全 文 ：三种兜兰属植物种子发育过程及其与无菌萌发的关系*
张娟娟1,2, 严摇 宁1, 胡摇 虹1**
(1 中国科学院昆明植物研究所资源植物与生物技术所重点实验室, 云南 昆明摇 650201;
2 中国科学院大学, 北京摇 100049)
摘要: 某些兰科植物的种子成熟前, 在无菌萌发过程中有较高的萌发率, 而成熟后萌发率急剧下降。 本研
究针对这一现象, 对三种兜兰属植物种子的发育过程进行了解剖学观察, 并对授粉后不同时期的种子进行
无菌播种, 80 d后统计其萌发率, 以探究种子发育过程中的解剖学特征与萌发率之间的关系。 研究结果表
明种胚刚发育到椭球形胚的时候, 胚柄尚存, 种皮细胞尚未皱缩, 此时三种兜兰的萌发率都能达到较高水
平, 表明这是适合兜兰属植物萌发的最佳时期; 此后, 种皮开始皱缩, 木质素类物质积累导致种皮透水性
下降, 推测这可能是导致其后期萌发率下降的主要因素之一。
关键词: 兜兰属; 种子发育; 无菌萌发; 解剖学
中图分类号: Q 945摇 摇 摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 文章编号: 2095-0845(2013)01-033-08
The Seed Development of Three Paphiopedilum Species
in Relation to Asymbiotic Germination*
ZHANG Juan鄄Juan1,2, YAN Ning1, HU Hong1**
(1 Key Laboratory of Economic Plants and Biotechnology, Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences,
Kunming 650201, China; 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)
Abstract: There is an optimum time for the asymbiotic germination of some species in Orchidaceae. A better under鄄
standing of the seed development would provide information for the germination events. The relationship between
asymbiotic germination rate and the anatomical features in seed development of three Paphiopedilum species was
studied. The highest frequency of seed germination was obtained when the embryo began to take an ellipsoidal
shape, yet the seed coat had not dehydrated, and the suspensor cells were still present. After that, the parenchyma
cell of the seed coat began to dehydrate and lignin substances accumulated, therefore lead to the down shift of the
permeability of the seed coat, which maybe the main obstacles for the germination of the mature seeds of the Paphio鄄
pedilum species.
Key words: Paphiopedilum; Seed development; Anatomy; Asymbiotic germination
摇 兜兰属 (Paphiopedilum) 隶属于兰科杓兰亚
科 (Cypripedioideae), 是兰科中较原始的类群
(Cox等, 1997;刘仲健等, 2009)。 目前共有 79个
野生种类记录在案, 其中约 1 / 3 产中国。 就种类
而论, 中国是世界上兜兰属植物最为丰富的国家,
达 27种, 占兜兰属种类总数的三分之一 (刘仲健
等, 2009)。 兜兰属的显著特征之一即为唇瓣特化
成兜状或拖鞋状, 故又称 “拖鞋兰冶 或 “仙履
兰冶 (罗毅波等, 2005)。 兜兰属植物以其奇特的
花型, 丰富的花色和盛长的花期而广受兰花爱好
者的关注与喜爱。 但目前由于过度的人为采挖和
生境破坏, 野外兜兰属植物资源濒临灭绝, 目前
植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 2013, 35 (1): 33 ~ 40
