全 文 ：都支杜鹃遗传多样性的 ISSR分析*
赵摇 凯1,2, 王德元2, 张文娟2, 邵剑文2**
(1 安庆师范学院生命科学学院, 安徽 安庆摇 246011; 2 安徽师范大学生命科学学院, 安徽 芜湖摇 241000)
摘要: 通过 ISSR分子标记对都支杜鹃 (Rhododendron shanii) 5 个居群 114 个个体的遗传多样性进行了分
析。 8 个引物共检测到 69 个位点, 其中多态位点 36 个, 多态位点百分率 (P) 为 52. 17% ; 物种水平的
Shannon多样性指数 ( I) 为 0. 2536, Nei指数 (H) 为 0. 1659; 居群水平的 P、 I和 H分别平均为 32. 46%、
0. 1955和 0. 1344; Nei爷s基因分化系数 GST = 0. 1845, 基因流 Nm = 2. 2104; 遗传结构的 AMOVA 分析显示,
总的遗传变异中 88. 3%存在于居群内, 11. 7%存在于居群间; PCA分析和 Splite Tree构建的 NJ树均显示居
群间分化小; 遗传距离与地理距离显著相关。 较强的基因流、 多年生木本及异交与分布区狭窄等可能是导致
都支杜鹃遗传多样性较低的主要原因。 目前该种的保护应以就地保护为主, 尤其要注意对大居群的保护。
关键词: 都支杜鹃; 遗传多样性; ISSR; 物种保护
中图分类号: Q 16摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 文章编号: 2095-0845(2013)05-578-07
Genetic Diversity of Rhododendron shanii Based on ISSR Analysis
ZHAO Kai1,2, WANG De鄄Yuan2, ZHANG Wen鄄Juan2, SHAO Jian鄄Wen2**
(1 College of Life Science, Anqing Normal University, Anqing 246011, China; 2 College of
Life Science, Anhui Normal University, Wuhu 241000, China)
Abstract: Genetic diversity across five sampled populations of Rhododendron shanii Fang was analyzed using ISSR
molecular markers. A total of 69 loci, 36 of which were polymorphic, were detected using 8 ISSR primers. At the
species level, total percentage of polymorphic loci (P) was 52. 17%, and Shannon爷s information index (I) and Nei爷s
gene diversity (h) were 0. 2536 and 0. 1659, respectively. At the population level, the mean value of P, I and h were
32. 46%, 0. 1955 and 0. 1344, respectively. The coefficient of genetic differentiation (GST) was 0. 1845 and the gene
flow (Nm) was 2. 2104. Analysis of molecular variance (AMOVA) demonstrated that the within populations compo鄄
nent accounted for 88. 3% of the total variation, while the among populations component accounted for 11. 7% . The
results of principal component analysis (PCA) and Neighbor鄄joining also revealed that differences among populations
were small and most genetic diversity was present within populations. Mantel爷s test showed there was significant corre鄄
lation between genetic and geographical distance. The pattern of genetic structure recorded in R. shanii possibly stems
from fairly frequent gene鄄flow among populations, a perennial woody habit and a limited distribution range. At pres鄄
ent, priority must be given to in situ conservation of extant populations. In this regard, attention should be paid to
large populations of R. shanii, which appear to contain most of the genetic diversity present within the species.
