全 文 ：绿绒蒿自然杂交种及其亲本 cpDNA trnL- trnF
基因的遗传学分析
?
袁长春1 , 何雪宝1 , 袁秋梅1 , 施苏华2
( 1 湛江师范学院生化学院 , 广东 湛江 524048; 2 中山大学生命科学学院基因工程
教育部重点实验室 , 广东 广州 510275)
摘要 : 对自然杂交种 Meconopsis× cookei 及其亲本红花绿绒蒿 M. punicea和五脉绿绒蒿 M. quintuplinervia 的叶
绿体 DNA trnL- trnF 区进行了序列测定 , 所得序列的长度为 957～961 bp, 其中 M. × cookei 的序列长度为 960
bp, 红花绿绒蒿为 961 bp, 五脉绿绒蒿为 957 bp。利用软件 Clustal X 对所得序列进行排序和碱基比较 , 排
序后的序列长度为 964 bp, 其中 trnL intron为 512 bp, trnL 3′exon为 50 bp, trnL- trnF intergenic spacer ( IGS) 为
361 bp, 还包括 41 bp的 trnF 5′端片段。整个 trnL- trnF 区序列共有 25 个变异位点 , 其中杂交种 M .× cookei
与红花绿绒蒿具有相同碱基的位点有 21 个 (占 84% ) , M.× cookei 与五脉绿绒蒿具有相同碱基的位点仅有
1 个 (占 4% ) , 余下 3 个位点 (占 12 % ) 中 , M. × cookei 的碱基与两个亲本均不相同。分析结果表明 , 杂
交种 M.× cookei 的叶绿体基因 trnL- trnF 来自红花绿绒蒿 , 根据质体细胞质遗传的规律 , 从而推测红花绿
绒蒿为该杂交种的母本 , 五脉绿绒蒿为其父本。
关键词 : 绿绒蒿杂交种 ; 红花绿绒蒿 ; 五脉绿绒蒿 ; trnL- trnF
中图分类号 : Q 943 文献标识码 : A 文章编号 : 0253 - 2700 (2007) 01 - 103 - 06
Genetic Relationship between a Natural Hybrid Meconopsis×
cookei (Papaveraceae) and Its Parents Based on cpDNA
trnL- trnF Region Sequence
YUAN Chang-Chun
1
, HE Xue-Bao
1
, YUAN Qiu-Mei
1
, SHI Su-Hua
2
(1 Life Scienceand Chemistry School , Zhanjiang Normal University, Zhanjiang 524048 , China; 2 Key Laboratory of Gene
Engineering of Ministry of Education, School of LifeSciences, Zhongshan University, Guangzhou 510275 , China)
Abstract: The Chloroplast DNA trnL- trnF region sequences from a natural hybrid species Meconopsis× cookei and its
parents M . punicea and M. quintuplinervia were obtained by using direct sequencing method . The sequence length of
trnL- trnF region is 960 bp for M.× cookei , 961 bp for M . punicea, and 957 bp for M . quintuplinervia . The sequences
werealigned by the software Clustal X , and then the bases per locus were compared by using the software with manual
method . Thealigned sequence length is 964 bp, of whichtrnL intron is 512 bp, the3′exonof trnL is 50 bp, trnL- trnF
intergenic spacer ( IGS) is361 bp, andthe5′end segment of trnF is 41 bp . Total 25 variable loci weredetectedfromthe
aligned sequence, of which21 (84% ) sites are samebetween M.× cookei and M. punicea, andonlyone (4 % ) is same
between M. × cookei and M. quintuplinervia, the remaining three loci (12% ) are different among M .× cookei , M. -
punicea , and M. quintuplinervia . The results show that the cpDNA trnL- trnF region of the natural hybrid species M. ×
cookei was inherited fromits parent M. punicea . Therefore, according to the plastid inheritance law, our molecular evi-
云 南 植 物 研 究 2007 , 29 (1) : 103～108
Acta Botanica Yunnanica

? ?基金项目 : 国家自然科学基金重点项目 ( 30070053) 、广东省自然科学基金 ( 04300850) 和湛江师范学院博士基金 (Z0313 )
收稿日期 : 2006 - 04 - 08 , 2006 - 08 - 20 接受发表
作者简介 : 袁长春 (1964 - ) 男 , 副教授 , 博士 , 主要从事植物分子进化与系统学方面的研究。
E-mail : yuancc@zhjnc. edu. cn; Tel : 0759 - 3183722
dences indicate that M . punicea is themother of hybrid species M. × cookei and M. quintuplinervia is its father .