Plant Diversity and Resources摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 DOI: 10. 7677 / ynzwyj201312049
*
**
基金项目: 云南省自然科学基金 (2009CD116), 中国科学院西部之光人才培养计划
通讯作者: Author for correspondence; E鄄mail: huhong@ mail. kib. ac. cn
收稿日期: 2012-04-09, 2012-08-17 接受发表
作者简介: 张娟娟 (1985-) 女, 硕士, 主要从事兰科植物形态和无菌萌发研究。 E鄄mail: juanjuan_zhang@ yeah. net
所有兜兰属植物均被列入 《野生动植物濒危物种
国际贸易公约 (CITES)》 附录玉。
为减轻野外采挖的压力, 保护野生兜兰资
源, 同时满足人们观赏需求, 迫切需要对兜兰属
植物进行人工繁育。 目前常用的繁育方法是利用
其种子进行无菌萌发, 从而获得实生苗。 但一些
兜兰属植物的种子同多数地生兰的种子一样, 成
熟后萌发通常十分困难 (Arditti, 1982; Rasmus鄄
sen, 1995)。 一些研究发现, 未成熟的兜兰种子
在一定时期内较易萌发, 且有较高萌发率, 而
晚于某个时期后种子萌发能力显著下降 (Lee,
2006; 丁长春等, 2004 )。 Yamazaki 和 Miyoshi
(2006) 对头蕊兰属 Cephalanthera falcata 的形态
结构进行研究后认为在宽叶金兰内种皮的里面积
累的木质素类物质可能是导致种子萌发率下降的
原因, 而 Lee 等 (2005) 对台湾杓兰的研究发
现在种皮的内侧有脂类物质的存在, 并认为脂类
物质的存在也可能是导致种子萌发率下降的原因
之一。 本研究试图通过对三种兜兰种子发育过程
的解剖学观察, 探讨其与无菌萌发的萌发率之间
的关系, 并初步揭示种子成熟后期萌发率下降的
原因。
1摇 材料与方法
1. 1摇 材料
本研究选取生长于中科院昆明植物研究所兰花温室
的带叶兜兰 (P. hirsutissimum)、 卷萼兜兰(P. appletonia鄄
num )和杏黄兜兰(P. armeniacum)。 其中, 杏黄兜兰隶
属于宽瓣亚属, 具细长而横走的地下根状茎, 5 ~ 7 枚
叶, 花纯黄色, 花葶 15 ~ 28 cm, 唇瓣深囊状, 近椭圆
状球形或宽椭圆形, 花期 3-5 月; 带叶兜兰隶属于兜兰
亚属, 叶 4 ~ 6 枚, 花葶 20 ~ 30 cm, 唇瓣囊盔状, 花期
4-5 月; 卷萼兜兰也隶属于兜兰亚属, 叶 4 ~ 8 枚, 花葶
17 ~ 60 cm, 唇瓣囊盔状, 花期 1-5 月。
1. 2摇 果荚采集
2011 年 3 - 5 月间, 对开花的三种兜兰进行授粉,
分别于授粉后 50 d、 70 d、 90 d、 110 d、 130 d、 140 d、
160 d、 180 d, 随机摘取兜兰果荚 (各种每个时期采 2 ~
3 个) 作为实验材料, 且分别记为 50DAP (Days After
Pollination)、 70DAP、 90DAP、 110DAP、 130DAP、 140DAP、
160DAP、 180DAP。
1. 3摇 无菌播种
用肥皂水刷洗果荚, 再用 0. 1%升汞溶液和 75%酒
精溶液对果荚进行两次消毒, 酒精灯略微灼烧果荚后,
取出种子播种于改良的 Harvais 培养基上, 于 25 益暗培
养, 每个时期的果荚播种 5 瓶。 播种 80 d后, 从培养基
上随机取出 2 个 1 cm 伊1 cm的琼脂块, 统计萌发率, 用
SPSS16. 0 软件 (SPSS Inc., Chicago, USA) 进行统计分
析, 并用 sigmaplot10. 0 软件 ( Systat SoftwareInc., city,
USA) 作图。
1. 4摇 胚发育过程的形态观察
从三种兜兰授粉后各个时期的果荚中取部分种子,
浸泡于改良的 FAA固定液中 24 h以上。 用 50%至 100%
的酒精脱水, 之后在 GMA (乙二醇甲基丙烯酸酯) 混
合液中浸透并包埋, 于 60 益温箱中聚合 10 h。 用 LEICA
RM2126RT转轮式切片机切片, 切片厚度为 5 滋m。 部分
切片以 0. 5%的甲苯胺蓝染液染色, 用 LEICA DM1000
显微镜观察并照相; 另取一部分切片用 0. 5 滋g·mL-1的
尼罗红染色 1 min, 去离子水冲洗 3 次后用 2 滋g·mL-1的
DAPI染色 1 min, 用 OLYMPUS FV1000 激光共聚焦扫描
显微镜观察并照相。
2摇 结果与分析
2. 1摇 三种兜兰属植物种子萌发率的统计
卷萼兜兰与带叶兜兰的种子在 50DAP 和
70DAP时不能萌发, 此后萌发率逐渐上升, 萌
发率均在 130DAP 时达到最高 (卷萼兜兰为