Key words: Rhododendron shanii; Genetic diversity; ISSR; Conservation
摇 自从 19 世纪杜鹃属 (Rhododendron L. ) 植
物被大量发现并引种到欧洲以来, 该属植物在园
艺学上就占据了相当重要的地位 (张敬丽等,
2007), 目前已知的杜鹃杂交品种有上万个 (余
植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 2013, 35 (5): 578 ~ 584
Plant Diversity and Resources摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 DOI: 10. 7677 / ynzwyj201312172
*
**
基金项目: 国家自然科学基金项目 (31170317) 和安徽省高校省级自然科学研究项目 (KJ2011A132)
通讯作者: Author for correspondence; E鄄mail: shaojw@ mail. ahnu. edu. cn
收稿日期: 2012-12-19, 2013-02-25 接受发表
作者简介: 赵摇 凯 (1984-) 男, 博士生, 助教, 主要从事植物生态学研究。 E鄄mail: zhaokai1911@ 126. com
树勋, 1986)。 在杜鹃属植物中, 常绿杜鹃亚属
(Subgen. Hymenanthes (Blume) K. Koch) 植物
因其常绿、 花大而多、 簇生、 花色艳丽等特征而
成为中外著名的观赏花卉和庭园绿化树种 (闵
天禄, 1984)。 在中国大别山区一共有 3 种常绿
杜鹃亚属植物分布, 即云锦杜鹃 (Rhododendron
fortunei Lindl. )、 黄山杜鹃 (R. maculiferum Franch.
Subsp. anhweiense (Wils. ) Chamb. ) 和都支杜
鹃 (R. shanii Fang) (钱啸虎, 1991), 其中以都
支杜鹃种质资源最为稀缺。 都支杜鹃是我国杜鹃
花专家方文培先生发表的杜鹃属新种, 现仅分布
于安徽省岳西县、 霍山县与湖北省英山县三县交
界处, 生境仅限海拔 1 400 m以上的山脊或靠近山
脊的山坡上, 区域面积不足 110 km2, 居群面积总
和不到 1. 2 km2, 是急需保护且具有极高园艺开发
价值的狭域、 濒危物种 (赵凯等, 2010; 2012)。
对濒危物种遗传多样性的研究能了解物种的
进化历史以及濒危机制, 是保护生物学研究的核
心内容之一 (Falk 和 Holsinger, 1991; 洪德元,
1995), 并可为珍稀濒危物种的保护和栽培利用
提供重要信息 (Hamrick和 Godt, 1996)。 简单重
复序列区间 (ISSR, inter simple sequence repeat)
分子标记技术 (Zietkiewicz 等, 1994) 具有较好
的可重复性和可靠性, 且引物设计简单, 快速灵
敏, 价格低廉 (Mattioni, 2002), 目前已被广泛
应用于杜鹃属植物的遗传多样性检测中 ( Liu
等, 2012)。 本文通过对都支杜鹃 5 个野生居群
的遗传多样性进行 ISSR 的研究, 旨在为都支杜
鹃野生居群的保护、 人工栽培利用提供指导。
1摇 材料与方法
1. 1摇 材料采集
2010 年 5 月, 采集 5 个野生自然居群 (表 1), 共
114 个植株。 每个居群采集 20 个以上成年植株, 各采样
植株尽量均匀分布于居群内, 选择当年生健康幼嫩叶
片, 变色硅胶干燥, -4 益保存备用。
1. 2摇 DNA的提取及 PCR反应体系
取硅胶干燥的叶片约 0. 5 g, 快速核酸提取仪 (Fast鄄
Prep FP120, BIO0101 公司) 粉碎 (反应条件为 4. 5 M,
45 sec), 高盐低 pH法提取都支杜鹃基因组 DNA (王传
堂等, 2002)。 紫外分光光度计测定 OD260 和 OD280 值,
确定其纯度及浓度后, -20 益保存备用。
ISSR引物序列由加拿大哥伦比亚大学 (University of
British Columbia) 提供, 上海生物技术有限公司合成,
PCR反应在 Bio鄄Rad iCycler PCR 仪中进行。 PCR 扩增条
件为: 15 滋L 反应体系, 包括 20 ng 模板 DNA、 0. 3 滋M
