 2008-05-04.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.01679
转 Xa23基因水稻的白叶枯病抗性及其遗传分析
张小红 1,2,** 王春连 2,3,** 李桂芬 2 张晓科 1 梁云涛 2 孙亮庆 2 赵开军 2,3,*
(1 西北农林科技大学, 陕西杨凌 712100; 2 中国农业科学院作物科学研究所 / 农业部作物遗传育种重点实验室, 北京 100081; 3 国家
农作物基因资源与基因改良重大科学工程, 北京 100081)
摘 要: 在分离克隆抗白叶枯病基因 Xa23研究中获得大量转基因水稻材料。为了系统研究转 Xa23基因水稻的抗病
稳定性和遗传模式, 本文通过逐株进行抗白叶枯病接种鉴定、PCR和 Southern blot分子检测, 对一批转 Xa23基因水
稻植株进行了 T0代到 T2代的跟踪分析。结果表明, Xa23基因的整合和表达, 使感病受体品种牡丹江 8号获得抗病性。
由于 Xa23 基因插入受体基因组的位点不同, 同是单拷贝插入的转基因 T0 代抗病植株, 其抗病程度有明显差异。T0
代植株的抗病程度, 可以准确、稳定地遗传到 T1代和 T2代。单拷贝转基因植株分离群体的抗感植株分离比接近 3∶1,
表明转 Xa23基因遵循孟德尔单基因遗传模式。已获得 2个纯合的单拷贝转基因抗病株系, 它们的抗病程度稍有差别,
将用于外源基因插入位置效应分析和杂交稻抗病育种。
关键词: 白叶枯病; Xa23基因; 转基因水稻
Genetic Analysis on Bacterial Blight Resistance of Xa23-Transgenic Rice
ZHANG Xiao-Hong1,2,**, WANG Chun-Lian2,3,**, LI Gui-Fen2, ZHANG Xiao-Ke1, LIANG Yun-Tao2,
SUN Liang-Qing2, and ZHAO Kai-Jun2,3,*
(1 Northwest Agriculture and Forestry University, Yangling 712100, Shaanxi; 2 Key Laboratory of Crop Genetics and Breeding, Ministry of Agricul-
ture / Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081; 3 The National Key Facility for Crop Gene Resources
and Genetic Improvement, Beijing 100081, China)
Abstract: Transgenic rice plants were previously generated by Agrobacterium-mediated transformation during our research on
molecular cloning of Xa23 gene, a bacterial blight (BB) resistance gene from the wild rice species Oryza rufipogon. To investigate
the stability and inheritance of the transgene and its corresponding BB-resistance phenotype, more than 350 Xa23-trangenic rice
plants from T0, T1, and T2 generations were subjected to BB-pathogen inoculation, PCR and Southern blot analysis for the trans-
gene. Results showed that, Xa23 gene was incorporated and expressed in the genome of the susceptible receptor rice variety Mu-
danjiang 8 that acquired BB-resistance. Due to the difference of the transgene insertion sites, T0 plants with single-copy insertion
performed quite different degrees of resistance and their resistance was accurately and stably inherited to T1 and T2 generations.
We also observed that the transgene in the single-copy insertion transgenic lines inherited following the Mendelian rules. Two
homozygous, single-copy insertion transgenic lines with different resistance degrees have been obtained.
