全 文 ：热胁迫下中甸角蒿叶片 SSH文库的构建及初步分析*
丁摇 勇1,2, 常摇 玮1**, 张石宝1, 胡摇 虹1***
(1 中国科学院昆明植物研究所资源植物与生物技术实验室, 云南 昆明摇 650201;
2 西南林业大学生命科学学院, 云南 昆明摇 650224)
摘要: 高温可能是限制中甸角蒿 ( Incarvillea zhongdiannensis) 向低海拔地区引种驯化的主要因素之一。 为
了从基因表达水平研究中甸角蒿高温胁迫响应的分子机制, 本研究利用 SSH 技术构建了中甸角蒿对高温
(30益) 处理响应的正反向抑制性差减杂交文库。 文库质量检测表明抑制性差减杂交效率较高, 质量较
好。 通过对正反向文库中部分 EST进行序列测定, 获得了 60 条高质量的表达序列标签, 平均长度为 537
bp。 对序列进行 BLAST比对及功能注释, 50 条 EST为功能已知的基因, 分别参与信号转导与转录、 植物
抗逆性反应、 光合作用、 代谢与能量、 蛋白质合成与转运、 蛋白质命运、 细胞结构和细胞生长等过程。 6
个 EST与功能未知基因的同源性较高。 获得的 4 个未匹配的 EST 推测为新基因, 可能在植物热耐受性方
面具有重要的作用。
关键词: 中甸角蒿; 高温胁迫; 抑制差减杂交; 表达序列标签
中图分类号: Q 78, Q 945摇 摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 摇 摇 文章编号: 2095-0845(2012)01-047-09
Construction of Leave Library by SSH and Preliminary
Analysis of Genes Responsible for Heat Sress in
Incarvillea zhongdiannensis
DING Yong1,2, CHANG Wei1**, ZHANG Shi鄄Bao1, HU Hong1***
(1 Key Laboratory of Economic Plants and Biotechnology, Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences,
Kunming 650201, China; 2 School of Life Sciences, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China)
Abstract: High temperature might be one of the main limiting factors to be introduced and domesticated into lower
altitude for Incarvillea zhongdiannensis. To further reveal the underlying molecular mechanism in I. zhongdiannensis
responding to high temperature, the suppression subtractive hybridization approach (SSH) was used in this study.
The results showed the quality of forward or reverse subtraction cDNA library is good enough for further SSH experi鄄
ments. Total sixty expressed tags (ESTs) with high quality were randomly obtained by SSH and sequencing. Ac鄄
cording to BLAST screening and functional annotation, 50 ESTs with known function were classified into 9 broad cat鄄
egories such as defense / stress, photosynthesis, metabolism, energy, signal transduction and transcription, protein
fate, transporter, biosynthesis, cell structure and cell growth. There were six ESTs significantly matched with hypo鄄
thetical proteins. Four ESTs with no hits possibly encode novel genes and play important role in I. zhongdiannensis
responding to high temperature stress.