Key words: Hybrid species Meconopsis× cookei ; M. punicea; M . quintuplinervia; trnL- trnF
绿绒蒿杂交种 Meconopsis× cookei G . Taylor 发
表于 1951 年 (Taylor , 1951) , 在分类学上属于罂
粟 科 ( Papaveraceae)、 绿 绒 蒿 属 ( Meconopsis
Vig .) , 为多年生草本植物 , 高 20～50 cm, 目前仅
见于中国青海省的局部地区 (Taylor, 1951; Cobb,
1989 )。因其茎、叶的形态特征与五脉绿绒蒿
( M. quintuplinervia Regel ) 相似 , 而花的形态结构
又类似于红花绿绒蒿 ( M. punicea Maxim .) , 但花
的颜色为紫红色 , 与红花绿绒蒿为深红色而有所
不同 , 所以 Taylor (1951) 认为它可能是五脉绿绒
蒿和红花绿绒蒿的自然杂交种。早期 , Andrew
Harley曾在英国德文郡 (Devonhall) 进行过引种栽
种 , 目前已极为少见 ( Cobb, 1989 )。袁长春等
(2004) 已利用分子生物学的方法证明 M.× cookei
是红花绿绒蒿和五脉绿绒蒿的杂交后代。
红花绿绒蒿为多年生草本植物。叶片倒披针
形或狭倒卵形; 花单生于基生花葶上 , 花瓣 4
(6) , 深红色 , 椭圆形; 蒴果椭圆状长圆形。产四
川西北部、西藏东北部、青海东南部和甘肃西南
部 , 生于海拔 2 800～4 300 m的山坡草地 (吴征镒
等 , 1999)。五脉绿绒蒿为绿绒篙属多年生草本植
物 , 叶片倒卵形至披针形; 花单生于基生花葶上 ,
花瓣 4～6, 倒卵形或近圆形 , 淡蓝色或紫色; 蒴
果椭圆形或长圆状椭圆形。产湖北西部 ( 神农
架 )、四川西北部、西藏东北部、青海东北部、甘
肃南部和陕西西部 , 生于海拔 2 300～4 600 m的阴
坡灌丛中或高山草地 (吴征镒等 , 1999)。
近年来 , 随着分子生物学的迅速发展 , 一些新
的方法 , 如同工酶、RFLP、SSR、DNA 测序等 , 被
用来研究和验证杂交种 ( Rauscher 等 , 2002; Soltis
等 , 1992; Quijada等 , 1997; Sang等 , 1995) , 特别
是 DNA 序列分析的方法 , 更能准确地反映出杂交
种和亲本之间的遗传关系。在以往的研究中 , 我们
已利用来自核基因组的 nrDNA ITS区序列分析的方
法证明绿绒蒿自然杂交种 M.× cookei 就是红花绿
绒蒿和五脉绿绒蒿的杂交后代 (袁长春等 , 2004) ,
但是 , 因为核基因属于双亲遗传 , 所以 , 究竟那个
是父本、那个是母本仍无法确定。叶绿体基因属于
细胞质基因 , 为绿色植物所特有 , 其遗传方式有别
于核基因的遗传方式 , 属于细胞质遗传 , 通常为母
系遗传方式 (胡适宜 , 1997; 奇文清等 , 1999)。早
期研究叶绿体基因的细胞质遗传主要采用遗传学
和细胞学的方法 (Neale等 , 1986; Hagemann and
Schroder, 1989) , 近年来 , 随着分子生物学技术
的发展 , 一些新的方法被采用 , 如酶切和限制性
片段 长 度多 态 性 ( RFLP ) 方法 等 ( 胡适 宜 ,
1997)。但是 , 最直接的方法是分析亲本和子代
在叶绿体基因上的变化 , 即叶绿体 DNA 序列分
析的方法 , 这种方法快速、准确、可靠 , 能准确
地反映出杂交种和亲本之间的遗传关系 , 且不受
生长季节的限制 , 目前有关这方面研究的报道甚
少。本研究选择进化速率较快的叶绿体 DNA
trnL- trnF基因作为分子标记 , 进行 cpDNA 序列
分析 , 旨在探讨杂交种 M. × cookei 与其亲本之
间在叶绿体基因上的变化特点和规律 , 来分析它
们之间的遗传关系 , 并确定其父本和母本。
1 材料和方法
1 .1 实验材料