Keywords: Bacterial blight; Xa23; Transgenic rice
水稻白叶枯病(rice bacterial blight, BB)是水稻
生产中主要的细菌性病害之一 , 不仅在整个亚洲 ,
在美洲及非洲等地的产稻国都有发生, 一般引起减
产 10%~30%[1]。水稻白叶枯病是由革兰氏阴性细菌
黄单孢水稻变种 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae,
Xoo)引起的一种维管束病害, 病原菌通过气孔和水
孔侵入, 阻塞水分与养分运输, 导致植株萎蔫甚至
枯死, 药剂防治效果不佳。因此, 选育和推广抗病品
1680 作 物 学 报 第 34卷
种是防治该病最经济有效的措施[2]。
目前国内外已鉴定出抗白叶枯病基因 30个[3], 但
被育种利用的并不多, 主要原因是有些抗病基因抗
谱狭窄容易丧失抗性 , 有的为隐性基因而不便利
用。我国主栽水稻品种多含有 Xa3、Xa4或 Xa21基
因 [4], 由于多年来长期广泛利用 , 在许多稻区发现
已丧失抗性[5]。章琦等[6]从野生稻中发掘的 Xa23 基
因是目前已知抗谱最广的抗白叶枯病基因, 它能抵
抗中国、菲律宾和日本所有的代表菌系。Xa23具有
完全显性和全生育期广谱高抗的特点, 对我国杂交
稻的改良具有广阔的应用前景。近年来, 我们采用
图位克隆战略, 成功克隆了 Xa23 基因(另文发表)。
本文对一批转 Xa23 基因水稻的抗病性从 T0代至 T2
代的稳定性和遗传模式进行了系统的分析, 并获得
了遗传纯合、稳定的转 Xa23基因抗病种质资源。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 由本实验室利用农杆菌介导法
将 Xa23候选基因克隆 T189导入感病受体品种牡丹
江 8 号(MDJ8)获得转 Xa23 基因 T0代植株。遗传转
化载体 pYLTAC747HB(含潮霉素抗性基因)由华南
农业大学刘耀光教授提供 , T189 克隆左边界(Left
border, LB)与右边界 (Right border, RB)之间的部分
结构见图 1。参试的 4个 T1代群体编号分别为 2003、
2006、2007 和 2008。T2代群体编号分别是 3001、
3002、3006、3007和 3011。含Xa23近等基因系CBB23
为抗病对照, 由本实验室培育。感病受体品种牡丹
江 8号(MDJ8)由华中农业大学王石平教授提供。
图 1 表达载体 pYLTAC747HB的 LB与 RB的结构示意图
Fig. 1 LB to RB partial structure of expression vector pYL-
TAC747HB
1.1.2 白叶枯病菌系 专化的强毒性国际鉴别小
种 P6(PXO99)引自国际水稻研究所(IRRI), 真空保
存于−70℃, 接种前在胁本哲氏培养基上复壮菌株,
于 28℃培养 48 h, 以无菌水配制接种菌液, 浓度调
至 1×109 CFU mL−1。
1.1.3 试剂 Taq DNA 聚合酶购自华美公司 ;
λDNA/Hind III购自 TAKARA公司; DNA分子量标
准参照物 DL2000 购自 TRANS(全式金)公司; 引物
由上海生工生物工程有限公司合成; DNA提取、电泳、
Southern blot等所用试剂为进口或国产分析纯产品。
1.2 实验方法
1.2.1 抗病性接种鉴定 用人工剪叶接种法分别
在植株苗期和成株期接种, 接种后 14~20 d, 待感病
品种病情趋于稳定时调查, 用病斑面积占叶片面积
的百分率作为抗感反应参数。本试验以 15%为抗感界
限, >15%为感病, 10%~15%为抗病, <10%为高抗。
1 .2.2 水稻总 DNA 提取及 PCR 鉴定 按
McChouch 等报道的酚 /氯仿法提取水稻基因组
DNA[7]。根据载体 T-DNA上的潮霉菌磷酸转移酶基
因序列, 设计上游引物 HptF: 5′-TCCACTATCGGC
GAGTACTTCT-3′和下游引物 HptR: 5′-AGAGCCTG
ACCTATTGCATCTC-3′, 用此引物对转基因材料进
行 PCR扩增。PCR反应体系含模板 DNA 80~100 ng,
10×PCR buffer 2 μL, 25 mmol L−1 MgCl2 2 μL, 10
mmol L−1 dNTPs 1.5 μL, 10 μmol L−1 HptF 0.3 μL, 10