72. 5% , 带叶兜兰为 78. 7% )。 此后萌发率逐步
下降, 180DAP的种子萌发率接近于 0。 杏黄兜兰
的种子在 70DAP时有少量萌发, 到 90DAP时萌发
率达到最高 (71. 6%) 此后萌发率下降, 140DAP
后的种子萌发率已经接近于 0 (图 1)。
2. 2摇 三种兜兰的种子发育过程
2. 2. 1摇 兜兰胚发育过程
2. 2. 1. 1 摇 卷萼兜兰的胚发育过程 摇 50DAP 时,
卷萼兜兰的胚囊尚未形成, 珠心内的大孢子母细
胞正在进行减数分裂, 形成大孢子, 珠被细胞不
断生长包裹珠心 (图 2: A)。 70DAP 的时候,
卷萼兜兰的大孢子经过有丝分裂形成了成熟胚囊
(图 2: B)。 90DAP 时, 卷萼兜兰的绝大多数胚
囊都已经完成了受精作用, 受精形成的合子呈狭
长型, 有明显的极性分化, 细胞核及大部分细胞
质位于合子的合点端 (图 2: C)。 合子经过第一
次不均等的横分裂, 产生较小的顶细胞和较大的
基细胞, 基细胞经过几次横分裂衍生出的细胞形
成胚柄 (图 2: D-G)。 110DAP时, 在卷萼兜兰
的胚囊中观察到圆球形的原胚, 胚柄为呈直线型
43摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 35 卷
排列的 2 ~ 3 个细胞 (图 2: D)。 随后圆球形胚
在纵轴方向延伸, 在 130DAP的种子切片中可以
观察到椭球形胚 (图 2: E), 140DAP 的椭球形
胚中胚柄为呈直线型排列的 5 个细胞 (图 2:
F)。 160DAP的种子中, 椭球形胚已经几乎填满
整个胚囊, 胚柄也开始皱缩 (图 2: G)。 到
180DAP时, 胚柄已经完全消失, 椭球形的胚细
胞数目不足百个, 但已经有了简单的组织分化:
胚最外面是一层排列较规则的长方形细胞, 为原
表皮; 靠近合点端的细胞较小, 而靠近珠孔端的
细胞较大, 珠孔端细胞直径约是合点端细胞直径
的 2 倍 (图 2: H)。
2. 2. 1. 2摇 带叶兜兰的胚发育过程摇 带叶兜兰的
胚发育过程与卷萼兜兰大致相同, 同样由受精后
的合子 (图 3: A) 经过横分裂形成大小不等的
两个细胞 (图 3: B), 然后经由四细胞原胚
(图 3: C), 早期的圆球形胚 (图 3: D, E) 发
育到晚期的椭球形胚 (图 3: F, G), 胚柄消
失, 种皮皱缩, 形成成熟种子 (图 3: H)。 成
熟的带叶兜兰种胚与卷萼兜兰一样也有原表皮的
分化 (图 3: H), 但带叶兜兰授粉到受精之间
的时间间隔较卷萼兜兰短, 不到 70 d。 在 70DAP
时带叶兜兰的胚囊中已经完成受精作用, 并开始
第一次的横分裂, 胚柄细胞数也较卷萼兜兰少,
一般为 2 ~ 4。
2. 2. 1. 3摇 杏黄兜兰的胚发育过程摇 杏黄兜兰的
胚发育过程与卷萼兜兰和带叶兜兰类似, 但比二
者快。 50DAP 内, 完成了胚囊发育及受精作用
(图 4: A)。 70DAP时, 已有圆球形胚出现 (图
4: B), 90DAP时, 已形成椭球形胚 (图 4: C)。
图 1摇 不同发育时期三种兜兰种子的萌发率
Fig. 1摇 Mean percent germination of Paphiopedilum spp.
seeds collected at different developmental stages
图 2摇 卷萼兜兰授粉后胚珠及种子的发育过程 (标尺=50 滋m)
Fig. 2摇 Embryo sac formation and embry development of P. appletoniamum (bar =50 滋m)
A. 50DAP; B. 70DAP; C. 90DAP; D. 110DAP; E. 130DAP; F. 140DAP; G. 160DAP; H. 180DAP
i. integument; z. zygote; e. embryo; s. suspensor; p. protoderm
531 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 张娟娟等: 三种兜兰属植物种子发育过程及其与无菌萌发的关系摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
图 3摇 带叶兜兰种子发育过程 (标尺=50 滋m)
Fig. 3摇 Embryo development of P. hirsutissimum (bar =50 滋m)
A. 70DAP; B. 90DAP; C. 90DAP; D. 110DAP; E. 110DAP; F. 130DAP; G. 140DAP; H. 180DAP
i. integument; z. zygote; e. embryo; s. suspensor; p. protoderm
图 4摇 杏黄兜兰种子发育过程 (标尺=50 滋m)