Key words: Incarvillea zhongdiannensis; High temperature stress; Suppression subtractive hybridization ( SSH);
Expressed sequence tag (EST)
植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 2012, 34 (1): 47 ~ 55
Plant Diversity and Resources摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 DOI: 10. 3724 / SP. J. 1143. 2012. 11143
*
**
***
基金项目: 国家自然科学基金 (30870239); 中科院昆明植物研究所资源植物与生物技术实验室青年科研项目
与第一作者同等贡献
通讯作者: Author for correspondence; E鄄mail: Huhong@ mail. kib. ac. cn
收稿日期: 2011-10-17, 2011-12-01 接受发表
作者简介: 丁摇 勇 (1979-) 男, 讲师, 主要从事植物分子生物学方面的研究。
摇 云南具有园艺学界公认的丰富的野生花卉
种质资源。 高山花卉作为野生花卉中的奇葩, 具
有花色艳丽, 花朵奇特等特色, 是云南野生花卉
中最具特色和开发潜力的种质资源, 它们主要分
布于滇西北海拔 2 500 m以上的高山地区 (冯国
楣, 1981)。 其中紫葳科 ( Bignoniaceae) 角蒿
( Incarvillea) 植物就是一类极具观赏价值的高山
花卉, 花大而颜色艳丽, 它们主要分布于西亚和
东亚, 中国产 11 种 3 变种, 滇西北产 8 种 (王
文采等, 1990)。 中甸角蒿 ( Incarvillea zhongdi鄄
annensis Rrey鄄willson) 为我国特有种, 生长在滇
西北 (中甸) 海拔 3 100 ~ 3 500 m的云杉林边或
高山流石滩, 不仅具较高的园艺价值, 其块根还
具多种药用价值 (杜有新等, 2003)。 研究表明
中甸角蒿能在 15 ~ 26益下良好生长 (张石宝等,
2005), 但向低海拔地区引种栽培存在一定的困
难。 根据已经开展的研究 (蔡艳飞等, 2008; 雷
鸣等, 2009; 席雪等, 2010), 推测高温可能是限
制中甸角蒿向低海拔地区引种栽培的主要因素,
但仍缺乏相应的分子机制研究。 抑制差减杂交
(suppression subtractive hybridization, SSH) 技术
(Diatachenko等, 1996) 通过两次差减杂交和两
次抑制性 PCR, 使差异基因得到富集和均匀化,
与 RDA 和 DDRT鄄PCR 等方法相比具有灵敏性
高、 操作简单、 假阳性率低、 速度快和效率高等
特点。 利用 SSH 技术, 黄锦文等 (2009) 构建
了沟叶结缕草 (Zoysia matrella) 对高温处理响
应的正向差减文库, 对热诱导产生的差异表达基
因进行了分析。 Zhang 等 (2005) 探讨了热耐受
型羊茅草 (fescue) 和热敏感型羊茅草之间差异
表达基因, 结果表明与光合作用、 蛋白质合成、
信号转导和转录因子等相关基因在热耐受型羊茅
草中上调表达, 与代谢和胁迫相关基因在热敏感
型羊茅草中上调表达。 本研究利用 SSH 技术构
建了高温胁迫下中甸角蒿正反向 SSH 文库, 并
对文库进行初步分析, 旨在了解高温对中甸角蒿
基因表达模式的影响, 以及这些基因表达与引种
驯化过程中生理变化的相关性。
1摇 材料与方法
1. 1摇 材料及其处理
从云南香格里拉收获野生中甸角蒿种子, 2010 年 9
月 23 日播种于 6 个 50 孔育苗盘内, 播种基质配比为腐叶
土 颐 河沙 颐 红土 颐 珍珠岩 (2 颐 3 颐 2 颐 3, V 颐 V 颐 V 颐 V)。
其中随机 3 盘置于人工气候箱 (RXZ / PQX鄄380D) 中,
适温 (20 依 1)益, 相对湿度 60% , 光照强度约为 600
滋mol·m-2·s-1, 每天光照培养 12 h, 暗培养 12 h; 另 3
盘置于另一同型号人工气候箱中, 高温 (30依1)益, 其
他条件同上。 一周后两个温度处理的中甸角蒿种子均萌
发, 每孔保留 2 ~ 3 颗幼苗。 2010 年 11 月 19 日, 分别随
机选取两个温度处理的中甸角蒿叶片, 于液氮速冻, 置
于-80益冰箱备用。
1. 2摇 中甸角蒿叶片总 RNA提取与mRNA的分离与纯化
采用 TRIzol ( Invitrogen) 法提取中甸角蒿叶片总
RNA。 总 RNA溶于 DEPC鄄H2O, 用 Dnase玉 (Invitrogen)
37益处理 30 min, 去除 DNA 的干扰。 1. 2%琼脂糖凝胶
甲醛变性电泳检测总 RNA 完整性, 紫外分光光度计
(LibraS22) 测定其浓度及纯度。 利用 FastTrack襆 MAG
mRNA Isolation Kits ( invitrogen) 分离 mRNA, 作为构建