引物、 1. 5 滋L Buffer (Mg2+ free), 0. 5 U Taq酶、 1. 5 mM
MgCl2和 0. 1 mM dNTP (颜亮和赵凯, 2011)。 PCR 循环
过程为: 94 益预变性 5 min, 94 益变性 30 s, 退火 45 s
(不同引物退火温度见表 2), 72 益延伸 90 s, 35 个循
环, 72 益延伸 10 min。 PCR产物用含有 0. 1%EB和 2. 0%
琼脂糖的凝胶电泳, 电泳缓冲液为 0. 5伊TBE, 以 DL2000
Marker (Takara, 宝生生物工程大连有限公司) 为分子
量标记, 在 5 V / cm稳定电压条件下电泳 3 ~ 4 h, 凝胶成
像系统 (Bio鄄Rad Gel Doc XR) 拍照。
1. 3摇 数据统计
记录电泳图谱上 0. 2 ~ 2 kb 之间的所有条带, 每个
条带代表一个分子标记和引物结合位点, 统计各引物在
所有个体出现条带的位点, 每个个体在位点上有条带记
为 1, 无条带记为 0, 形成原始数据矩阵。 多态位百分率
(P)、 观察杂合度 (Ho)、 预期杂合度 (He)、 Shannon
信息指数 ( I)、 Nei 指数 (H)、 Nei爷s 基因分化指数
(GST) 以及居群间基因流 (Nm) 均通过 POPGENE 1. 32
计算 ( Yeh 和 Yang, 1999 ); 通过 Arlequin 3. 0 软件进
行分子变异分析 ( AMOVA) ( Excoffier 等, 2005 );
Phylip ver 3. 67 (Felsenstein, 2004) 进行 UPGMA 聚类分
析; 以个体为单位, 用 MVSP 3. 1 进行主成分分析
(principal component analysis, PCA) ( Kovach, 1999 );
Splits Tree 4 构建 NJ 树 (Huson 和 Bryant, 2006); 采用
Mantel法检验遗传距离与地理距离的相关性 (Mantel,
1967)。
表 1摇 实验居群采集地点自然概况
Table 1摇 Detailed information on the sampled populations
居群
Polulation
地点
Locality
纬度
Latitude
经度
Longitude
海拔
Altitude / m
采样数量
Sample size
鹞落坪(YLP) 岳西县包家乡都支尖 Duzhijian in Baojia Town, Yuexi County 30毅58忆10义 116毅06忆16义 1 650 24
白马尖(BMJ) 霍山县磨子潭镇白马尖 Baimajian in Mozitan Town, Huoshan County 31毅06忆53义 116毅11忆59义 1 755 23
猪头尖(ZTJ) 霍山县太阳乡猪头尖 Zhutoujian in Taiyang Town, Huoshan County 31毅07忆22义 116毅12忆01义 1 567 23
多云尖(DYJ) 霍山县磨子潭镇多云尖 Duoyunjian in Mozitan Town, Huoshan County 31毅07忆44义 116毅13忆10义 1 693 23
石壁沟(SBG) 岳西县河图镇石壁沟 Shibigou in Hetu Town, Yuexi County 30毅57忆17义 116毅04忆25义 1 658 21
9755 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 赵摇 凯等: 都支杜鹃遗传多样性的 ISSR分析摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
2摇 结果
2. 1摇 遗传多样性
共筛选出 8 条在所有居群中均能扩增出清晰
条带且条带不弥散、 不模糊、 重复性好的引物,
并根据优化后的反应体系, 用随机选取的混合模
板在梯度 PCR仪中筛选各引物的最佳退火温度,
结果见表 2。
来自 5 个居群的 114 个个体分别用 8 个引物
进行 PCR扩增, 共得到 69个位点, 总多态性条带
数量为 36 条, 多态位点百分率 (P) 为 52. 17%,
居群内多态位点百分率介于 18. 84% ~ 42. 03%
之间, 平均 32. 46% ; 观察杂合度 (Ho) 介于
1. 1884 和 1. 4203 之间, 平均 1. 3246; 预期杂合
表 2摇 ISSR引物和最佳退火温度 (Tm)