μmol L−1 HptR 0.3 μL, 5 U μL−1 Taq DNA聚合酶 0.2
μL, 补水至 20 μL。PCR 反应程序为 94℃预变性 3
min, 94℃变性 50 s, 60℃ 50 s, 72℃ 1 min 30 s, 循环
35次, 72℃延伸 10 min。扩增产物用 0.8%琼脂糖凝
胶进行电泳检测。
1.2.3 转基因水稻的 Southern blot鉴定 选择 PCR
鉴定阳性转基因植株, 提取DNA, 在参考Sambrook等[8]
基础上对 Southern blot部分实验操作做了改进。取
基因组 DNA 10 μg用限制性内切酶 Hind III进行完
全消化之后经 0.8%琼脂糖凝胶电泳分离, 将凝胶用
0.25 mol L−1 HCl溶液进行脱嘌呤处理 10 min, 然后
用 0.4 mol L−1 NaOH碱法吸印, 将 DNA转移到尼龙
膜(Hybond-N+, Amersham, UK)上。吸印 16 h左右后
用 2×SSC (0.3 mol L−1 NaCl, 0.03 mol L−1 C6H5Na307)
洗去碱液并固定 DNA。将制备好的杂交膜置杂交液
(含变性鲑鱼精 DNA)管中, 65℃预杂交 3~4 h, 将标
记好的探针(所用探针为潮霉素引物扩增载体的回
收产物, 用 α-32P-dCTP进行探针标记, 37℃反应 1 h)
变性后加入杂交液, 65℃过夜杂交, 倒去杂交液后
分别用含 0.1% SDS的 2×SSC、1×SSC、0.5×SSC 3
个梯度的洗液于 65℃下各洗 20 min (洗膜过程中要
测杂交信号的强弱,洗膜时间的长短,根据杂交信号
第 10期 张小红等: 转 Xa23基因水稻的白叶枯病抗性及其遗传分析 1681
的强弱来定)。用滤纸吸干膜上水分后用保鲜膜包好,
压在磷屏中, 根据所测杂交信号的强弱确定压膜时
间的长短, 用 BIO-RAD FX成像系统扫描图像。
2 结果与分析
2.1 转基因水稻 T0 代植株的抗病性分析及分子
鉴定
对 T189载体转化感病水稻品种牡丹江 8号获得
的一批 T0代植株进行了抗白叶枯病接种鉴定和外源
DNA插入片段的 PCR、Southern blot鉴定。从表 1可
以看出, 在 29个转基因 T0代植株中, 有 26株(89.7%)
对水稻白叶枯病强致病菌系 P6表现抗病, 病斑面积
在 1%~15%之间, 有 3 株(10.3%)表现严重感病。在
抗病植株中, 有 14株的抗病程度与抗病对照 CBB23
一致, 病斑面积在 1%~5%之间,另外 12 株的病斑面
积稍大一些, 为 10%~15%, 但仍为抗病类型。而 3
个感病植株的病斑面积达 70%~80%, 与感病受体
MDJ8 的一致, 可见 T0代抗感植株间的区别十分明
显。这些结果表明, T189载体携带的外源 DNA片段
的导入, 确实可以使严重感 P6菌株的受体品种牡丹
江 8号获得抗病性。但不同的 T0代植株之间的抗病
程度有一定的变幅。
表 1 T0代植株的抗病性及 PCR鉴定
Table 1 Bacterial blight resistance and PCR analysis of the T0 plants
植株编号
Plant No.
病斑面积
Lesion area (%)
PCR鉴定结果
PCR result
植株编号
Plant No.
病斑面积
Lesion area (%)
PCR鉴定结果
PCR result
TB10-1 10 P TB10-50 1 P
TB10-3 15 P TB10-59 5 P
TB10-5 10 P TB10-74 10 P
TB10-6 70 P TB10-84 5 P
TB10-12 3 P TB10-98 3 P
TB10-13 3 P TB10-106 10 P
TB10-15 3 P TB10-107 5 P
TB10-16 3 P TB10-121 10 P
TB10-18 1 P WTB10-6 10 P
TB10-19 70 P WTB10-11 10 P
TB10-22 80 N WTB10-12 15 P
TB10-23 3 P WTB10-14 10 P
TB10-29 10 P WTB10-15 10 P
TB10-30 1 P MDJ8 (CK－) 80 N
TB10-43 3 P CBB23 (CK＋) 1−5 N
TB10-48 1 P
P: 阳性, N: 阴性。P: positive; N: negative.