用于提取总 DNA 的杂交种 M. × cookei 的植物叶片
采自英国爱丁堡皇家植物园标本馆收藏的腊叶标本 , 该
标本由 D . G . Long于 1997 年采自青海省果洛藏族自治
州玛沁县 , 另外两种材料分别采自中国四川马尔康鹧鸪
山和英国爱丁堡皇家植物园栽种植株 , 新鲜叶片采集后
经硅胶干燥备用 , 每种材料均采集相应的凭证标本 , 材
料的详细来源及凭证标本号见表 1。
表 1 材料来源及凭证标本
Table 1 Source and voucher of materials
材料名称 采集地 采集人?时间 凭证标本 GenBank 登录号
Sample name Locality Collector?date Voucher GenBank Accession No .
杂交种 M ?.× cookei 青海省果洛 Guoluo, Qinghai D v.G. Long et al?1997 .07 W. 10 00137066 ( E ) AY328231 +
五脉绿绒蒿 英国爱丁堡皇家植物园 Royal C r.C ?.Yuan?2002 :. 07 .01 200271107 (SYS) AY328239 +
M ?. quintuplinervia Botanic Garden Edinburgh of UK
红花绿绒蒿 M ?. punicea 四川马尔康 Maerkang, Sichuan C r.C .Yuan?2000 :. 07 .02 2000711 ( SYS) AY328238 +
02 云 南 植 物 研 究 29 卷
1 .2 实验方法
1 .2 .1 总 DNA 提取与纯化 总 DNA 的提取采用 CTAB 法
(Doyle and Doyle, 1987 ) , 并作 适当调 整 ( 施苏 华等 ,
1996) , 具体步骤如下 : 取干燥后的叶片约 0.5 g, 置于干
净的研钵中 , 加液氮充分研磨成粉末 , 近等量地分装于 4
个 1 .5 mL 的离心管中 , 各加入 1 mL 含 0 .2% β-巯基乙醇的
2×CTAB 提取液 , 充分摇匀 , 60℃保温 1 h; 10 000 r?min离
心 5 min, 弃沉淀 , 取上清液移至新管 ; 加 700μL 氯仿 -
异戊醇 (v∶v= 24∶1 ) 混合液 , 摇匀 , 10 000 r?min离心 5
min, 弃沉淀 , 再重复抽提 1 次 ; 10 000 r?min离心 10 min,
弃沉淀 , 取上清液 , 加 1?10 体积的 3 mol?L NaAC ( 4℃) ,
再加异丙醇 (4℃ ) 至满管 , 将离心管轻轻翻转几次 , -
20℃放置 2 h以上 ; 10 000 r?min离心 5 min, 弃上清液 , 沉
淀用 70%乙醇洗脱 2 次 , 再用无水乙醇洗脱一次 , 晾干 ,
加 50～100μL 1×TE 溶液溶解 , - 20℃保存。
DNA 的纯化采用玻璃粉纯化系统 (DPS) 并按以下
步骤进行 : 取 50μL DNA 1×TE 溶液加入 3 倍体积的 6
mol?L NaI 和 3μL 玻璃粉 1×TE 溶液 , 混匀 , 8 000 rpm离
心 2 min; 弃上清液 , 加洗脱液 [含 0 .2 mol?L NaCl , 10
mmol?L Tris-HCl ( pH8 .0 ) , 1 mmol?L EDTA , 50% ( v?v)
Ethanol] 100μL , 混匀 , 8 000 r?min 离心 2 min, 弃上清
液 , 重复洗脱 3 次 , 晾干 ; 加 50μL 1×TE 溶液 , 50℃保
温 15～ 20 min, 至沉淀完全溶解 , 10 000 r?min 离心 10
min, 弃沉淀 , 将上清液移至新管 , - 20℃保存备用。
1 .2 .2 PCR 扩增与测序 采用人工合成的通用引物 c (5′-
CGAAATCGGTAGACGCTACG -3′) 和 f ( 5′-ATTTGAACTGGT-
GACACGAG-3″) , 按如下程序进行 PCR 扩增 : 94℃ 4 min;