Table 2摇 ISSR Primers and optimal annealing temperature (Tm)
引物
Primer
序列
Sequence
退火温度
Annealing
temperature
/ 益
条带数
No. of
bands
scored
UBC815 CTC TCT CTC TCT CTC TG 59. 5 5
UBC816 CAC ACA CAC ACA CAC AT 55. 7 7
UBC817 CAC ACA CAC ACA CAC AA 55. 7 9
UBC825 ACA CAC ACA CAC ACA CT 55. 7 11
UBC827 ACA CAC ACA CAC ACA CG 55. 7 8
UBC840 GAG AGA GAG AGA GAG AYT 59. 5 14
UBC856 ACA CAC ACA CAC ACA CYA 55. 7 7
UBC874 CCC TCC CTC CCT CCC T 55. 7 8
度 (He) 介于1. 1387和1. 3329之间, 平均1. 2411;
Shannon信息指数 ( I) 的变化范围在 0. 1149 到
0. 2601 之间, 平均为 0. 1955; Nei 基因多样性
(H) 的大小从 0. 0791 到 0. 1814, 平均为 0. 1344。
物种水平的Ho、 He、 I和H分别为1.5217、 1. 2706、
0. 2536 和 0. 1659 (表 3)。
2. 2摇 遗传结构
Nei爷s 基因分化系数 GST = 0. 1845, 基因流
Nm=2. 2104。 AMOVA 分子变异分析显示, 在总
的遗传变异中 88. 3%发生在居群内, 11. 7%发生
在居群间, 居群间有显著的遗传变异 (P<0. 01)
(表 4)。 主成分分析和 Splite Tree 构建的 NJ 树
的结果相似, 各居群的个体并没有单独聚在一起
或构成一支, 个体相互夹杂在一起, 表明各居群
相似度较高, 并未出现明显分化 (图 1, 2)。
2. 3摇 遗传距离
居群间平均遗传距离为 0. 04435, ZTJ、 BMJ、
DYJ三个居群之间遗传距离都很小, 而且均低于
或接近平均遗传距离的一半, YLP 和 SBG 居群
与其他居群的遗传距离都远高于平均遗传距离
(表 5)。 遗传距离和地理距离有显著的相关性
(R=0. 762, P = 0. 01, n = 10)。 构建 UPGMA 树
结果显示 ZTJ、 DYJ和 BMJ三个地理距离较近的
居群聚在了一起 (图 3)。
表 3摇 都支杜鹃居群的遗传多样性
Table 3摇 Genetic diversity within populations of R. shanii
Populations n P / % Ho He I H
ZTJ 13 36. 23 1. 3623依0. 4842 1. 2610依0. 3816 0. 2123依0. 2943 0. 1439依0. 2060
YLP 12 26. 09 1. 2609依0. 4423 1. 1852依0. 3387 0. 1528依0. 2655 0. 1046依0. 1845
BMJ 16 39. 13 1. 3913依0. 4916 1. 2877依0. 3790 0. 2372依0. 3010 0. 1632依0. 2089
DYJ 17 42. 03 1. 4203依0. 4972 1. 3329依0. 4190 0. 2601依0. 3150 0. 1814依0. 2220
SBG 11 18. 84 1. 1884依0. 3939 1. 1387依0. 2974 0. 1149依0. 2413 0. 0791依0. 1668
Species 36 52. 17 1. 5217依0. 5032 1. 2706依0. 3311 0. 2536依0. 2714 0. 1659依0. 1859
n为多态性位点数, P为多态性位点百分率; Ho为观察杂合度; He为预期杂合度; I为 Shannon信息指数; H为 Nei爷s多样性指数
n is the number of polymorphicloc; P is the percentage of polymorphic loci; Ho is observed heterozygosity; He is expected heterozygosity; I is Sha鄄
noon爷s index of diversity; H is Nei爷s genetic diversity