由于 T189 载体中的潮霉素抗性选择标记基因
(Hyg)位于 T-DNA左边界(LB)一侧(图 1), 而 T-DNA
进入受体基因组一般是由右边界(RB)开始整合, 因
此通过 PCR检测Hyg基因的存在, 就可以判断 T189
携带的水稻外源 DNA片段(Xa23基因)的存在。根据
引物 HptF和 HptR在 Hyg基因上的位置, 转基因阳
性植株可以扩增出 734 bp的目的条带(图 2)。表 1数
据显示, 上述 29 个转基因 T0代植株中有 28 个植株
均表现为 PCR 阳性, 说明在我们的转基因实验中,
利用潮霉素抗性筛选真实转化体的效率很高, 准确
率为 96.6%。从表 1 还可看出, 在 3 个感病植株中,
有 2株(TB10-6、TB10-19)表现为 PCR阳性(图 2-A),
说明在其基因组中整合了 T189 携带的 Xa23 基因,
但可能由于基因沉默而没有表现出抗病性。
以 T189质粒 DNA为模板, PCR扩增潮霉素抗
性选择标记基因 Hyg片段作探针, 对部分 T0代植株
进行 Southern blot分析, 结果表明大多数植株(包括
TB10-6、TB10-19)为外源基因单拷贝插入, 少数植
株如 TB10-48和 TB10-3分别为 2拷贝和 3拷贝插入
(资料未显示)。图 3-A 显示 TB10-1、TB10-18、
TB10-23和 TB10-30单株的 Southern blot检测情况。
2.2 T1代植株的抗病性和遗传分析
从 T0代植株中选择 4 个抗病且外源 DNA 插入
片段为单拷贝的植株(TB10-1、TB10-18、TB10-23
1682 作 物 学 报 第 34卷
图 2 转 Xa23基因植株的 PCR鉴定
Fig. 2 PCR identification of plants of the rice transformed by
Xa23
A: T0代植株; B: T1代植株; MDJ8: 牡丹江 8号; TAC747: 表达载
体 pYLTAC747HB
A: T0 plants; B: T1 plants; TAC747: Expression vector pYL-
TAC747HB
和 TB10-30)收获自交种子, 分别得到编号为 2003、
2006、2007 和 2008 的 T1代株系。对这 4 个株系进
行了抗白叶枯病接种鉴定和外源基因的分子鉴定 ,
结果列于表 2和表 3。从表 2和表 3看出, 上述 4个
T1代株系群体对白叶枯菌 P6的抗性均出现分离, 其
抗病植株的抗性水平与 T0代植株的完全一致, 例如
T0代植株 TB10-1的病斑面积为 10%, 属于中等抗性,
其 T1 代株系(2003)的抗病植株也表现为中等抗性,
病斑面积多在 10%~15%, 而 T0 代高度抗病植株
TB10-18 的病斑面积为 1%, 其 T1代株系(2006)抗病
植株的病斑面积也为 1%。
由于 T0代植株 TB10-1、TB10-18、TB10-23 和
TB10-30均为外源 DNA片段单拷贝插入, 根据孟德
尔遗传, 它们的 T1 代株系如果出现抗病性分离, 理
论抗感分离比应为 3 1∶ 。实际上 2007群体严格符合
图 3 转 Xa23基因水稻植株的 Southern blot分析
Fig. 3 Southern blot analysis of Xa23-transgenic rice plants
A: T0代植株; B~D: T1代植株; MDJ8: 牡丹江 8号; M: λDNA/Hind III。
A: T0 plants; B–D: T1 plants; M: λDNA/Hind III.