SSH cDNA文库的起始材料。
1. 3摇 SSH cDNA文库的构建
依照 PCR鄄SelectTM cDNA Subtraction Kit ( Clontech)
的说明书进行 SSH操作。 以高温处理的中甸角蒿叶片为
Tester、 适温处理的中甸角蒿叶片为 Driver, 构建正向
SSH文库; 以适温处理的中甸角蒿叶片为 Tester、 高温
处理的中甸角蒿叶片为 Driver, 构建反向 SSH 文库。 正
反向 SSH产物经过纯化后分别与 pMD18鄄T Simple Vector
(TaKaRa) 连接, 热激法转化大肠杆菌 DH5琢 感受态细
胞 (TaKaRa), 涂于含有 Amp / IPTG / X鄄gal 的 LB 培养基
上进行筛选, 挑取白色克隆 37益震荡培养过夜, 加甘油
至终浓度 15% , -80益保存。
1. 4摇 文库插入片段大小检查、 序列测定和 BLAST分析
从上述构建的 SSH 文库中随机取单克隆菌液 1 滋L
为模板, 利用 M13 引物进行 PCR 扩增, 检测文库插入
片段大小。 PCR 反应体系: 10 伊 PCR Buffer 2 滋L, 10
mmol·L-1的 dNTPs 0. 5 滋L, 20 滋mol·L-1的上、 下游引
物各 0. 5 滋L, 5 U·滋L-1的DNA Polymerase 0. 3 滋L, ddH2O
补足 20 滋L。 PCR反应程序为: 94益预变性 4 min; 94益
变性 30 sec, 56益退火 30 sec, 72益延伸 3 min, 30 个循
环; 最后 72益延伸 10 min。 取 10 滋L 扩增产物用含 EB
的 1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测插入片段大小。 挑选阳性
克隆送上海英俊生物工程有限公司进行测序, 所获序列
去掉载体和接头序列, 获得 EST。 采用 NCBI 网站的
BLAST工具进行序列比对和功能注释分析。
2摇 结果与分析
2. 1摇 总 RNA的提取与 mRNA的纯化
RNA的纯度和完整性是 SSH文库构建成功的
84摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 34 卷
关键性因素, 本实验提取适温和高温处理的中甸
角蒿叶片总 RNA 的 A260 / A280 nm 值分别为 1. 92
和 1. 89, A260 / A230 nm 值分别为 2. 35 和 2. 34。
电泳结果显示总 RNA中的 28S rRNA与 18S rRNA
的亮度比例约为 2 颐 1 (图 1)。 表明本实验分离得
到的中甸角蒿叶片总 RNA 的纯度和完整性较好,
总 RNA质量达到建库要求, 可进一步用于分离
mRNA。 分离的 mRNA 经电泳检测呈均匀的弥散
带 (图 2), 主要集中在 400 ~ 4 000 bp 之间。 表
明 mRNA质量较好, 可以用于 SSH文库构建。
2. 2摇 双链 cDNA的合成和 Rsa玉酶切
以适温和高温处理的中甸角蒿叶片 mRNA
分别为模板, 利用 AMV 反转录酶合成 cDNA 第
一链。 经 1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测, 结果显示
利用双链合成酶合成的双链 cDNA 条带呈弥散
状, 主要分布在 500 ~ 5 000 bp内, Rsa玉酶切后
的双链 cDNA 片段集中在 400 ~ 1 000 bp 左右
(图 3)。 表明双链 cDNA 的质量和 Rsa玉酶切效
果均达到要求。
2. 3摇 SSH cDNA文库的质量检测
经过两轮消减杂交和两次抑制 PCR, 一些差
异表达的基因得到了富集。 杂交后的 cDNA 以通
用引物 primer 1进行第一轮 PCR扩增, 以巢式引
物对进行第二轮 PCR扩增。 经检测, 第二轮 PCR
产物比第一轮 PCR产物电泳条带减弱、 特异性增
强、 分布范围下移, 片段大小主要集中在 300 ~
1 000 bp, 且主要集中在 600 bp 左右 (图 4)。 说
明连接效率较好, 抑制差减杂交效率较高。
图 1摇 中甸角蒿叶片总 RNA的电泳检测
M: 1 kb Plus DNA分子量标准; A: 20益处理的中甸角蒿
叶片总 RNA; B: 30益处理的中甸角蒿叶片总 RNA
Fig. 1摇 Detection of total RNA isolated from leaves
of Incarvillea zhongdiannensis
M: 1 kb Plus DNA Ladder; A: Total RNA extracted from leaves
at 20益; B: Total RNA extracted from leaves at 30益
图 2摇 mRNA的电泳检测
M: 1 kb Plus DNA分子量标准; A: 20益处理的中甸角蒿
叶片 mRNA; B: 30益处理的中甸角蒿叶片 mRNA
Fig. 2摇 Detection of mRNA isolated from