表 4摇 都支杜鹃 5 个居群 114 个个体的 AMOVA分析
Table 4摇 Analysis of molecular variance of 114 individuals from five populations of R. shanii
变异来源
Source of variance 自由度 df 平方和 SSD 方差 MSD
变异组分
Variance component
百分率
Percentage / % P
居群间 Among populations 4 53. 5746 13. 394 0. 4415 11. 7 <0. 01
居群内 Within populations 109 363. 1447 3. 332 3. 3316 88. 3 <0. 01
085摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 35 卷
图 1摇 主成分分析的结果 (轴 1 和轴 2 分别代表了 19. 51% 和 14. 56% 的总变异)
Fig. 1摇 Principal component (PCA) analysis ( the axis 1 and 2 extracted 19. 51% and 14. 56% of the total genetic variance)
图 2摇 SplitsTree构建的 NJ树
Fig. 2摇 Unrooted neighbour joining tree produced by SplitsTree
表 5摇 都支杜鹃各种地理距离和居群遗传距离
Table 5摇 Genetic distance and geographical distance among populations of R. shanii
居群编号 population ID ZTJ YLP BMJ DYJ SBG
ZTJ ——— 19. 27 0. 88 1. 92 22. 29
YLP 0. 0405 ——— 18. 54 20. 91 3. 34
BMJ 0. 0158 0. 0535 ——— 2. 42 21. 54
DYJ 0. 0222 0. 0701 0. 0178 ——— 23. 83
SBG 0. 0479 0. 0558 0. 0506 0. 0693 ———
注: 上半部分为地理距离 (km), 下半部分为遗传距离
Note: Above diagonal is geographical distance (km), below diagonal is genetic distance
1855 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 赵摇 凯等: 都支杜鹃遗传多样性的 ISSR分析摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
图 3摇 都支杜鹃居群间的 Nei遗传距离聚类分析
Fig. 3摇 The UPGMA dendrogram of R. shanii based on Nei爷s genetic distance
3摇 讨论
通常认为特有种、 濒危种和狭域种的遗传多
样性水平较低 (Hamrick 和 Godt, 1996; Falk 和
Holsinger, 1991; 洪德元等, 1995), 也有研究认
为, 有些狭域、 濒危种也能保持较高水平的遗传
多样性 (Richter等, 1994)。 都支杜鹃是典型的
狭域种和濒危种 (赵凯, 2010; 2012), ISSR 研
究显示都支杜鹃具有较低的遗传多样性 (P、 H
和 I 值分别为 52. 17% 、 0. 1659 和 0. 2536, 表
3), 低于其他常绿杜鹃如云锦杜鹃 (R. fortunei
Lindl. , P、 I和 H值分别为 88. 24% 、 0. 4317 和
0. 2848) (金则新等, 2006 )、 鹿角杜鹃 ( R.
latoucheae Franch, P、 I和 H 值分别为 88. 07% 、
0. 4640、 0. 30998) (赵芯等, 2010) 和牛皮杜鹃
(R. aureum Gemerk, P 和 I 值分别为 87. 43%和
0. 4593) ( Liu 等, 2012), 也低于长果秤锤树
(Sinojackia dolichocarpa C. J. Qi)、 思茅木姜子