理论分离比, 为 34 抗∶11 感(χc2 = 0.007, P＞0.9),
其余 3个 T1代群体抗感植株分离比均与理论值有一
定偏差, 但统计上也符合 3 1∶ 的抗感分离比, 其中
2003群体的抗感分离比为 36抗 8∶ 感(χc2 = 0.75, P =
0.25~0.50), 2006群体的抗感分离比为 28抗 16∶ 感
(χc2 = 2.45, P = 0.10~0.25), 2008群体的抗感分离比
为 29抗 16∶ 感(χc2 = 2.14, P = 0.10~0.25)。这其中的
偏差显然是群体不够大造成的。
PCR 分子检测表明 T1 代植株的抗病性与外源
DNA片段的存在直接相关, 即凡是抗病植株其 PCR
分子检测均为阳性(表 2, 表 3, 图 2-B)。在感病植株
中, 除 2003群体的 2个植株(第 9、45号植株)和 2008
第 10期 张小红等: 转 Xa23基因水稻的白叶枯病抗性及其遗传分析 1683
表 2 T1代植株抗病性及分子鉴定(2003和 2006株系)
Table 2 Bacterial blight resistance and molecular analysis of the T1 populations (2003 and 2006 lines)
2003株系 2003 line 2006株系 2006 line
单株编号
Plant No.
病斑面积
Lesion area (%)
PCR鉴定结果
PCR result
拷贝数 a
Copy number a
单株编号
Plant No.
病斑面积
Lesion area (%)
PCR鉴定结果
PCR result
拷贝数 a
Copy number a
1 10 P 1 1 70 N 0
2 5 P 2 70 N 0
3 10 P 3 1 P 1
4 10 P 4 70 N 0
5 10 P 1 5 1 P
6 10 P 6 1 P
7 10 P 7 1 P
8 10 P 8 1 P 1
9 70 P 1 9 60 N
11 10 P 11 1 P
12 10 P 12 1 P
13 10 P 13 1 P
14 10 P 14 1 P
15 10 P 15 1 P 1
16 10 P 16 1 P
17 10 P 17 60 N 0
18 10 P 1 18 1 P 1
19 70 N 21 1 P
21 15 P 22 1 P
22 70 N 0 23 1 P
23 70 N 0 24 70 N 0
24 50 N 0 25 1 P 1
25 60 N 0 26 70 N 0
26 15 P 1 27 1 P
27 10 P 28 1 P
28 10 P 29 1 P
29 10 P 31 1 P
31 10 P 32 70 N
32 10 P 33 1 P
33 15 P 34 1 P
34 10 P 35 70 N 0
35 10 P 1 36 50 N 0
36 70 N 0 37 50 N 0
37 15 P 38 1 P
38 10 P 39 1 P
39 5 P 41 1 P
41 15 P 1 42 1 P
42 10 P 43 70 N
43 10 P 1 44 70 N
44 10 P 45 70 N
45 70 P 46 70 N
46 15 P 47 1 P 1
47 10 P 48 1 P 1
48 10 P 49 70 N 0
P: 阳性; N: 阴性。a 随机选择部分植株进行 Southern分析, 0: 无杂交带; 1: 1条杂交带。
P: positive; N: negative. a Only part of T1 plants were subjected to Southern blot analysis, 0: no hybridization band; 1: one hybridization
band.
1684 作 物 学 报 第 34卷
表 3 T1代植株抗病性及分子鉴定(2007和 2008株系)
Table 3 Bacterial blight resistance and molecular analysis of the T1 populations (2007 and 2008 lines)
2007株系 2007 line 2008株系 2008 line
单株编号
Plant No.
病斑面积
Lesion area (%)
PCR鉴定结果
PCR result
拷贝数 a
Copy number a
单株编号
Plant No.
病斑面积
Lesion area (%)
PCR鉴定结果
PCR result
拷贝数 a
Copy number a
1 5 P 1 1 1 P
2 3 P 1 2 1 P
3 5 P 3 1 P 1
4 5 P 1 4 40 N 0
5 3 P 5 70 N 0
6 3 P 6 50 N
7 70 N 0 7 1 P
8 3 P 1 8 70 N
9 3 P 1 9 50 N 0
11 5 P 11 1 P 1
12 3 P 12 1 P
13 3 P 13 1 P
14 3 P 14 20 N 0
15 70 N 15 1 P 1
16 3 P 16 1 P
17 3 P 17 70 P
18 3 P 18 1 P
19 5 P 19 1 P
21 3 P 1 21 50 N
22 70 N 0 22 1 P
23 3 P 23 50 N 0
24 3 P 24 1 P
25 3 P 25 3 P
26 70 N 26 70 N
27 5 P 27 25 N 0
28 3 P 1 28 1 P 1
29 3 P 1 29 35 N 0
31 70 N 0 31 1 P
32 70 N 0 32 3 P 1
33 3 P 33 3 P
34 70 N 34 1 P
35 3 P 35 1 P
36 70 N 36 1 P
37 5 P 37 25 N
38 3 P 38 1 P
39 5 P 39 1 P
41 5 P 41 1 P
42 3 P 42 35 N 0
43 3 P 1 43 1 P 1
44 3 P 44 45 N
45 3 P 1 45 1 P
46 70 N 0 46 1 P
47 70 N 0 47 70 N 0
48 70 N 0 48 1 P
49 3 P 49 1 P 1
P: 阳性; N: 阴性。a 随机选择部分植株进行 Southern分析, 0: 无杂交带; 1: 1条杂交带。
P: positive; N: negative. a Only part of T1 plants were subjected to Southern blot analysis, 0: no hybridization band; 1: one hybridization
band.