摇 摇 摇 Incarvillea zhongdiannensis leaves
M: 1 kb Plus DNA Ladder; A: mRNA extracted from leaves
at 20益; B: mRNA extracted from leaves at 30益
图 3摇 Rsa玉酶切前后双链 cDNA的电泳检测
M: 1 kb Plus DNA分子量标准; A和 C分别为 20益和 30益
处理的 Rsa玉酶切前双链 cDNA; B和 D分别为 20益
和 30益处理的 Rsa玉酶切后双链 cDNA产物
Fig. 3摇 Electrophoresis analysis of ds cDNA before
and after Rsa玉digestion
M: 1 kb Plus DNA Ladder; A and C: Ds cDNA before
Rsa玉digestion at 20益 and 30益; B and D: Ds cDNA
after Rsa玉digestion at 20益 and 30益
图 4摇 两轮 PCR扩增结果
M: 1 kb Plus DNA分子量标准; A和 B分别为反向和正向消减
cDNA第一轮 PCR产物; C和 D分别为反向和正向消减 cDNA
第二轮 PCR产物; CK为根据试剂盒操作的阳性对照
Fig. 4摇 Results of first and second PCR amplification
for hybridization products
M: 1 kb Plus DNA Ladder; A and B: the first PCR amplification
produces of reward and forward subtracted experimental cDNA;
C and D: the second PCR amplification produces of reward
and forward subtracted experimental cDNA; CK: positive
control PCR amplification produces
941 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 丁摇 勇等: 热胁迫下中甸角蒿叶片 SSH文库的构建及初步分析摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
2. 4摇 差异表达 cDNA的 PCR产物检测
差减后的二次 PCR产物经纯化与载体连接,
转化大肠杆菌 DH5琢 感受态细胞, 经蓝白斑筛
选, 正、 反向文库分别共获得 2 320 和 3 000 个
阳性克隆, 文库重组率均为 93% 。 从构建的正、
反向抑制差减 cDNA 文库中随机挑选阳性克隆,
以 M13 通用引物进行 PCR检测, 结果 93%的克
隆均能扩增出有效产物, 其大小为 300 ~ 1 000
bp, 多数在 650 bp 左右, 除去引物与所加接头
的长度, 实际插入差异表达 cDNA 片段大小在
500 bp左右 (图 5, 6)。
2. 5摇 差异表达 EST测序分析
2. 5. 1摇 正向 SSH文库 EST序列的功能分析摇 从
正向 SSH鄄cDNA 文库中随机挑取 30 个阳性克隆
进行测序, 获得 30 条非冗余 EST, 最短的为 154
bp, 最长的为 970 bp, 片段平均长度为 566 bp。
利用 BLASTx同 GenBank的非冗余蛋白质数据库
进行同源性比对, 按照注释的功能及序列来源进
行分类, 部分同源比较结果见表 1。 分析结果表
明, 22 条 EST 与已知功能蛋白的同源性较高,
占全部 EST的 73. 34% ; 4 条 EST 与未知功能蛋
白同源性较高, 占全部 EST 的 13. 33% ; 另有 4
条 (13. 33% ) 未获得同源性匹配, 推测为新基
因。 在功能已知的序列中, 参与代谢相关的基因
有 6 条, 占 20% ; 参与光合作用和抗逆性相关
的基因各有 5 条, 均占 16. 67% ; 参与信号转导
与转录相关的基因有 2 条, 占 6. 67% ; 参与能
量、 蛋白质转运、 蛋白质命运、 及细胞结构与生
长相关的基因各 1 条, 均占 3. 33% (图 7)。
2. 5. 2摇 反向 SSH文库 EST序列的功能分析摇 从
反向 SSH鄄cDNA 文库中随机挑取 30 个阳性克隆
进行测序, 获得 30 条非冗余 EST, 最短的为 209
bp, 最长的为 961 bp, 片段平均长度为 509 bp。
利用 blastx同 GenBank的非冗余蛋白质数据库进
行同源性比对, 按照注释的功能及序列来源进行
分类, 部分同源比较结果见表 2。 分析结果表
明, 28 条 EST 与已知功能蛋白同源性较高, 占
全部 EST的 93. 33% ; 另外 2 条 EST与未知功能
蛋白同源性较高, 占全部 EST 的 6. 67% 。 在功
能已知的序列中, 参与光合作用相关的基因有 9
条, 占 30% ; 参与代谢相关的基因有 8 条, 占