Fig. 4摇 Embryo development of P. armeniacum (bar =50 滋m)
A. 50DAP; B. 70DAP; C. 90DAP; D. 110DAP; E. 140DAP; F. 180DAP; i. integument; z. zygote; e. embryo; s. suspensor
63摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 35 卷
110DAP时, 大部分种子的胚柄均严重退化, 椭
球形胚填满整个胚囊 (图 4: D)。 140DAP 以后
种皮已经皱缩成紧贴种胚的一层 (图 4: E,
F)。 成熟的杏黄兜兰种子分化程度不及卷萼兜
兰和带叶兜兰的高, 虽然也有原表皮的分化,
但原表皮之内合点端与珠孔端的细胞大小较为
均一。
2. 2. 2摇 兜兰种皮木质素累积过程
杏黄兜兰种皮在发育初期由两层薄壁细胞组
成 (图 5: A), 当胚发育到圆球胚时期, 种皮
外层细胞的径向壁和内切向壁上开始有次生增
厚, 增厚部分呈马蹄形 (图 5: B, C), 染色显
示有木质素类物质。 到 130DAP之后, 种皮薄壁
细胞开始脱水皱缩, 形成致密一层紧贴种胚外面
(图 5: D)。
卷萼兜兰和带叶兜兰的种皮同样由两层液泡
化的薄壁细胞组成 (图 6: A)。 当胚呈圆球形
之时, 外层种皮的径向壁和内切向壁上开始有马
蹄形次生增厚, 木质素类物质开始积累 (图 6:
B, D), 到 180DAP之时, 两层种皮细胞均已完
全皱缩, 紧贴种胚 (图 6: C, F)。
2. 2. 3摇 兜兰种皮脂类物质的动态变化过程
50DAP的卷萼兜兰切片中, 尼罗红荧光染
料显示为阴性, 表明在胚囊形成前, 珠心细胞及
珠被细胞上均无脂类物质积累 (图 7: A),
70DAP时, 胚囊发育完成, 在胚囊与种皮内层细
胞之间出现一层脂类物质 (图 7: B)。 在胚发育
的较早时期, 种皮内侧胚囊之外始终能看到脂类
物质的存在, 该层脂类物质主要积累在胚囊两侧,
在胚囊的合点端与珠孔端不甚明显 (图 7: C)。
到胚发育后期, 种皮皱缩之后, 脂类物质几乎消
失 (图 7: D)。
如图 8和图 9 所示, 在带叶兜兰和杏黄兜兰
中有同样的规律, 胚发育较早时期能够在胚囊与
种皮内层细胞之间看到脂类物质的积累, 到胚发
育成熟且种皮完全皱缩之后, 该层脂类物质消失。
2. 3摇 三种兜兰种子发育阶段与无菌萌发率之间
的关系
结合三种兜兰种子发育的阶段与其萌发率,
我们发现用 DAP (授粉后天数) 来计量, 三种
种子中杏黄兜兰的萌发高峰最早出现, 约在
90DAP时; 而另外两种兜兰的萌发高峰则出现
较晚, 约在 130DAP时。 但将每种兜兰的种子发
育过程与种子萌发情况进行比较, 发现具有一定
的相似性: 在合子最初形成之时, 种子在无菌萌
发培养基中不能成功萌发, 而随着合子的发育,
在 2 ~ 4 细胞原胚及早期圆球形胚阶段, 就能有
一定程度的萌发, 当种子由圆球形胚纵向延伸形
成椭球形胚之时, 三种兜兰都有最高的萌发率。
此后虽然椭球形胚仍在分裂生长, 但胚柄细胞已
经开始退化, 种皮开始皱缩, 萌发率也随之下
降。 到后期, 种皮完全皱缩, 在无菌萌发实验
中, 种子基本不能萌发。
3摇 讨论
本文研究了三种兜兰种子发育过程中的解剖
学特征, 比较了种子不同发育时期的萌发率。 结
果表明, 三种兜兰种子的发育过程中萌发率都有
一个高峰期, 高峰期过后萌发率逐渐下降, 成熟
的种子很难萌发。 结合其他学者进行的兜兰属植
图 5摇 杏黄兜兰种皮的变化情况 (标尺=50 滋m)
Fig. 5摇 Changes in the integumentary tissues of P. armeniacum (bar =50 滋m)
A. 50DAP; B. 70DAP; C. 90DAP; D. 130DAP; i. integument; z. zygote; e. embryo
731 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 张娟娟等: 三种兜兰属植物种子发育过程及其与无菌萌发的关系摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
图 6摇 卷萼兜兰和带叶兜兰的种皮变化情况 (标尺=50 滋m)
A-C. 卷萼兜兰, A. 90DAP; B. 130DAP; C. 180DAP; D-F. 带叶兜兰, D. 110DAP; E. 140DAP; F. 180DAP
Fig. 6摇 Changes in the integumentary tissues of P. appletoniacmum and P. hirsutissimum (bar =50 滋m)