第 10期 张小红等: 转 Xa23基因水稻的白叶枯病抗性及其遗传分析 1685
群体的 1 个植株(第 17 号植株)外, 其余的感病植株
均表现为分子检测阴性, 表明在染色体分离重组中
没有获得外源 DNA 片段。对于 2003 群体的第 9、
45号植株和 2008群体的第 17号植株分子检测为阳
性, 表明其仍然含有外源 DNA 插入片段, 但表现为
感病, 可能是由外源基因沉默导致的。
选择 T1 代部分抗病和感病植株进行 Southern
blot 鉴定, 结果确认 4 个群体的 PCR 阳性植株其拷
贝数都为单拷贝, 但插入基因组的位置都不相同(图
3-B~D)。从图 3-B中可以看到 2003群体抗病植株可
以杂交出一条 2.3~4.3 kb 之间的清晰的条带 , 但
2003-9 在接种调查中为感病植株, PCR 鉴定中却可
以扩增到目的条带, Southern blot鉴定也可以杂交出
一条小于 1.0 kb 的条带, 表明其可能有外源插入片
段的丢失, 这很可能是其表现感病的原因。图 3-B中
2007 群体植株、图 3-C 中 2006 群体植株和图 3-D
中 2008群体抗病植株插入的拷贝数都为单拷贝, 可
以看出同一群体植株都杂交出相同的带, 并且插入
基因组相同的位置, 而且接种鉴定中抗病表现都相
同。虽然不同群体植株的遗传背景相同 , 并且
Southern blot 鉴定中也都为单拷贝, 但是在接种鉴
定中其抗病表现却有差异, 说明抗病表现与 T-DNA
插入水稻基因组的不同位置相关。
2.3 T2 代植株的抗病性遗传及转基因抗病纯合
系的获得
为了进一步分析转基因的遗传模式和稳定性并
获得转基因抗病纯合系, 我们从 T1代株系中随机选
择 4个抗病植株(2006-3、2006-18、2007-43和 2008-32)
收获自交种子, 分别得到编号为 3001、3002、3007
和 3011 的 T2代群体。对这 4 个群体进行抗白叶枯
病接种鉴定, 结果列于表 4。从表 4 看出, 4 个群体
中抗病植株与它们对应的 T1代植株的抗病程度完全
一致, 再一次说明转 Xa23基因水稻植株的抗病程度
可以准确地遗传到下一代。3001群体和 3011群体分
离出了感病植株, 说明 T1代植株 2006-3 和 2008-32
为转基因杂合植株, 它们的抗感分离比分别为 25
抗 15∶ 感(χc2 = 2.7, P= 0.10~0.25)和 32抗 8∶ 感
(χc2 = 0.3, P = 0.50~0.75), 符合 1个转基因拷贝的
孟德尔遗传, 这与 T1 代的抗性情况相一致。3002
群体的所有单株均高度抗病 , 其病斑面积为 1%,
与其对应的 T1代植株 2006-18的抗性水平完全一致,
说明 2006-18是一个纯合的单株。3007群体中只有
第 20 号单株表现感病, 可能是转基因丢失或基因
沉默导致, 其余单株均表现抗病, 且它们的抗性水
平与其对应的 T1代植株 2007-43 的抗性水平一致,
说明 2007-43也是一个纯合的株系。由此我们获得
了 2 个纯合的转基因抗病株系, 它们的抗病程度稍
有差别, 将用于抗病育种和外源基因插入位置效应
的研究。
以上结果表明, 受体品种 MDJ8 转基因 T0代植
株的抗病性, 确实由外源 DNA 插入片段控制, 而且
其抗病程度可以准确地、稳定地遗传到 T1代, 其遗
传模式符合孟德尔遗传规律。
3 讨论
3.1 转 Xa23 基因水稻植株分子检测与抗病接种
鉴定的一致性
本研究对 29个 T0代转基因植株和 178个 T1代
植株同时作了抗病接种鉴定和外源 DNA 片段的分
子检测。对于 T0代植株有 2株(TB10-6和 TB10-19),
对于 T1代植株有 3株(2003-9、2003-45和 2008-17),
其 PCR 分子检测结果与抗病接种鉴定结果不一致,
两种检测结果的符合率分别为 93.1%和 98.3%。表明
转 Xa23 基因水稻植株的 PCR 分子检测结果与抗病
接种鉴定结果有很好的一致性。由于目前许多育种
单位都可以方便地开展 PCR 分子检测, 而抗病接种
鉴定却因条件限制常不便实施, 所以在实际操作上,
可以在早期世代仅对转 Xa23 基因水稻植株或其衍
生后代进行 PCR 分子检测, 待获得稳定育种株系后
再进行抗病接种鉴定。