(Litsea szemaois (H. Liou) J. Li et H. W. Li)、
四合木 ( Tetraena mongolica Maxim. )、 黄山梅
(Kirengeshoma palmate Yatabe) 等狭域、 濒危种
( Ge 等, 2003; Qiu 等, 2004; Xue 和 Zhang,
2004; Cao等, 2005; Zhang等, 2006; 陈俊秋等,
2006; Feyissa 等, 2007; Jun 和 Jin, 2008; Shao
等, 2009)。 另外, 都支杜鹃的 Nei爷s 基因分化
系数 GST =0. 1845, 表明都支杜鹃的遗传变异主
要存在于居群内, 居群间分化不明显。 AMOVA
分析也表明都支杜鹃遗传变异中 88. 3%发生在
居群内, 11. 7% 发生在居群间。 主成分分析
(图 1) 和 Split Tree 构建的 NJ 树 (图 2) 显示
不同居群个体并没有单独聚在一起, 而是相互夹
杂在一起, 表明都支杜鹃主要遗传多样性存在于
居群内, 各居群间遗传相似度很高, 并没有出现
明显的遗传分化。 由此可见, 目前都支杜鹃的遗
传多样性较低, 低于同亚属其他物种和大多数狭
域、 濒危物种的遗传多样性, 但主要的遗传多样
性仍存在于居群内, 居群间分化不明显。
影响物种的遗传多样性和居群间遗传分化的
因素很多, 如居群历史、 繁育系统、 基因突变、
遗传漂变、 基因流以及自然选择等 (Schaal 等,
1998) 。 导致都支杜鹃遗传多样性低, 遗传分化
不明显的原因可能有: (1) 居群间存在较强的基
因流。 花粉和种子的扩散是植物自然居群中主要
的基因流 (李海生和陈桂珠, 2004)。 都支杜鹃
的花粉为四合花粉, 被一种线状的黏丝串连呈一
种线型结构, 有助于附着在昆虫身体上进行较远
距离的散布。 此外, 都支杜鹃种子边缘具膜质
翅, 且种子细小, 使得其种子也可以借助风力进
行远距离的传播 (胡琳贞和方明渊, 1994)。 都
支杜鹃居群间的基因流为 Nm = 2. 2104, 也表明
了居群间具有较强的基因流。 当 Nm>1 时, 基
因流可以抵消居群间因遗传漂变而引起的居群分
化 (Slatkin, 1985), 使居群间的遗传多样性趋
于一致。 (2) 多年生、 异交的生活史。 大量研究
表明, 长命、 异交植物的遗传多样性主要存在于
居群内 (Nybom 和 Bartich, 2000)。 虽然目前尚
无针对都支杜鹃繁育模式的研究, 但常绿杜鹃亚
属植物多为异交, 也存在异交为主兼并自交的复
合繁殖模式 ( Escaravage 等, 2001; 张敬丽等,
2007)。 因此, 这种多年生、 异交的生活特征也
可能是导致其遗传多样性主要存在于居群内的原
因之一。 (3) 生境的高度一致性。 都支杜鹃现仅
局限分布于大别山区极为狭窄区域内, 生态气候
285摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 35 卷
条件基本一致 (赵凯等, 2010; 2012)。 在小生
境上, 都支杜鹃的分布地点均集中于海拔 1 400 ~
1 800 m的山脊或靠近山脊的南坡上, 在群落中
均为建群种或为共建种, 主要的伴生种均为松科
和壳斗科的阳性树种, 这使得各居群在小生境上
环境条件也是高度相似。 生境的相似性使各居群
受到的自然选择压力也相似, 促使各居群相似的
基因型被保留下来 (Nevo, 2001)。
都支杜鹃是一种十分优良的观赏植物, 保护
好其野生遗传资源, 对于培育出栽培的新品种和
解决引种栽培问题具有重要意义。 物种的遗传多
样性及其遗传结构分析可以为珍稀濒危物种保护
策略及人工辅育和栽培利用措施的制定提供非常
重要的信息 (Hamrick和 Godt, 1996)。 野外调查
发现, 历史上曾有过多次针对该种的引种栽培尝
试, 但均以失败告终, 再加上都支杜鹃现有的遗
传多样性水平较低, 且遗传多样性主要存在于居
群内, 目前该种的保护仍应以就地保护为主, 尤
其要注意对少数大居群 (如 BMJ、 DYJ 和 YLP
居群, 植株数大于 100) 的保护, 因为它们几乎
代表了整个物种的遗传多样性 (图 2); 另外要
加强人工辅育繁殖和栽培实验的研究, 在取样策
略上可以采取在少数大居群中尽量多地采集种子
的方式进行, 以使人工居群尽可能多地保存野生
种群的遗传多样性。
也参摇 考摇 文摇 献页
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