全 文 ：江西铅山红芽芋胚性愈伤组织的包埋干燥法超低温保存∗
洪森荣ꎬ 尹明华∗∗ꎬ 王艾平
(上饶师范学院生命科学学院ꎬ 江西 上饶　 ３３４００１)
摘要: 对江西铅山红芽芋 (Ｃｏｌｏｃａｓｉａ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ ｖａｒ. ｃｏｒｍｏｓｕｓ ｃｖ. Ｈｏｎｇｙａｙｕ) 胚性愈伤组织包埋干燥法超低温
保存进行了初步的研究ꎮ 结果表明: 江西铅山红芽芋胚性愈伤组织包埋干燥法超低温保存较佳的条件为:
０􀆰 ７５ ｍｏｌ􀅰Ｌ－１蔗糖预培养 ３ ｄꎻ 脱水方式为空气干燥 ７ ｈ或硅胶干燥 １１ ｈꎻ 化冻温度为 ３７ ℃ (２ ｍｉｎ)ꎻ 冻后
培养条件为暗培养 ７ ｄ再转到光周期中培养ꎮ 此方法超低温保存后的平均成活率约为 ４５％ꎮ 超低温保存时
间以及是否去除包裹的褐藻酸钙对其成活率无显著性影响ꎮ 形态学和细胞学检测表明红芽芋胚性愈伤组织
冻后再生苗与母本材料相比没有发生变异ꎮ
关键词: 江西铅山红芽芋ꎻ 胚性愈伤组织ꎻ 包埋干燥法ꎻ 超低温保存
中图分类号: Ｑ ９４３􀆰 １ꎬ Ｓ ６３２􀆰 ３　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 文章编号: ２０９５－０８４５(２０１４)０４－５０５－０８
Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｊｉａｎｇｘｉ Ｙａｎｓｈａｎ Ｒｅｄ Ｂｕｄ Ｔａｒｏ (Ｃｏｌｏｃａｓｉａ
ｅｓｃｕｌｅｎｔａ ｖａｒ. ｃｏｒｍｏｓｕｓ ｃｖ. Ｈｏｎｇｙａｙｕ) Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ
Ｃａｌｌｉ ｂｙ Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ
ＨＯＮＧ Ｓｅｎ￣Ｒｏｎｇꎬ ＹＩＮ Ｍｉｎｇ￣Ｈｕａ∗∗ꎬ ＷＡＮＧ Ａｉ￣Ｐｉｎｇ
(Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｓｈａｎｇｒａｏ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｓｈａｎｇｒａｏ ３３４００１ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｊｉａｎｇｘｉ Ｙａｎｓｈａｎ ｒｅｄ ｂｕｄ ｔａｒｏ (Ｃｏｌｏｃａｓｉａ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ ｖａｒ. ｃｏｒｍｏｓｕｓ ｃｖ. Ｈｏｎｇｙａｙｕ) ｅｍ￣
ｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｉ ｂｙ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｐｒｅｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ
ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ｐｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄ ｏｎ ＭＳ ｍｅｄｉｕｍ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ０􀆰 ７５ ｍｏｌ􀅰Ｌ－１ ｓｕ￣
ｃｒｏｓｅ ｆｏｒ ３ ｄａｙｓ. Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｔｅｒｉｌｅ ａｉｒ ｉｎ ａ ｌａｍｉｎａｒ ｆｌｏｗ ｈｏｏｄ ｆｏｒ ７ ｈ ｏｒ ｓｔｅｒ￣
ｉｌｅ ｄｒｙ ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ｆｏｒ １１ ｈ. ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｔｈａｗｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ ３７ ℃ (２ ｍｉｎ). Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ
ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｗａｓ ｆｉｒｓｔ ｉｎ ｔｈｅ ｄａｒｋ ｆｏｒ ７ ｄ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄ ｏｆ １４ ｈ􀅰ｄ－１ . Ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｓｕｒｖｉｖ￣
ａｌ ｒａｔｅ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｉ ａｆｔｅｒ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ａｂｏｕｔ ４５％. Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ
ｔｉｍｅ ａｎｄ ｗｈｅｔｈｅｒ ｔｈｅ ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｃａｌｃｉｕｍ ａｌｇｉｎａｔｅ ｈａｄ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ. Ｍｏｒ￣
ｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔｕｄｙ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ａｎｄ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔａｂｌｅ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｒｅｄ ｂｕｄ ｔａｒｏ (Ｃｏｌｏｃａｓｉａ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ ｖａｒ. ｃｏｒｍｏｓｕｓ ｃｖ. Ｈｏｎｇｙａｙｕ)ꎻ Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓꎻ Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣
ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎꎻ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ
　 芋具有较丰富的营养价值ꎬ 在当今蔬菜消
费市场中占有重要地位ꎬ 是我国南方主要的蔬菜
种类ꎮ 红芽芋 (Ｃｏｌｏｃａｓｉａ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ Ｌ. Ｓｃｈｏｔｔ ｖａｒ.