26. 67% ; 参与信号转导和蛋白质合成相关的基
因各有 3 条, 均占 10. 00% ; 参与抗逆性相关的
基因有 2 条, 占 6. 67% ; 参与能量、 蛋白质转运、
及蛋白质命运相关的基因各 1 条, 均占 3. 33%
(图 7)。
图 5摇 正向差减 cDNA文库插入片段的检测摇 摇 MW: 1 kb Plus DNA分子量标准; 1 ~ 24: 随机挑取的克隆
Fig. 5摇 Identification of inserted fragments of the forward subtracted cDNA library
MW: 1 kb Plus DNA Ladder; 1-24: Randomly picked clones
图 6摇 反向差减 cDNA文库插入片段的检测摇 摇 MW: 1 kb Plus DNA分子量标准; 1 ~ 24: 随机挑取的克隆
Fig. 6摇 Identification of inserted fragments of the reward subtracted cDNA library
MW: 1 kb Plus DNA Ladder; 1-24: Randomly picked clones
05摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 34 卷
表 1摇 正向 SSH鄄cDNA文库部分 EST与 GenBank功能已知基因同源性比较
Table 1摇 Similarlity anaylsis of a part of forward SSH鄄cDNA library EST with the function identidied genes in GenBank
克隆编号
Sample
No.
长度
Length
/ bp
摇 摇 同源基因片段编码的蛋白
摇 摇 Gene homology 种属 Organism
GenBank序列号
Accession No.
一致性
Identity
/ %
E值
E鄄value
光合作用 Photosynthesis
F19 370 Ribulose鄄1, 5鄄bisphosphate carboxylase /oxygenase activase Oryza sativa ABG22613. 1 97 1e鄄59
F140 485 Chloroplast photosystem II 5 kDa precu鄄rsor protein Picrorhiza kurrooa ACI15739. 1 75 2e鄄13
F35 344 Chlorophyll a鄄b binding protein Oryza sativa ABR26169. 1 96 2e鄄75
F332 706 Chlorophyll A鄄B binding protein Oryza sativa ABG22426. 1 93 8e鄄116
F122 865 Chlorophyll a / b鄄binding protein Vitis vinifera AAP69815. 1 96 6e鄄51
代谢 Metabolism
F3 318 NADH鄄dependent hydroxypyruvate redu鄄ctase Pachysandra terminalis ABD97861. 1 86 5e鄄48
F300 473 Phospholipase A鄄2鄄activating protein Ricinus communis XP_002519096. 1 82 1e鄄85
F609 552 2鄄deoxyglucose鄄6鄄phosphate phosphatase Ricinus communis XP_002511268. 1 83 3e鄄78
F46 752 5鄄phosphoribosyl鄄1鄄pyrophosphate amid鄄otransferase Nicotiana tabacum AAR06289. 1 90 3e鄄73
F5 154 Lipoxygenase 3 Actinidia deliciosa ABF60000. 1 82 5e鄄22
F34 601 MPBQ / MSBQ methyltransferase Populus trichocarpa XP_002300813. 1 82 3e鄄95
信号转导与转录 Signal transduction and transcription
F241 376 Serine鄄threonine kinase Persea americana ABY58262. 1 87 9e鄄67
F85 157 Retrotransposon protein Oryza sativa ABR26094. 1 97 6e鄄12
蛋白质命运 Protein fate
F615 440 Ubiquitin鄄conjugating enzyme UBC2 Mesembryanthemumcrystallinum AAD51109. 1 98 8e鄄90
蛋白质转运 Transporter
F199 459 Adenylate translocator Arabidopsis thaliana BAD94561. 1 82 1e鄄21