A-C. P. appletoniacmum, A. 90DAP; B. 130DAP; C. 180DAP; D-F. P. hirsutissimum D. 110DAP; E. 140DAP; F. 180DAP;
i. integument; z. zygote; e. embryo
图 7摇 卷萼兜兰胚囊外脂类物质的变化 (红色; 标尺=50 滋m)
Fig. 7摇 Nile red staining showing the changes of cuticle material on the embryo sac of P. appletoniacmum (bar =50 滋m)
A. 50DAP; B. 70DAP; C. 160DAP; D. 180DAP
83摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 35 卷
图 8摇 带叶兜兰胚囊外脂类物质的变化 (标尺=50 滋m)
Fig. 8摇 Nile red staining showing the changes of cuticle material on the embryo sac of P. hirsutissimum (bar =50 滋m)
A. 70DAP; B. 90DAP; C. 130DAP; D. 180DAP
图 9摇 杏黄兜兰胚囊外脂类物质的变化 (标尺=50 滋m)
Fig. 9摇 Nile red staining showing the changes of cuticle material on the embryo sac of P. armeniacum (bar =50 滋m)
A. 50DAP; B. 90DAP; C. 110DAP; D. 180DAP
物种子的无菌萌发研究, 发现硬叶兜兰 (P. mi鄄
cranthum) (陈之林等, 2004)、 巨瓣兜兰 (P.
bellatulum)、 古德兜兰 (P. godefroyae)、 海伦兜
兰 (P. helenae) 和亨利兜兰 ( P. henryanum)、
白旗兜兰 (P. spicerianum) 及雪白兜兰 (P. nive鄄
um) (Lee, 2007) 等种子中均存在最佳萌发时期
过后种子萌发率下降的问题, 因而我们推测, 兜
兰属中可能普遍存在这种成熟种子萌发困难, 而
未成熟种子萌发率高于成熟种子的现象。
目前对兜兰的近缘属杓兰属的种子发育阶段
与萌发率之间关系有部分研究, Lee 等 (2005)
对台湾杓兰的研究认为在 90 ~ 105DAP 时, 种胚
发育到带有单细胞胚柄的早期球形胚至球形胚时,
种子的萌发率最高。 依据我们的研究, 在兜兰属
中萌发率最高的时候, 是在果荚中多数种胚处于
椭球形, 且胚柄尚未退化, 种皮未完全皱缩之时。
931 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 张娟娟等: 三种兜兰属植物种子发育过程及其与无菌萌发的关系摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
台湾杓兰 (Cypripedium formosanum)、 大花
杓兰 (C. macranthos) 的胚囊外一般有两层珠
被, 外珠被发育成外种皮, 而内珠被发育成含有
脂质的壳 ( carapace)。 成熟时, 这层壳质紧紧
贴在胚的外面, 并被认为是导致成熟后种子萌发
困难的原因之一 (Lee, 2005; 张毓等, 2010)。
但据本研究以及任玲和王伏雄 (1987) 对古德
兜兰 (P. godefroyae) 种子解剖形态的观察发现,
兜兰的种皮不同于杓兰, 是由一层珠被发育而来
的单种皮, 因而不存在内外种皮之分。 故在本研
究中观察到的脂类物质的来源与杓兰中由内种皮
发育而来的脂类物质不同, 其命运也不尽相同。
这层物质在胚囊形成伊始便出现, 在种子成熟的
后期逐渐消失或者减少。 因而我们认为, 兜兰属
的种子中这层脂类物质可能与种子成熟后期萌发
率下降没有必然联系, 其主要的生理学意义可能
是为胚的发育创造稳定的环境条件, 待胚发育完
善后, 便消失了。 兜兰成熟种子萌发率下降的主
要原因可能是种子成熟后期木质素类物质的积
累, 导致种子透水性下降。 在野外环境中, 兜兰
这种高度木质化的种皮一方面能够保护幼嫩的种
胚, 免受机械伤害; 另外一方面, 还能保持兜兰
种胚的水分, 防止其在环境中脱水死亡, 使兜兰
属植物的种子能够在恶劣的环境下存活。 在适宜
的条件下, 相应的共生真菌侵染种子, 才能使得
种子成功萌发。 此外, 在种子成熟后期是否有抑
制种子萌发的激素类物质累积从而导致休眠, 尚
有待进一步的研究。
致谢摇 中科院昆明植物研究所梁汉兴研究员在结果分析
上给予的耐心指导和提出宝贵建议, 台湾自然科学博物
馆李勇毅博士在文献上提供帮助。
也参摇 考摇 文摇 献页
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