ｃｏｒｍｏｓｕｓ ｃｖ. Ｈｏｎｇｙａｙｕ) 是江西省铅山县传统优
势产品ꎬ 种植历史悠久ꎮ 近十余年来ꎬ 这一优势
产业发展迅速ꎬ 已成为铅山县农民增收致富的主
植 物 分 类 与 资 源 学 报　 ２０１４ꎬ ３６ (４): ５０５~５１２
Ｐｌａｎｔ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ＤＯＩ: １０.７６７７ / ｙｎｚｗｙｊ２０１４１３１８１
∗
∗∗
基金项目: 江西省科技厅 ２０１２ 年农业科技支撑项目基金 (２０１２２ＢＢＦ６０１２６)ꎻ ２０１３ 年度江西省高等学校科技落地计划项目
(ＫＪＬＤ１３０８８)
通讯作者: Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｙｉｎｍｉｎｇｈｕａ０４＠１６３􀆰 ｃｏｍ
收稿日期: ２０１３－０９－１０ꎬ ２０１３－１１－０１接受发表
作者简介: 洪森荣 (１９７４－) 男ꎬ 硕士ꎬ 副教授ꎬ 研究方向: 植物组织培养ꎮ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｈｏｎｇｓｅｎｒｏｎｇ＠１６３􀆰 ｃｏｍ
导产业ꎬ 铅山县也成为江西省最大的红芽芋生产
基地ꎬ ２００２年获国家无公害绿色食品证书ꎬ ２００７
年 ３月被中国绿色食品委员会和农业部命名为
“红芽芋全国绿色食品标准化生产基地县”ꎬ 其产
品不但热销上海、 广东、 浙江、 湖北、 山东等地ꎬ
而且远销日本、 韩国、 新加坡等国 (郑建平ꎬ
２０１０ꎻ 李火金ꎬ ２０１２)ꎮ 红芽芋中碳水化合物含
量较高ꎬ 脂肪含量较低ꎬ 蛋白质、 维生素及矿物
质元素含量丰富ꎬ 营养价值高ꎬ 具有良好的食用
价值和开发前景 (姜绍通等ꎬ ２０１２)ꎮ 目前ꎬ 传
统的江西铅山红芽芋种质资源保存仍采用大田种
植的方法ꎬ 不仅需要大量的人力、 物力和财力ꎬ
而且还不可避免地受到各种自然灾害 (如病虫
害、 干旱、 低温等) 和人为失误 (疏于管理、
挂错标签等) 的影响ꎬ 最终可能造成特有种质的
遗失或混杂ꎮ 因此ꎬ 探索江西铅山红芽芋种质资
源超低温保存的方法具有十分重要的意义ꎮ
胚性愈伤组织是原生质体操作中最为重要的
原始材料ꎬ 无论是原生质体培养再生植株还是经
原生质体融合获得体细胞杂种ꎬ 都离不开胚性愈
伤组织的诱导和保存 (曾博雅等ꎬ ２００９)ꎮ 然而ꎬ
胚性愈伤组织在长期继代培养过程中经常丢失潜
在的形态发生能力ꎬ 从而增加了遗传学上的不稳
定性ꎮ 因此ꎬ 胚性愈伤组织的长期保存是人们一
直试图解决的问题ꎬ 超低温保存是胚性愈伤组织
长期保存的一种常用方法ꎮ 植物的胚性愈伤组织
如能成功地保存在液氮中ꎬ 则可为生物工程研究
提供全能性原生质体ꎬ 也可为植物转基因技术提
供良好受体材料ꎮ
包埋干燥法最早出现在法国学者 Ｆａｂｒｅ和 Ｄｅ￣
ｒｅｕｄｄｒｅ (１９９０) 超低温保存马铃薯茎尖的研究中ꎮ
包埋干燥法具有样品易于操作、 避免了二甲基亚
砜和程序降温仪的使用 (王君晖等ꎬ １９９９)ꎮ 目前
该技术已应用于长春花 (Ｂａｃｈｉｒｉ 等ꎬ １９９５)、 啤
酒花 ( Ｍａｒｔｉｎｅｚ 等ꎬ １９９９ )、 葡萄 ( Ｗａｎｇ 等ꎬ
２０００)、 苜蓿 ( Ｓｈｉｂｌｉ 等ꎬ ２００１)、 大叶蝴蝶兰
(Ａｍｉｒ等ꎬ ２０１１)、 冬凌草 (Ａｉ 等ꎬ ２０１２)、 阿拉
伯艾蒿 ( Ｓａｒａｂ 等ꎬ ２０１２ )、 苹果 ( Ｆｅｎｇ 等ꎬ
２０１３) 等植物的超低温保存中ꎮ 目前ꎬ 国内外
尚未见有关包埋干燥法超低温保存红芽芋胚性愈
伤组织的报道ꎮ 本实验建立了红芽芋胚性愈伤组
织的包埋干燥法超低温保存体系ꎬ 为长期稳定保
存江西铅山红芽芋种质资源提供技术基础ꎮ
１　 材料和方法
１􀆰 １　 材料
江西铅山红芽芋脱毒试管苗ꎬ 由江西省江天农业科
技有限公司提供ꎮ
１􀆰 ２　 方法
１􀆰 ２􀆰 １　 胚性愈伤组织诱导　 将江西铅山红芽芋脱毒试管
苗的小球茎横切成 １~ ２ ｍｍ 厚ꎬ 分别接种到诱导培养基
上ꎮ 诱导培养基为 ＭＳ＋ＴＤＺ ２ ｍｇ􀅰Ｌ－１＋２ꎬ ４￣Ｄ １ ｍｇ􀅰Ｌ－１ꎬ
并添加 ３０ ｇ􀅰Ｌ－１蔗糖和 ７ ｇ􀅰Ｌ－１琼脂ꎬ ｐＨ５􀆰 ８~６􀆰 ０ꎮ 光照
条件: 黑暗ꎻ 温度: (２５ ± １) ℃ꎮ 每天观察愈伤组织诱
导情况ꎬ 记录愈伤组织出现的时间、 出愈数、 愈伤组织
颜色和愈伤组织生长情况ꎮ ６０ ｄ 后ꎬ 选取浅黄色果冻状
的胚性愈伤组织继代 ２ 次ꎬ 每次 ３０ ｄꎬ 然后将其应用于
包埋干燥法超低温保存实验ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ２　 胚性愈伤组织的包埋干燥法超低温保存程序　 在
(２５ ± １) ℃下ꎬ 将约 ０􀆰 ２ ｇ的红芽芋胚性愈伤组织块转入
含 ２％褐藻酸钠和 １ ｍｏｌ􀅰Ｌ－１蔗糖的 ＭＳ 培养基中ꎬ 然后
将包含胚性愈伤组织的混合物滴入含有 ０􀆰 １ ｍｏｌ􀅰Ｌ－１
ＣａＣｌ２和 １ ｍｏｌ􀅰Ｌ
－１蔗糖的 ＭＳ液体培养基中 ３０ ｍｉｎꎬ 以充
分形成直径约 ４ ｍｍ 的球形包埋珠ꎮ 每个包埋珠含 １ 个
胚性愈伤组织块ꎮ 在无菌条件下ꎬ 取出包埋珠ꎬ 放入
１００ ｍＬ无菌三角瓶内ꎬ 倒入 ＭＳ＋ＴＤＺ ２ ｍｇ􀅰Ｌ－１ ＋ＮＡＡ １
ｍｇ􀅰Ｌ－１ (无蔗糖) 液体培养基进行洗涤ꎬ 洗涤后将包埋
珠夹出用无菌滤纸片吸干后: (１) 将包埋珠转入 ＭＳ＋
ＴＤＺ ２ ｍｇ􀅰Ｌ－１＋ＮＡＡ １ ｍｇ􀅰Ｌ－１＋ ０~１ ｍｏｌ􀅰Ｌ－１蔗糖的液体
培养基中ꎬ 预培养 ３ ｄꎻ (２) 或者将包埋珠转入 ＭＳ＋ＴＤＺ
２ ｍｇ􀅰Ｌ－１＋ＮＡＡ １ ｍｇ􀅰Ｌ－１＋ ０􀆰 ７５ ｍｏｌ􀅰Ｌ－１蔗糖的液体培养
基中ꎬ 预培养 ０~７ ｄꎮ 预培养条件均为: 光照时间: １４ ｈ
􀅰ｄ－１ꎻ 光照强度: １２􀆰 ５~ ２５ μｍｏｌ􀅰ｍ－２ ｓ－１ꎻ 温度: (２５ ±
１) ℃ꎮ 预培养后ꎬ 包埋珠表面迅速用灭菌滤纸干燥ꎬ 放