94℃ 1 min, 58℃ 2 min, 72℃ 2 min, 30 个循环 ; 72℃ 6
min。PCR 产物用 QIAGEN公司的 PCR 纯化试剂盒进行纯
化 , 然后采用 ABI 3700 型自动测序仪进行测序 , 测序引
物为 c (序列同上 )、f (序列同上)、d (5′-GGGGATAGAGG-
GACTTGAAC-3′)、 e ( 5′-GGTTCAAGTCCCTC TATCCC -3′) ,
以上引物的序列来源于 Taberlet 等 (1991) 的文献。
1 .2 .3 序列拼接与排序 序列的编辑和拼接用 SeqmanTMⅡ
(DNASTAR Inc .) 软件完成 , 并借助软件 Chromas2.0 进行
人工校对 , trnL- trnF区序列 [包括 trnL intron、 trnL 3′ex-
on、 trnL- trnF intergenic spacer (IGS) 和 trnF] 的边界根据
GenBank中的近缘种序列进行确定 , 所有序列均输送到
GenBank, 其登录号见表 1。序列的排序采用 Clustal X 1 .81
软件 (Thompson等 , 1997) 进行 , 并进行手工校对。
2 结果
2 .1 序列长度及碱基组成
所测样品的 trnL- trnF 序列长度 ( 含 trnL in-
tron、 trnL 3′exon、 IGS、 trnF 5′端部分序列 ) 为
957～961 bp, 其中杂交种 M. × cookei 为 960 bp,
红花绿绒蒿为 961 bp, 五脉绿绒蒿为 957 bp。在
trnL intron区 , 红花绿绒蒿和 M.× cookei 的长度
均为 512 bp, 五脉绿绒蒿为 510 bp; 在 trnL 3′ex-
on区 , 红花绿绒蒿和 M.× cookei 的长度均为 50
bp, 五脉绿绒蒿为 49 bp; 在 IGS 区 , 红花绿绒
蒿和 M.× cookei 长度均为 358 bp, 五脉绿绒蒿为
357 bp; 在 trnF 片段中 , 红花绿绒蒿和五脉绿绒
蒿长度均为 41 bp, M. × cookei 为 40 bp。排序后
的 trnL- trnF 序列长度为 964 bp, 其中 trnL intron
为 512 bp, trnL 3′exon 为 50 bp, IGS 为 361 bp,
还包括 41 bp的 trnF 5′端序列。各个样品的详细
序列组成见图 1。
2 .2 变异位点及其碱基类型
在整个 trnL- trnF 区序列中 , 3 个样品之间
共有 25 个变异位点 (同一位点上所有样品的碱
基类型不完全相同 , 图 1 ) , 占整个序列长度的
2 .59%。其中有 11 个变异位点属于碱基插入或
缺失 ( insertion-deletion) 类型 , 占变异位点总数
的 44% , 占整个序列长度的 1 .14%。在这 11 个
位点 中 , trnL intron 区 有 2 个 ( 占 18 .18% ) ,
trnL 3′exon中有 1 个 (占 9 .09% ) , IGS 区有 7 个
( 占 63 .64% ) , trnF 中有 1 个 ( 占 9 .09% ) 。在这
些插入或缺失类型的变异位点中 , 杂交种 M. ×
cookei 与亲本红花绿绒蒿在其中 10 个位点上具
有相同的碱基缺失或插入 ( 占 90 .91% ) , 其中
没有一个位点与另一亲本五脉绿绒蒿具有相同的
碱基缺失或插入 , 余下 1 个位点上与两个亲本都
不同 ( 占 9 .09% ) (表 2)。
另外 , 有 14 个变异位点属于碱基替换类型 ,
占整个变异位点总数的 56% , 占整个序列长度
的 1 .45% , 其 中 , trnL intron 区 有 8 个 ( 占
57 .14% ) , IGS 区有 6 个 ( 占 42 .86% )。在这 14
个变异位点中 , 杂交种 M. × cookei 与亲本红花
绿绒蒿在其中 11 个位点上具有相同的碱基类型