防御 /胁迫 Defense / stress
F563 825 Catalase Vitis vinifera XP_002263134. 1 83 6e鄄142
F312 921 NADPH:cytochrome P450 reductase Salvia miltiorrhiza CBX24555. 1 81 3e鄄141
F619 970 Stress鄄associated protein 3 Solanum lycopersicum ACM68440. 1 70 3e鄄75
F538 639 Chloroplast HSP70 Cucumis sativus ABM92419. 1 97 4e鄄97
F341 228 Heat shock protein 90 Picea mariana AAC32131. 1 91 6e鄄43
细胞结构和细胞生长 Cell structure and cell growth
F349 727 Auxilin鄄like protein Cucumis melosubsp. Melo ADN34187. 1 72 2e鄄62
能量 Energy
F614 444 Plasma membrane H+ATPase Prunus persica CAB69823. 1 97 1e鄄47
功能未知 Function unknown
F397 506 Hypothetical protein Arabidopsis lyratasubsp. Lyrata XP_002867313. 1 66 1e鄄42
F302 674 Predicted protein Populus trichocarpa XP_002324174. 1 40 9e鄄25
F216 964 Unnamed protein product Vitis vinifera CBI16561. 3 54 1e鄄28
F275 784 Conserved hypothetical protein Ricinus communis XP_002518974. 1 49 4e鄄54
151 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 丁摇 勇等: 热胁迫下中甸角蒿叶片 SSH文库的构建及初步分析摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
表 2摇 反向 SSH鄄cDNA文库部分 EST与 GenBank功能已知基因同源性比较
Table 2摇 Similarlity anaylsis of a part of reverse SSH鄄cDNA library EST with the function identidied genes in GenBank
克隆编号
Sample
No.
长度
Length
/ bp
摇 摇 同源基因片段编码的蛋白
摇 摇 Gene homology 种属 Organism
GenBank序列号
Accession No.
一致性
Identity
/ %
E值
E鄄value
光合作用 Photosynthesis
R24 497 PSI type III chlorophyll a / b鄄binding protein Arabidopsis thaliana BAF00366. 1 87 6e鄄93
R34 230 Chloroplast chlorophyll A / B鄄binding protein Oenothera elatasubsp. Hookeri ACA52199. 1 68 4e鄄26
R460 915 Protoporphyrin IX:Mg Chelatase Antirrhinum majus CAA51664. 1 95 2e鄄147
R251 421 Phosphoenolpyruvate carboxylase Cupressus sp.HHG鄄2001 CAC81275. 1 89 4e鄄90
R142 493 PSI P700 apoprotein A1 Daucus carota CAC44035. 1 94 7e鄄110
R619 502 Photosystem I reaction center subunit N Ricinus communis XP_002526638. 1 67 6e鄄58
R115 585 Photosystem I reaction center subunit V (PsaG) Populus trichocarpa XP_002300801. 1 59 1e鄄23
R485 390 Photosystem II 47 kDa protein Vitis vinifera XP_002273432. 1 94 7e鄄92
R493 543 Ribulose鄄1,5鄄bisphosphate carboxylase /oxygenase large subunit Euphrasia azorica AEK34096. 1 98 2e鄄132
代谢 Metabolism