置在装有灭菌滤纸的培养皿 (直径 ９ ｃｍ) 中ꎬ 在室温下
采用超净工作台的层流空气脱水 ０~１０ ｈꎻ 或者在含有无
菌干燥硅胶的带硅胶塞的 １００ ｍＬ 密闭三角瓶中脱水 ０ ~
１５ ｈꎮ 每干燥脱水 １ ｈ 后ꎬ 均取 １５ 个包埋珠进行称重:
包埋珠放在烘箱中 ８０ ℃干燥 ２ ｄ后测其含水量ꎬ 以 (小
珠鲜重－干重) /鲜重的百分数表示ꎮ 取脱水包埋珠转移
到 ２ ｍＬ冻存管中ꎬ 然后将冻存管迅速置于液氮中保存 １ ｄꎮ
从液氮中取出冷冻管ꎬ 分别放入温度为 ２５ ℃、 ３０ ℃、
３７ ℃或 ４２ ℃的水浴中化冻 ３ ｍｉｎꎮ
１􀆰 ２􀆰 ３　 胚性愈伤组织恢复培养及成活率检测　 将化冻后
去除或不去除褐藻酸钙的红芽芋胚性愈伤组织块转入分
化培养基 (ＭＳ＋ＴＤＺ ２ ｍｇ􀅰Ｌ－１＋ＮＡＡ １ ｍｇ􀅰Ｌ－１＋３０ ｇ􀅰Ｌ－１
蔗糖＋７ ｇ􀅰Ｌ－１琼脂) 中ꎬ 然后置于两种培养条件下进行
恢复培养ꎮ 一是将化冻后的红芽芋胚性愈伤组织块直接
６０５　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 植 物 分 类 与 资 源 学 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 第 ３６卷
置于光周期中培养 [光照时间: １４ ｈ􀅰ｄ－１ꎻ 光照强度:
１２􀆰 ５~２５ μｍｏｌ􀅰ｍ－２ ｓ－１ꎻ 温度: (２５ ± １) ℃)]ꎻ 另一种
是先将化冻后的红芽芋胚性愈伤组织块暗培养 ７ ｄ [温
度: (２５ ± １) ℃]ꎬ 再转到光周期中培养 [光照时间:
１４ ｈ􀅰ｄ－１ꎻ 光照强度: １２􀆰 ５~２５ μｍｏｌ􀅰ｍ－２ ｓ－１ꎻ 温度: ２５
± １ ℃)]ꎮ ６０ ｄ后统计成活率及恢复生长的时间ꎮ 红芽
芋胚性愈伤组织块的成活以其能分化出胚状体为标志ꎮ
成活率＝(超低温保存后胚性愈伤组织分化出胚状体的块
数 /超低温保存后胚性愈伤组织的总块数)×１００％ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ４　 超低温保存后胚性愈伤组织再生苗的形态学和细
胞学检测　 将超低温保存后的红芽芋胚性愈伤组织块以
及未进行超低温保存处理的红芽芋胚性愈伤组织块
(ＣＫꎬ 约 ０􀆰 ２ ｇ) 同时接入分化培养基 (ＭＳ＋ＴＤＺ ２ ｍｇ􀅰
Ｌ－１＋ＮＡＡ １ ｍｇ􀅰Ｌ－１＋３０ ｇ􀅰Ｌ－１蔗糖＋７ ｇ􀅰Ｌ－１琼脂)ꎬ ３０ ｄ
后将分化出的胚状体再次转入分化培养基 (ＭＳ＋ＴＤＺ ２
ｍｇ􀅰Ｌ－１＋ＮＡＡ １ ｍｇ􀅰Ｌ－１ ＋３０ ｇ􀅰Ｌ－１蔗糖＋７ ｇ􀅰Ｌ－１琼脂)ꎬ
６０ ｄ形成完整植株后对以上两种再生苗进行形态学和细
胞学检测ꎮ 形态学检测指标有株高、 芽数、 根数、 根长
等ꎮ 细胞学检测采用染色体数目测定与观察的方法 (梁
乾隆等ꎬ ２０１３)ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ５　 统计方法 　 以上实验均重复 ３ 次 (每次实验的
样本量均为 ４５个)ꎬ 本实验所有数据表示为 Ｍｅａｎ ± ＳＤꎬ
由于统计各处理的细胞活力和成活率时发现多数实验数
据不在 ３０％~７０％范围内ꎬ 为提高显著性检验的精确度ꎬ
对其进行反正弦转换ꎬ 然后用 ＳＰＳＳ１９􀆰 ０ 软件进行 Ｏｎｅ￣
Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ分析ꎬ 再进行 ＬＳＤ法检验ꎬ Ｐ<０􀆰 ０５ 为有统
计学差异显著性ꎮ
２　 结果与分析
２􀆰 １　 预培养对红芽芋胚性愈伤组织包埋干燥法
超低温保存的影响
　 　 从表 １ ~ ２ 可知ꎬ 预培养对红芽芋胚性愈伤
组织包埋脱水法超低温保存具有显著影响ꎮ 当用
０~１ ｍｏｌ􀅰Ｌ－１蔗糖对红芽芋胚性愈伤组织预培养
３ ｄ或用 ０􀆰 ７５ ｍｏｌ􀅰Ｌ－１蔗糖对红芽芋胚性愈伤组
织预培养 ０~７ ｄ时ꎬ 结果表明ꎬ 红芽芋胚性愈伤
组织包埋干燥法超低温保存的最适宜预培养条件
为 ０􀆰 ７５ ｍｏｌ􀅰Ｌ－１蔗糖预培养 ３ ｄꎬ 蔗糖浓度过高
过低或预培养时间过长、 过短均不利于红芽芋胚
性愈伤组织的冻后成活ꎮ
２􀆰 ２　 干燥方式和时间对红芽芋胚性愈伤组织包
埋干燥法超低温保存的影响
　 　 从图 １和 ２可知ꎬ 脱水方式对红芽芋胚性愈
伤组织包埋干燥法超低温保存无显著影响ꎮ 无论
是层流空气脱水还是干燥硅胶脱水ꎬ 两者的最高
成活率无显著性影响ꎬ 但其脱水时间对红芽芋胚
性愈伤组织包埋干燥法超低温保存还是具有显著
影响ꎮ 结果表明ꎬ 当层流空气脱水时间超过 ４ ｈ
或干燥硅胶脱水时间超过 ７ ｈ 时ꎬ 红芽芋胚性愈
伤组织开始出现冻后成活ꎬ 而且随着脱水时间的
延长ꎬ 冻后成活率均显著增加ꎻ 当层流空气脱水
７ ｈ 或干燥硅胶脱水 １１ ｈ (即含水量为 ２１􀆰 ２％ ~
２１􀆰 ５％) 时ꎬ 红芽芋胚性愈伤组织的冻后成活率
达到 ４４􀆰 ６％ ~ ４５􀆰 ２％ꎻ 之后随着干燥时间的增
加ꎬ 冻后成活率下降ꎮ 因此ꎬ 红芽芋胚性愈伤组
织包埋干燥法超低温保存的适宜干燥时间为层流
空气脱水 ７ ｈ或干燥硅胶脱水 １１ ｈꎮ
２􀆰 ３　 化冻温度对红芽芋胚性愈伤组织包埋干燥
法超低温保存的影响
从表 ３可知ꎬ 化冻温度对红芽芋胚性愈伤组
织包埋脱水法超低温保存具有显著影响ꎮ 用
０􀆰 ７５ ｍｏｌ􀅰Ｌ－１蔗糖预培养 ３ ｄ后ꎬ 在含有干燥硅
表 １　 预培养液中蔗糖浓度对红芽芋胚性愈伤组织
包埋脱水法超低温保存的影响
Ｔａｂｌｅ １　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｅｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ
ｏｎ ｔｈｅ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｄ￣ｂｕｄｅｄ ｔａｒｏ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ
ｃａｌｌｕｓ ｂｙ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ
　 　 　 　 蔗糖浓度
Ｓｕｃｒｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ / ｍｏｌ􀅰Ｌ－１
成活率
Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ / ％
　 　 　 　 　 ０ １２􀆰 ６ ± ６􀆰 ３ Ｃｄ
　 　 　 　 　 ０􀆰 ２５ ２５􀆰 ８ ± ８􀆰 ２ Ｂｃ
　 　 　 　 　 ０􀆰 ５ ２９􀆰 ４ ± ６􀆰 ４ Ｂｂｃ
　 　 　 　 　 ０􀆰 ７５ ４６􀆰 ９ ± ７􀆰 ５ Ａａ
　 　 　 　 　 １ ３２􀆰 ５ ± ３􀆰 ２ Ｂｂ
注: 同一列中大、 小写字母分别表示在 ０􀆰 ０１ 和 ０􀆰 ０５ 水平上的
差异性ꎬ 下同
Ｎｏｔｅ: Ｔｈｅ ｃａｐｉｔａｌ ａｎｄ ｓｍａｌｌ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｖｏｌｕｍｅ ｓｔａｎｄ ｆｏｒ ｔｈｅ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｎ ０􀆰 ０１ ａｎｄ ０􀆰 ０５ ｌｅｖｅｌꎬ ｔｈｅ ｓａｍｅ ａｓ ｂｅｌｏｗ
表 ２　 预培养时间对红芽芋胚性愈伤组织包埋
脱水法超低温保存的影响
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｒｅｃｕｌｔｕｒｅ ｔｉｍｅ ｏｎ ｔｈｅ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｄ￣
ｂｕｄｅｄ ｔａｒｏ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ ｂｙ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ
预培养时间　 　
Ｐｒｅｃｕｌｔｕｒｅ ｔｉｍｅ / ｄ　 　
成活率
Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ / ％
０　 　 １３􀆰 ８ ± ３􀆰 ９ Ｄｄ
１　 　 ３５􀆰 ４ ± ５􀆰 ２ Ｃｃ
３　 　 ４８􀆰 ２ ± ４􀆰 ２ Ａａ
５　 　 ４０􀆰 ９ ± ４􀆰 ６ Ｂｂ
７　 　 ３４􀆰 ８ ± ８􀆰 ２ Ｃｃ
７０５４期　 　 　 　 　 　 　 　 洪森荣等: 江西铅山红芽芋胚性愈伤组织的包埋干燥法超低温保存　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　
图 １　 干燥硅胶脱水时间对红芽芋胚性愈伤组织包埋珠含水量的影响大、 小写字母分别
表示在 ０􀆰 ０１和 ０􀆰 ０５水平上的差异性ꎬ 下同
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｎ ｄｒｙ ｓｉｌｉｃａ￣ｇｅｌ ｏｎ ｔｈｅ ｗａｔｅｒ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｒｅｄ￣ｂｕｄｅｄ ｔａｒｏ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｂｅａｄｓ
Ｔｈｅ ｃａｐｉｔａｌ ａｎｄ ｓｍａｌｌ ｌｅｔｔｅｒｓ ｓｔａｎｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｎ ０􀆰 ０１ ａｎｄ ０􀆰 ０５ ｌｅｖｅｌꎬ ｔｈｅ ｓａｍｅ ａｓ ｂｅｌｏｗ
图 ２　 层流空气脱水时间对红芽芋胚性愈伤组织包埋珠含水量的影响
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｉｎ ｌａｍｉｎａｒ ａｉｒｆｌｏｗ ｏｎ ｔｈｅ ｗａｔｅｒ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｒｅｄ￣ｂｕｄｅｄ ｔａｒｏ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｂｅａｄｓ
表 ３　 化冻温度对红芽芋胚性愈伤组织包埋
脱水法超低温保存的影响
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈａｗｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｄ￣
ｂｕｄｅｄ ｔａｒｏ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ ｂｙ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ
化冻温度
Ｔｈａｗｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ / ℃
成活率
Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ / ％
２５ ２０􀆰 ４ ± ５􀆰 ３ Ｃｃ
３０ ３２􀆰 ６ ± ４􀆰 ２ Ｂｂ
３７ ４７􀆰 ４ ± ６􀆰 ８ Ａａ
４２ ３５􀆰 ２ ± ３􀆰 ９ Ｂｂ
胶的密闭容器中脱水 １１ ｈ 至含水量为 ２１􀆰 １％时ꎬ
投入液氮保存 １ ｄ后ꎬ 将包埋珠取出ꎬ 用温度为
２５ ℃、 ３０ ℃、 ３７ ℃或 ４２ ℃的水浴对红芽芋冻后
胚性愈伤组织进行化冻时ꎬ 结果表明ꎬ 江西铅山
红芽芋胚性愈伤组织包埋脱水法超低温保存的适
宜化冻温度为 ３７ ℃ꎮ
２􀆰 ４　 冻后培养条件对红芽芋胚性愈伤组织包埋
干燥法超低温保存的影响
　 　 从表 ４可知ꎬ 冻后培养条件对红芽芋胚性愈
伤组织包埋脱水法超低温保存具有显著影响ꎮ 包