(占 78 .57% ) , 仅仅在其中 1 个位点与另一亲本
五脉绿绒蒿具有相同的碱基类型 ( 占 7 .14% ) ,
余下的 2 个 位 点上 与 两 个 亲本 都 不 同 ( 占
14 .29% ) (表 3) 。
综合表 2 和表 3 的结果 , 在 25 个变异位点
中 , trnL intron 区有 10 个 , 占变异位点总数的
40% , trnL 3′exon和 trnF 片段中各有 1 个 , 各占
变异位点总数的 4% , IGS 区有 13 个 , 占变异位
121 期 袁长春等 : 绿绒蒿自然杂交种及其亲本 cpDNA trnL- trnF基因的遗传学分析
点总数的 52%。同时 , 在全部 25 个变异位点中 ,
杂交种 M.× cookei 与亲本红花绿绒蒿在其中 21
个位点 ( 占 84% ) 上具有一致的碱基 , 仅仅在
其中 1 个位点 (占 4% ) 上与五脉绿绒蒿具有相
同的碱基类型 , 余下 3 个位点 ( 占 12% ) 上与
两个亲本均不相同。
3 讨论
植物细胞质遗传涉及细胞质中的含有 DNA
两种细胞器从亲代到子代的传递 , 即线粒体和质
体的遗传 , 相对来说 , 线粒体遗传的研究远不及
质体的多 , 这可能是线粒体这种细胞器缺乏合
适的表型突变体之故 (胡适宜 , 1997)。早期对质
图 1 所测样品的 trnL- trnF 区完整序列 MP: 红花绿绒蒿 ; MC: 杂交种 M.× cookei ; MQ: 五脉绿绒蒿
Fig . 1 The full sequences of trnL- trnF region of three samples
MP : Meconopsis punicea; MC : M. × cookei ; MQ: M. quintuplinervia . The numbers on the right indicate the length ( bp) of the sequences .
22 云 南 植 物 研 究 29 卷
表 2 trnL- trnF 区变异位点 (插入或缺失 ) 及碱基类型
Table 2 Thevariable loci ( insertion-deletion) and base types of trnL- trnF region sequences
样品 Sample
位点编号及碱基类型 Locus number and base type
trnL intron 3 ?′exon trnL- trnF IGS trnF
100 o331 ?537 ?604 605 606 607 796 797 798 936
红花绿绒蒿 M ?. punicea T A T A T A T - - - T
M ?.× cookei T A T A T A T - - - -
五脉绿绒蒿 M ?. quintuplinervia - - - - - - - A A A C
表 3 trnL- trnF 区变异位点 (碱基替换 ) 及碱基类型
Table 2 The variable loci ( base substitution) and base types of trnL- trnF region sequences
样品 Sample
位点编号及碱基类型 Locus number and base type
trnL intron trnL- trnF IGS
2 6142 E193 /239 ?314 347 373 385 571 &574 608 634 732 813
红花绿绒蒿 M ?. punicea T G C A A G A T G G G C G C
M ?.× cookei T C C A T G A T A G G C G C
五脉绿绒蒿 M ?. quintuplinervia G G G G A A T G A T A A A A
体基因组突变性状遗传分析的研究表明 , 在被子
植物中存在双亲质体遗传和单亲母系质体遗传两
种类型 , 而后一种占大多数 , 仅少数是比较有规
律的双亲质体遗传或偶尔是双亲质体遗传 (Gill-