R541 503 (E)鄄4鄄hydroxy鄄3鄄methylbut鄄2鄄enyl diphosphatesynthase Artemisia annua ACT64770. 1 95 2e鄄79
R266 498 12鄄oxophytodienoate reductase opr, putative Ricinus communis XP_002526420. 1 69 1e鄄34
R559 351 2鄄deoxyglucose鄄6鄄phosphate phosphatase, putative Ricinus communis XP_002532876. 1 77 7e鄄58
R389 416 4鄄coumaryl鄄CoA ligase Plantago major CAJ43713. 1 90 6e鄄35
R338 563 Alcohol dehydrogenase, putative Ricinus communis XP_002525379. 1 64 2e鄄30
R1 250 Glucose acyltransferase Solanum pennellii AAF64227. 1 67 2e鄄33
R15 961 Glycosyltransferase, putative Ricinus communis XP_002531354. 1 87 5e鄄160
R14 322 Phytoene desaturase Sandersonia aurantiaca AAL80005. 1 90 2e鄄64
信号转导与转录 Signal transduction and transcription
R399 893 Pentatricopeptide repeat鄄containing protein,putative Ricinus communis XP_002527905. 1 59 5e鄄55
R124 592 Elongation factor 1鄄alpha Cucurbita moschata BAK09677. 1 98 2e鄄69
R131 555 Zinc finger protein, putative Ricinus communis XP_002525195. 1 84 4e鄄46
蛋白质合成 Biosynthesis
R274 505 30S ribosomal protein S13 Arabidopsis thaliana NP_568299. 1 81 7e鄄52
R177 680 40S ribosomal protein S12 Zea mays ACG24471. 1 81 1e鄄72
R327 209 Putative cellulose synthase Fagus sylvatica AAZ79659. 1 94 2e鄄41
蛋白质命运 Protein fate
R629 299 Cysteine protease Cp1 Actinidia deliciosa ABQ10199. 1 80 2e鄄42
蛋白质转运 Transporter
R254 752 Phosphatidylinositol transporter, putative Ricinus communis XP_002512943. 1 72 6e鄄99
防御 /胁迫 Defense / stress
R299 436 Universal stress protein Arachis hypogaea ACF74293. 1 93 2e鄄05
R107 485 Glutathion peroxidase Plantago major CAJ43709. 1 92 3e鄄70
能量 Energy
R190 387 Cytosolic NADP鄄malic enzyme Nicotiana tabacum ABI98681. 2 93 2e鄄79
功能未知 Function unknown
R13 567 Hypothetical protein Vitis vinifera XP_002276522. 1 62 9e鄄50
R256 462 Hypothetical protein Vitis vinifera XP_002285487. 1 81 3e鄄75
25摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 34 卷
图 7摇 热胁迫下中甸角蒿叶片抑制性消减文库的部分 EST按功能分类
Fig. 7摇 Distribution of differentially expressed gene transcripts in Incarvillea zhongdiannensis leaves subtraction
libraries under heat stress. Fifty known ESTs were grouped into nine funtional categories according
to their putative funtions. The proportions of the ESTs representing each category are shown
3摇 讨论