埋珠用 ０􀆰 ７５ ｍｏｌ􀅰Ｌ－１蔗糖预培养 ３ ｄ 后ꎬ 在含有
干燥硅胶的密闭容器中脱水 １１ ｈ 至含水量为
２１􀆰 １％时ꎬ 投入液氮保存 １ ｄ 后ꎬ 将包埋珠取出ꎬ
用温度为 ３７ ℃的水浴对红芽芋冻后胚性愈伤组
织进行化冻ꎬ 然后直接置于光周期中培养或先暗
８０５　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 植 物 分 类 与 资 源 学 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 第 ３６卷
培养 ７ ｄ再转到光周期中培养时ꎬ 结果表明ꎬ 冻
后 ７ ｄ的暗培养有助于提高其冻后成活率ꎮ
表 ４　 冻后培养条件对红芽芋胚性愈伤组织包埋
脱水法超低温保存的影响
Ｔａｂｌｅ ４　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｏｓｔｔｈａｗ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ
ｏｆ ｒｅｄ￣ｂｕｄｅｄ ｔａｒｏ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ ｂｙ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ
冻后培养条件
Ｐｏｓｔｔｈａｗ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ
成活率
Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ / ％
直接置于光周期下培养
Ｄｉｒｅｃｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ ｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄ ３６􀆰 ８ ± ５􀆰 ４ Ｂｂ
先暗培养 ７ ｄ再置于光周期下培养
Ｆｉｒｓｔｌｙ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ ｄａｒｋ ｆｏｒ ７ ｄ ｔｈｅｎ ｉｎ
ｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄ
４５􀆰 ９ ± ４􀆰 ９ Ａａ
２􀆰 ５　 超低温保存时间对红芽芋胚性愈伤组织包
埋干燥法超低温保存的影响
从表 ５可知ꎬ 红芽芋胚性愈伤组织包埋珠用
０􀆰 ７５ ｍｏｌ􀅰Ｌ－１蔗糖预培养 ３ ｄ 后ꎬ 在含有干燥硅
胶的密闭容器中脱水 １１ ｈ 至含水量为 ２１􀆰 １％时ꎬ
投入液氮保存 １~１８０ ｄ后ꎬ 将包埋珠取出ꎬ 用温
度为 ３７ ℃的水浴对红芽芋冻后胚性愈伤组织进
行化冻ꎬ 然后先暗培养 ７ ｄ 再转到光周期中培养
时ꎬ 其冻后成活率虽有差异ꎬ 但未达显著性水
平ꎮ 因此ꎬ 超低温保存时间对红芽芋胚性愈伤组
织包埋干燥法超低温保存无显著影响ꎮ
２􀆰 ６　 褐藻酸钙对红芽芋胚性愈伤组织包埋干燥
法超低温保存的影响
红芽芋胚性愈伤组织包埋珠用 ０􀆰 ７５ ｍｏｌ􀅰Ｌ－１
蔗糖预培养 ３ ｄ后ꎬ 在含有干燥硅胶的密闭容器
中脱水 １１ ｈ至含水量为 ２１􀆰 １％时ꎬ 投入液氮保
存 １ ｄ后ꎬ 将包埋珠取出ꎬ 用温度为 ３７ ℃的水浴
对红芽芋冻后胚性愈伤组织进行化冻ꎬ 然后将去
除或保留褐藻酸钙的包埋珠先暗培养 ７ ｄ 再转到
光周期中培养ꎮ 从表 ６可知ꎬ 培养物抽提即去除
包裹的褐藻酸钙对红芽芋胚性愈伤组织包埋脱水
法超低温保存的成活率无显著影响ꎬ 但促进其冻
后再生速度ꎮ
表 ５　 超低温保存时间对红芽芋胚性愈伤组织包埋
脱水法超低温保存的影响
Ｔａｂｌｅ ５　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｎ ｔｈｅ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ
ｒｅｄ￣ｂｕｄｅｄ ｔａｒｏ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ ｂｙ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ
超低温保存时间
Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ / ｄ
成活率
Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ / ％
１ ４２􀆰 ６ ± ６􀆰 ３ Ａａ
３０ ４９􀆰 ３ ± ４􀆰 ９ Ａａ
６０ ４５􀆰 ８ ± ４􀆰 ２ Ａａ
９０ ４８􀆰 ２ ± ７􀆰 ２ Ａａ
１２０ ４２􀆰 ７ ± ５􀆰 ４ Ａａ
１５０ ５１􀆰 ４ ± ６􀆰 １ Ａａ
１８０ ４３􀆰 ７ ± ８􀆰 ２ Ａａ
２􀆰 ７　 冻后胚性愈伤组织再生苗的形态学和细胞
学检测
从表 ７、 图 ３~７可知ꎬ 红芽芋胚性愈伤组织
冻后再生苗与未冻后再生苗在形态指标上的差异
均未达显著性水平 (Ｐ>０􀆰 ０５)ꎮ 而且ꎬ 红芽芋胚
性愈伤组织冻后再生苗与未冻后再生苗的染色体
数目经检测未发生变化ꎮ 以上结果表明ꎬ 江西铅
山红芽芋胚性愈伤组织的包埋干燥法超低温保存
可以保证其遗传稳定性ꎮ
表 ６　 褐藻酸钙对红芽芋胚性愈伤组织包埋脱水法超低温保存的影响 (４２ ｄ)
Ｔａｂｌｅ ６　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｃａ￣ａｌｇｉｎａｔｅ ｏｎ ｔｈｅ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｄ￣ｂｕｄｅｄ ｔａｒｏ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ ｂｙ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ
褐藻酸钙 Ｃａ￣ａｌｇｉｎａｔｅ 成活率 Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ / ％ 平均新生芽长Ａｖｅｒａｇｅ ｎｅｗ ｂｕｄ ｌｅｎｇｔｈ
平均新生芽数
Ａｖｅｒａｇｅ ｎｅｗ ｂｕｄ ｎｕｍｂｅｒ
去除 Ｒｅｍｏｖｅ ４６􀆰 ３ ± ２􀆰 ９ Ａａ １􀆰 ３ ± ０􀆰 ２ Ａａ ３􀆰 ４ ± ０􀆰 ８ Ａａ
保留 Ｒｅｔａｉｎ　 ４５􀆰 ２ ± ５􀆰 １ Ａａ １􀆰 ６ ± ０􀆰 ４ Ｂｂ １􀆰 ８ ± ０􀆰 ５ Ｂｂ
表 ７　 超低温保存后红芽芋胚性愈伤组织再生苗的形态学检测
Ｔａｂｌｅ ７　 Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｐｌａｎｔｌｅｔｓ ｏｆ ｒｅｄ￣ｂｕｄｅｄ ｔａｒｏ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ ｐｏｓｔｔｈａｗ
形态指标 Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｅｘ
正常的胚性愈伤组织再生苗
Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｐｌａｎｔｌｅｔ
ｗｉｔｈｏｕｔ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ
冻后胚性愈伤组织再生苗
Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ ｐｏｓｔｔｈａｗ
ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｐｌａｎｔｌｅｔ
平均株高 Ａｖｅｒａｇｅ ｐｌａｎｔｌｅｔ ｈｅｉｇｈｔ / ｃｍ ８􀆰 ２ ± １􀆰 ８ Ａａ ７􀆰 ６ ± ２􀆰 ３ Ａａ
平均新生芽数 Ａｖｅｒａｇｅ ｎｅｗ ｂｕｄ ｎｕｍｂｅｒ ４􀆰 ２ ± ０􀆰 ９ Ａａ ３􀆰 ８ ± １􀆰 ５ Ａａ
平均新生根数 Ａｖｅｒａｇｅ ｎｅｗ ｒｏｏｔ ｎｕｍｂｅｒ ５􀆰 ６ ± １􀆰 ３ Ａａ ６􀆰 ３ ± ２􀆰 ２ Ａａ
平均根长 Ａｖｅｒａｇｅ ｒｏｏｔ ｌｅｎｇｔｈ / ｃｍ ６􀆰 ８ ± ２􀆰 １ Ａａ ７􀆰 ９ ± １􀆰 ４ Ａａ
９０５４期　 　 　 　 　 　 　 　 洪森荣等: 江西铅山红芽芋胚性愈伤组织的包埋干燥法超低温保存　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　
图 ３　 红芽芋胚性愈伤组织冻后萌发
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｒｅｄ￣ｂｕｄｅｄｔａｒｏ ｐｏｓｔｔｈａｗ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ
ｃａｌｌｉ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
图 ４　 红芽芋胚性愈伤组织冻后再生小苗 (左为正常的胚性
愈伤组织再生苗ꎬ 右为冻后胚性愈伤组织再生苗)
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｒｅｄ￣ｂｕｄｅｄ ｔａｒｏ ｐｏｓｔｔｈａｗ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｉ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ
ｐｌａｎｔｌｅｔｓ (Ｌｅｆｔ ｗａｓ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｐｌａｎｔｌｅｔ
ｗｉｔｈｏｕｔ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎꎬ ｒｉｇｈｔ ｗａｓ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ
ｃａｌｌｕｓ ｐｏｓｔｔｈａｗ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｐｌａｎｔｌｅｔ)
图 ５　 红芽芋胚性愈伤组织冻后再生小苗增殖 (左为正常的胚性愈伤组织再生苗ꎬ 右为冻后胚性愈伤组织再生苗)
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｒｅｄ￣ｂｕｄｅｄ ｔａｒｏ ｐｏｓｔｔｈａｗ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｉ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｐｌａｎｔｌｅｔ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ (Ｌｅｆｔ ｗａｓ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
ｐｌａｎｔｌｅｔ ｗｉｔｈｏｕｔ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎꎬ ｒｉｇｈｔ ｗａｓ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ ｐｏｓｔｔｈａｗ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｐｌａｎｔｌｅｔ)
图 ６　 红芽芋胚性愈伤组织冻后再生小苗继代生长 (左为正常
的胚性愈伤组织再生苗ꎬ 右为冻后胚性愈伤组织再生苗)