上述 5个两种检测结果不一致的转 Xa23基因水
稻植株, 均是 PCR 分子检测为阳性(表明外源 DNA
片段存在), 但表现为感病的。这种现象在许多转基
因研究中多有发生 [9], 其原因很多 , 如不同的转化
条件和方法, 以及 T-DNA在水稻基因组中整合时造
成受体植株基因组中序列的重排和结构的改变; 或
者是由于位置效应、转录水平的基因沉默、外源基
因插入 GC 含量高的区域也会打乱它们的正常组合
等等[10]。由于我们是通过 PCR 检测 T189 载体中位
于 T-DNA 左边界一侧的潮霉素抗性选择标记基因
Hyg来判断 Xa23基因的存在, 因此另一种原因可能
是虽然 Hyg还存在, 但 Xa23基因序列有缺失, 例如
T1代的 2003-9植株在 Southern blot分子检测中, 其
杂交信号带确实比同群体的其他抗病植株的杂交信
号带小(图 3-B), 这可能是导致 2003-9植株感病的真
正原因。
1686 作 物 学 报 第 34卷
表 4 T2代植株抗病性鉴定 a
Table 4 Bacterial blight resistance of the T2 populations a
3001群体 3001 line 3002群体 3002 line 3007群体 3007 line 3011群体 3011 line
单株编号
Plant No.
病斑面积
Lesion area (%)
单株编号
Plant No.
病斑面积
Lesion area (%)
单株编号
Plant No.
病斑面积
Lesion area (%)
单株编号
Plant No.
病斑面积
Lesion area (%)
1 50 1 1 1 5 1 50
2 1 2 1 2 5 2 40
3 1 3 1 3 5 3 3
4 1 4 1 4 5 4 3
5 1 5 1 5 5 5 3
6 50 6 1 6 10 6 3
7 1 7 1 7 10 7 3
8 1 8 1 8 10 8 3
9 50 9 3 9 10 9 3
10 1 10 1 10 5 10 3
11 50 11 1 11 15 11 3
12 3 12 1 12 10 12 3
13 1 13 1 13 10 13 3
14 1 14 1 14 10 14 3
15 70 15 1 15 5 15 40
16 1 16 1 16 5 16 3
17 60 17 1 17 5 17 3
18 70 18 1 18 5 18 50
19 50 19 1 19 5 19 3
20 1 20 1 20 50 20 3
21 1 21 1 21 10 21 3
22 1 22 1 22 5 22 3
23 1 23 1 23 5 23 3
24 60 24 1 24 5 24 50
25 70 25 1 25 5 25 3
26 1 26 1 26 5 26 70
27 70 27 1 27 5 27 3
28 1 28 1 28 5 28 5
29 70 29 1 29 5 29 3
30 1 30 1 30 10 30 3
31 1 31 1 31 10 31 3
32 70 32 1 32 5 32 5
33 70 33 1 33 10 33 3
34 1 34 1 34 5 34 3
35 1 35 1 35 10 35 3
36 1 36 1 36 10 36 3
37 50 37 1 37 5 37 3
38 1 38 1 38 5 38 3
39 1 39 1 39 5 39 50
40 1 40 1 40 5 40 40
a T2代株系 3001、3002、3007和 3011分别来自 T1代抗病单株 2006-3、2006-18、2007-43和 2008-32, 该 4个单株的抗性水平(病
斑面积%)分别为 1%、1%、3%和 3%。
a T2 lines 3001, 3002, 3007, and 3011 were progenies of T1 plants 2006-3, 2006-18, 2007-43, and 2008-32 (Table 2), respectively; the
BB resistance levels (lesion area, %) of the four T1 plants were 1, 1, 3, and 3, respectively.