harm, 1978; Tileny-Bassett, 1978; Smith, 1988;
胡适宜 , 1997 )。上个世纪 80 年代分子生物学技
术引入到细胞器 DNA 传递的研究中 , 发现在高
等植物中除了上述两种质体遗传类型外 , 还存在
单亲父系质体遗传的形式 , Neale等 ( 1986 ) 利
用 RFLP 方法首先在裸子植物中发现存在质体父
系遗传方式 , 已证明父系质体遗传在裸子植物中
较为 普遍 ( Hagemann, 1992; 胡 适 宜 , 1997 ) ,
但在被子植物中只少数具有这种遗传方式 , 迄今
只在紫苜蓿 ( Medicago savita)、胡萝卜属 ( Dau-
cus) 和牵牛属 ( Pharbitis) 提供了父系质体遗传
的证 据 ( Schumann and Hancock, 1989; Boblenz
等 , 1990; 胡赞民等 , 1996 )。
从植物细胞质遗传的规律以及有性生殖的特
点可知 , 当两个亲本杂交时 , 如果是母系遗传 ,
母本对子代具有决定性的作用 , 这是因为通常母
本的配子细胞大 , 含有大量的细胞质 , 而父本的
配子细胞很小 , 往往只含有极少量的细胞质 , 根
据超微结构的观察 , 在一些植物中证明了配子融
合时 精 细胞 的 细 胞 质被 排 除 在卵 细 胞 之 外
(Mogensen, 1988; 胡适宜 , 1997 )。因为大多数
被子植物的叶绿体的遗传方式为单亲母系遗传 ,
即子代的叶绿体基因来源于母本。因此 , 在已确
定一个杂交种的两个亲本的情况下 , 可以利用叶
绿体基因的遗传特点来判断杂交种的母本是谁、
父本是谁 , 同时 , 也可以反过来利用叶绿体基因
的遗传特点来帮助确定杂交种的亲本以及研究植
物的细胞质遗传规律。
本研究所选择叶绿体 DNA trnL- trnF 分子标
记 , 在进化上具有选择压力小和进化速率较快的
特点 , 较为适合种间杂交的质体遗传分析。比较
排序后杂交种 M. × cookei 及其亲本的 trnL- trnF
区序列 , 共有 25 个变异位点 , 其中杂交种 M.×
cookei 与亲本红花绿绒蒿在其中 21 个位点上彼
此的碱基构成一致 , 占整个变异位数的 84% ;
而该杂交种与另一亲本五脉绿绒蒿仅在一个位点
上彼此的碱基相同 , 仅占整个变异位 点数的
4% , 因而可以推测杂交种 M. × cookei 的叶绿体
基因 trnL- trnF 来自亲本红花绿绒蒿。另外 , 从
表 3 中可以看出 , 在第 142 和第 314 两个位点上
M.× cookei 的碱基与两个亲本均不同 , 第 571 个
位点上 M.× cookei 的碱基与红花绿绒蒿的碱基
不同 , 这可能是因为经历了较长时间的繁衍 , 而
第 142 和第 314 两个位点所处的 trnL intron区及
第 571 个位点所处的 trnL- trnF IGS 区属于非编码
区 , 具有较小的选择压力 , 进化速率较快 , 加上
分布地点和生境的不同 , 因而杂交种 M.× cookei
在演化过程中发生碱基替换 , 即第 142 位上的碱
基 G突变为 C , 第 314 位上的碱基 A 突变为 T,
第 571 位上的碱基 G 突变为 A。同样的理由 , 第
936 个位点上 M.× cookei 缺失一个碱基 T。
综上所述 , 杂交种 M. × cookei 的叶绿体基
321 期 袁长春等 : 绿绒蒿自然杂交种及其亲本 cpDNA trnL- trnF基因的遗传学分析
因来自亲本红花绿绒蒿 , 根据被子植物叶绿体基
因组的母系遗传的特点 , 推测红花绿绒蒿为杂交
种 M.× cookei 的母本 , 五脉绿绒蒿为其父本。
致谢 英国爱丁堡皇家植物园提供部分实验材料 , 美国
哈佛大学 David Boufford博士和 Anthony Brach博士提供原
始文献方面的帮助。
〔参 考 文 献〕
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