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｒｅｄ￣ｂｕｄｅｄ ｔａｒｏ ｐｏｓｔｔｈａｗ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｉ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ
ｐｌａｎｔｌｅｔ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ ｇｒｏｗｔｈ (Ｌｅｆｔ ｗａｓ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ
ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｐｌａｎｔｌｅｔ ｗｉｔｈｏｕｔ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎꎬ ｒｉｇｈｔ ｗａｓ
ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ ｐｏｓｔｔｈａｗ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｐｌａｎｔｌｅｔ)
图 ７　 红芽芋胚性愈伤组织冻后再生植株移栽成活 (左为正常
的胚性愈伤组织再生苗ꎬ 右为冻后胚性愈伤组织再生苗)
Ｆｉｇ􀆰 ７　 Ｒｅｄ￣ｂｕｄｅｄ ｔａｒｏ ｐｏｓｔｔｈａｗ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｉ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ
ｐｌａｎｔｌｅｔ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ (Ｌｅｆｔ ｗａｓ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ
ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｐｌａｎｔｌｅｔ ｗｉｔｈｏｕｔ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎꎬ ｒｉｇｈｔ ｗａｓ
ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ ｐｏｓｔｔｈａｗ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｐｌａｎｔｌｅｔ)
０１５　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 植 物 分 类 与 资 源 学 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 第 ３６卷
３　 讨论
包埋干燥法是将样品用褐藻酸钙包埋和脱水
后ꎬ 投入液氮中保存的方法ꎮ 该方法容易掌握ꎬ
可缓和脱水过程ꎬ 简化脱水程序ꎬ 而且一次能处
理较多的材料 (曾博雅等ꎬ ２００９)ꎮ 在植物种质
资源的超低温保存中ꎬ 包埋干燥法对物种的依赖
性较低ꎬ 适用范围很广ꎬ 因此ꎬ 得到人们的青
睐ꎮ 近年来ꎬ 包埋干燥法在植物种质保存中应用
广泛ꎬ 且发展迅速ꎬ 不仅有更多的植物种类和种
质类型采用此法保存获得成功ꎬ 而且在保存技术
上也有了新的突破ꎮ 通常包埋干燥法超低温保存
一般包括包埋、 预培养、 干燥脱水、 化冻和再培
养等步骤 (谷月等ꎬ ２００７)ꎮ
预培养一般指用高浓度的蔗糖预培养ꎬ 预培
养有利于保存细胞的生活力ꎬ 提高材料的抗冻力
和抗脱水力ꎬ 又不至于使材料受到太多的高渗损
伤 (谷月等ꎬ ２００７)ꎮ 苹果 “Ｇａｌａ” (Ｍａｌｕｓ×ｄｏｍ￣
ｅｓｔｉｃａ Ｂｏｒｋｈ.) 茎尖在 ０􀆰 ５ ｍｏｌ􀅰Ｌ－１蔗糖中预培养
７ ｄꎬ 冻后再生率为 ７５％ (Ｆｅｎｇ等ꎬ ２０１３)ꎮ 啤酒
花茎尖在 ０􀆰 ７５ ｍｏｌ􀅰Ｌ－１蔗糖中预培养 ２ ｄꎬ 冻后
成活率约为 ８０％ (Ｍａｒｔｉｎｅｚ 等ꎬ １９９９)ꎮ 大叶蝴蝶
兰类原球茎在 ０􀆰 ７５ ｍｏｌ􀅰Ｌ－１蔗糖中预培养 ３ ｄꎬ 冻
后成活率和再生率分别为 ４６􀆰 ６％和 ３０％ (Ａｍｉｒ
等ꎬ ２０１１)ꎮ 苜蓿细胞悬浮培养物在 ０􀆰 ７５ ｍｏｌ􀅰Ｌ－１
蔗糖中预培养 ４ ｄꎬ 两种细胞系 ５ ２６２ 和 ５ ９２９
的冻后成活率分别为 ２２􀆰 ２％和 ８􀆰 １％ (Ｓｈｉｂｌｉ 等ꎬ
２００１)ꎮ 长春花悬浮细胞在 １ ｍｏｌ􀅰Ｌ－１蔗糖中预培
养 ７ ｄꎬ 冻后成活率约为 ５０％ (Ｂａｃｈｉｒｉ等ꎬ １９９５)ꎮ
阿拉伯艾蒿茎尖在 １􀆰 ０ ｍｏｌ􀅰Ｌ－１蔗糖中预培养 ３ ｄ
后ꎬ 经无菌空气流脱水ꎬ 冻后成活率为 ４０％
(Ｓａｒａｂ等ꎬ ２０１２)ꎮ 本实验也表明ꎬ 红芽芋胚性
愈伤组织在 ０􀆰 ７５ ｍｏｌ􀅰Ｌ－１蔗糖中预培养 ３ ｄꎬ 包
埋干燥法超低温保存后的成活率为 ４６％ ~ ４９％ꎮ
因此ꎬ 在包埋干燥法超低温保存中ꎬ 预培养液中
的最适蔗糖浓度一般为 ０􀆰 ５ ~ １ ｍｏｌ􀅰Ｌ－１ꎬ 预培养
时间一般为 ２~７ ｄꎬ 具体蔗糖浓度和预培养时间
依植物材料而异ꎮ
脱水过程就是将保存材料的含水量降低到一
个最适范围ꎮ 包埋珠的含水量是决定细胞成活
和再生的一个重要因子 (Ａｉ 等ꎬ ２０１２)ꎮ 一般能
确保植物材料成活的适宜含水量在 ２０％ ~ ４０％
(Ａｍｉｒ等ꎬ ２０１１)ꎮ 啤酒花茎尖在干燥硅胶上脱
水 ４ ｈꎬ 含水量为 １６％时ꎬ 可获得约 ８０％的成活
率 (Ｍａｒｔｉｎｅｚ等ꎬ １９９９)ꎮ 冬凌草茎尖在干燥硅
胶上脱水 ５ ~ ７ ｈꎬ 含水量为 ２１􀆰 １％ ~ ２４􀆰 ２％时ꎬ
可获得约 ８５％的成活率 (Ａｉ 等ꎬ ２０１２)ꎮ 枳橙
[Ｐｏｎｃｉｒｕｓ ｔｒｉｆｏｌｉａｔａ (Ｌ.) Ｒａｆ. × Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ (Ｌ.)