第 10期 张小红等: 转 Xa23基因水稻的白叶枯病抗性及其遗传分析 1687
3.2 T-DNA插入位点不同影响 Xa23基因的抗病
表达程度
外源基因均为单拷贝插入的 T0代抗病植株之间,
其抗病程度有明显差异。例如我们跟踪分析的
TB10-1、TB10-18、TB10-23和 TB10-30植株的株高、
株型等外观形态一致(资料未显示), 但它们的病斑
面积, TB10-18 和 TB10-30 为 1%, TB10-23 为 3%,
TB10-1为 10%。而且这种抗病程度的差异可以准确
地遗传到后代, 即 T1代、T2代群体中抗病植株的抗
病程度与其对应的 T0代植株的抗病程度一致。很多
研究表明 ,外源基因的表达受插入位点的性质及其
侧翼序列, 即位置效应(position effect) 的影响。通
常认为不同转化体间外源基因的定量表达差异常归
因于外源基因不同的整合位点。我们确实可以从
Southern blot 杂交图谱上看到 TB10-1、TB10-18、
TB10-23 和 TB10-30 植株的单条杂交信号带的大小
不同(图 3-A), 说明其外源基因插入的位点不同, 这
很可能是导致它们抗病程度不同的原因。由此可以
推断, 在通过基因工程利用 Xa23基因育种时, Xa23
基因的抗病表达程度会受到 T-DNA 插入位点的影
响。
3.3 转 Xa23基因抗病纯合系的利用
Xa23基因是来源于普通野生稻的广抗谱、完全
显性、全生育期高抗的优异抗白叶枯病基因, 在高
产优质抗病的杂交稻研制上具有重要的应用价值。
鉴于国家对优良种质资源的保护, 含 Xa23基因的水
稻材料还不能输出到国外。Xa23基因的克隆, 将使
我国拥有 Xa23基因的知识产权, 从而有可能通过基
因产权输出使Xa23基因在水稻白叶枯病十分严重的
东南亚国家发挥作用。目前国内外推广的杂交稻基
本上是籼稻 , 而大多数籼稻品种的转基因十分困难,
或其遗传转化率很低 , 因此本研究获得的转 Xa23
基因抗病纯合系可以用于杂交稻的恢复系选育。
另外, 本研究获得的 2个转 Xa23基因抗病纯合
系均为外源基因单拷贝插入, 但抗病程度有一定差
异, 因此可以分离它们的 T-DNA 插入位点旁侧序列,
以进一步分析其抗病程度差异的分子机理。
4 结论
以农杆菌介导将水稻抗白叶枯病基因 Xa23 导入
感病品种牡丹江 8号基因组中并获得抗性表达。由于
Xa23 基因插入受体基因组的位点不同, 其转基因植
株抗病程度有明显差异。T0 代植株的抗病程度, 可
准确、稳定地遗传到 T1代和 T2代。转 Xa23基因遵
循孟德尔遗传模式。获得的纯合单拷贝转基因抗病
株系, 为外源基因插入位置效应分析和杂交稻抗病
育种提供了材料基础。
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