Ｏｓｂｅｃｋ.] 茎尖在无菌空气流中脱水 ８ ｈꎬ 含水量
为 １７􀆰 １％时ꎬ 可获得约 ４０％的成活率 (Ｗａｎｇ
等ꎬ ２００２)ꎮ 长春花悬浮细胞在无菌空气流中脱
水 ４ ｈꎬ 含水量为 ０􀆰 ３４ ｇ􀅰ｇ－１ ＤＷ 时ꎬ 可获得约
５０％的成活率 (Ｂａｃｈｉｒｉ 等ꎬ １９９５)ꎮ 阿拉伯艾蒿
茎尖在无菌空气流中脱水 ４ ｈꎬ 含水量为 １２􀆰 ５６％
时ꎬ 可获得约 ６％的再生率 ( Ｓａｒａｂ 等ꎬ ２０１２)ꎮ
苹果 “Ｇａｌａ” (Ｍａｌｕｓ×ｄｏｍｅｓｔｉｃａ Ｂｏｒｋｈ.) 茎尖在
无菌空气流中脱水 ５ ~ ７ ｈꎬ 含水量为 ２０％ ~ ２２％
时ꎬ 可获得 ８０％ ~ ８２％ 的成活率 ( Ｆｅｎｇ 等ꎬ
２０１３)ꎮ 木蓝腋芽分生组织在无菌空气流中脱水
４ ｈꎬ 含水量为 １６％时ꎬ 可获得 ５６􀆰 ７％的成活率
(Ｎａｉｒ和 Ｒｅｇｈｕｎａｔｈꎬ ２００９)ꎮ 苜蓿细胞悬浮培养
物在无菌空气流中脱水 ４ ｈꎬ 含水量为 ０􀆰 ３３ ｇ􀅰
ｇ－１ ＤＷ时ꎬ 两种细胞系 ５ ２６２ 和 ５ ９２９ 的冻后成
活率分别为 ２５􀆰 １％和 １４􀆰 ３％ (Ｓｈｉｂｌｉ 等ꎬ ２００１)ꎮ
本实验表明ꎬ 红芽芋胚性愈伤组织包埋干燥法超
低温保存后的成活率依赖于材料脱水后的含水
量ꎬ 与脱水方式无关ꎮ 只要含水量降至 ２１􀆰 ２％ ~
２１􀆰 ３％ꎬ 红芽芋胚性愈伤组织包埋干燥法超低温
保存后的成活率均可达到 ４５％ꎮ Ｗａｎｇ 等 (２０００)
在葡萄茎尖的包埋脱水法超低温保存中也发现ꎬ
葡萄茎尖在无菌空气流中脱水 ７ ｈ 含水量为
１６􀆰 ４％或在干燥硅胶上脱水 ４􀆰 ５ ｈ含水量为 １６􀆰 １％
时ꎬ 也均可获得 ５９􀆰 ３％ ~ ６０􀆰 ５％的成活率ꎮ 这与
本实验结果一致ꎮ 但大叶蝴蝶兰类原球茎在干燥
硅胶上的脱水效果好于无菌空气流中脱水ꎬ 干燥
硅胶脱水 ６ ｈ后ꎬ 含水量为 ３２％ꎬ 可获得 ３０％的
再生率 (Ａｍｉｒ等ꎬ ２０１１)ꎮ
化冻方式也会显著影响冻后材料的成活率ꎮ
研究表明ꎬ 在 ３７~４０ ℃的水浴中快速化冻约 １ ~
３ ｍｉｎꎬ 可以避免慢速化冻过程中再次发生结冰
的冷冻伤害 (Ｗａｎｇ 等ꎬ ２０００)ꎮ 葡萄茎尖包埋脱
水法超低温保存后于 ４０ ℃水浴快速化冻ꎬ 其成活
率显著高于室温下化冻的效果 (Ｗａｎｇ 等ꎬ ２０００)ꎮ
本实验结果也表明ꎬ 太高或太低的化冻温度均不
利于红芽芋胚性愈伤组织包埋干燥法超低温保存
１１５４期　 　 　 　 　 　 　 　 洪森荣等: 江西铅山红芽芋胚性愈伤组织的包埋干燥法超低温保存　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　
的冻后成活ꎬ 只有在 ３７ ℃的水浴中化冻 ３ ｍｉｎꎬ
红芽芋胚性愈伤组织的冻后成活率可达 ４７􀆰 ４％ꎮ
在进行包埋干燥法超低温保存时ꎬ 一般不要把包
裹的褐藻酸钙去除ꎬ 可直接将包埋珠进行再培养
(Ｓｅｎ￣Ｒｏｎｇ和 Ｍｉｎｇ￣Ｈｕａꎬ ２０１３)ꎮ 本实验表明ꎬ 是
否去除包裹的褐藻酸钙对红芽芋胚性愈伤组织包
埋干燥法超低温保存的成活率无显著影响ꎬ 但可
促进其冻后芽长和芽数的增加ꎬ 本实验结果与
Ｗａｎｇ等 (２００２) 的实验结果一致ꎮ
实验结果表明: 红芽芋胚性愈伤组织包埋干
燥法超低温保存后的平均成活率约为 ４５％ꎬ 形
态学和细胞学检测表明红芽芋胚性愈伤组织冻后
再生苗与母本材料相比没有发生变异ꎮ
〔参　 考　 文　 献〕
Ａｉ ＰＦꎬ Ｌｕ ＬＰꎬ Ｓｏｎｇ ＪＪꎬ ２０１２. Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ￣ｇｒｏｗｎ
ｓｈｏｏｔ￣ｔｉｐｓ ｏｆ Ｒａｂｄｏｓｉａ ｒｕｂｅｓｃｅｎｓ ｂｙ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ａｎｄ
ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ [ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌꎬ Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ
Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅꎬ １０８ (３): ３８１—３８７
Ａｍｉｒ ＡＫꎬ Ｕｍａ ＲＳꎬ Ｐａｕｌ Ｌ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１１. Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｏ￣
ｃｏｒｍ￣ｌｉｋｅ ｂｏｄｉｅｓ ( ＰＬＢｓ) ｏｆ Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ｂｅｌｌｉｎａ ( Ｒｃｈｂ. ｆ.)
Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｏｎ ｂｙ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ [ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌꎬ Ｔｉｓ￣
ｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅꎬ １０７ (３): ４７１—４８１
Ｂａｃｈｉｒｉ Ｙꎬ Ｇａｚｅａｕ Ｃꎬ Ｈａｎｓｚ Ｊ ｅｔ ａｌ.ꎬ １９９５. Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａ￣
ｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ [Ｊ] . Ｐｌａｎｔ
Ｃｅｌｌꎬ Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅꎬ ４３ (３): ２４１—２４８
Ｆａｂｒｅ Ｊꎬ Ｄｅｒｅｕｄｄｒｅ Ｊꎬ １９９０. Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ: ａ ｎｅｗ ａｐ￣
ｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｏｌａｎｕｍ ｓｈｏｏｔ ｔｉｐｓ [ Ｊ] . ＣｒｙｏＬｅｔ￣
ｔｅｒｓꎬ １１ (６): ４１３—４２６
Ｆｅｎｇ ＣＨꎬ Ｃｕｉ ＺＨꎬ Ｌｉ ＢＱ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１３. Ｄｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｐｒｅｃｕｌｔｕｒｅ
ｉｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ｓｈｏｏｔ ｒｅｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ￣ｇｒｏｗｎ ａｐｐｌｅ ｓｈｏｏｔ￣ｔｉｐｓ
ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ｂｙ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ [ Ｊ ] . Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌꎬ
Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅꎬ １１２ (３): ３６９—３７８
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