高等植物暴露于过热环境中会表现一系列特
征性的细胞反应和代谢反应, 如减少正常蛋白质
的合成, 增加热激蛋白 ( Heat shock proteins,
HSPs) 的转录与表达等。 Guy (1999) 研究表明
在细胞和代谢水平上的变化是植物适应高温环境
所必须的。 当植物处于比其最适生长条件至少高
5益的温度环境下即可产生这种胁迫变化 (Zhang
等, 2004, 2005)。 为了探讨高温对中甸角蒿基
因表达模式的影响, 本研究利用 SSH 技术, 以
适温 (20益) 处理响应为对照, 构建了中甸角
蒿对高温 (30益) 处理响应的正反向抑制性差
减杂交文库。 获得的已知功能的 EST 涉及到信
号转导与转录、 植物抗逆性反应、 光合作用、 代
谢与能量、 蛋白质命运、 蛋白质合成与转运等相
关基因, 显示在高温下中甸角蒿在细胞和代谢水
平上表现了一系列的胁迫响应特征。
在植物中, 高温等非生物胁迫通常导致结构
和功能蛋白质变性和功能紊乱, 因此, 维持蛋白
质完整的功能结构和防止外援蛋白的聚合是植物
细胞在胁迫条件下生存下来的关键, HSPs 就在
保护植物、 防御胁迫和恢复细胞自动动态平衡方
面起着关键的作用 (Wang等, 2004)。 本研究在
正向 SSH文库中获得了 1 个 HSP70 和 1 个 HSP90
蛋白 EST。 HSP70 具有维持结构和功能蛋白质稳
定, 防止结构和功能蛋白质变性, 帮助解聚蛋白
质再折叠, 协助结构和功能蛋白质转运, 参与信
号转导和转录激活等功能 (Hartl, 1996; Fryd鄄
man, 2001)。 HSP70 蛋白虽是维持正常细胞功能
所必须的, 但只有部分 HSP70 家族成员为组成
型表达, 它们主要协助新合成多肽折叠与转运。
另外一部分 HSP70 家族成员是在生物体受到环
境胁迫时特异表达, 它们主要参与解聚蛋白质的
再折叠, 或促进解聚蛋白质的水解过程 (Hartl,
1996; Miernyk, 1997; Karlin和 Brocchieri, 1998;
Frydman, 2001)。 HSP90 主要执行完成蛋白质的
折叠 (Buchner, 1999; Frydman, 2001), 在信号
传导途径、 细胞周期调控、 蛋白质降解、 蛋白质
转运等方面也起到重要的作用 (Young 等, 2001;
Richter和 Buchner, 2001; Pratt 等, 2001)。 推测
本研究获得的这些热激蛋白基因可能被高温胁迫
诱导表达, HSP70 有助于维持结构蛋白质和功能
蛋白质的稳定, 防止结构和功能蛋白质的变性与
解聚, 一旦结构和功能蛋白质发生了变性,
HSP90 将帮助变性蛋白质重新折叠。
除了 HSPs, 从高温处理的中甸角蒿 EST 数
据库中还获得了过氧化氢酶 ( catalase, CAT)、
细胞色素 P450 (NADPH: cytochrome P450 reduc鄄
tase) 和胁迫相关蛋白 3 (stress鄄associated protein
3) 等其他胁迫相关的基因。 CATs是一类广泛存
在于生物体内的保护酶, 在植物防御、 胁迫应
答、 延缓衰老及控制细胞的氧化还原平衡等方面
起重要作用 ( Scandalios, 2005; Mandhania 等,
2006)。 研究表明提高植物体内抗氧化酶活性和
增强氧化代谢的水平是提高植物抗逆性的有效途
径 (Mittler和 Zilinskas, 1991, 1994)。 因此, 推
351 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 丁摇 勇等: 热胁迫下中甸角蒿叶片 SSH文库的构建及初步分析摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
测在热胁迫下 CAT 基因在中甸角蒿叶片中上调
表达, 可能与叶片光呼吸产生的 H2O2清除有关。
P450 是一类具有多种催化功能含血红素的氧化
酶系, 在植物体内具有重要的生物合成功能, 可
以催化许多初级和次级代谢反应, 并在植物的防
御反应、 抗逆性方面起重要作用 (赵剑等,
1999; Harvey 等, 2002)。 根据以上研究结果,
推测中甸角蒿在高温胁迫环境中可能启动了一些
通用的分子机制, 如信号转导和转录调控, 来防
御和应答胁迫环境。
Crafts鄄Brandner 和 Salvucci (2000) 研究认
为高温对高等植物的伤害首先作用在光合器官,
而且高等植物叶片的热耐受性限度是由发生在类
囊体膜系统上的初级光化反应的热敏感性决定的
(Vani等, 2001)。 高温对植物光合速率的影响
既存在不可逆性的效应, 还包括大量的可逆性效
应 (Weis和 Berry, 1988)。 极端高温胁迫能够导
致植物光合系统域 (PS域) 和二磷酸核酮糖羧
化酶活性不可逆性的显著的伤害 (Crafts鄄Brand鄄
ner和 Salvucci, 2000; Bernacchi 等, 2002), 非
极端高温胁迫可能是通过降低或阻遏光合作用对
植物造成伤害的 (Zhang 等, 2005)。 本研究从
正向 SSH文库中获得了一些与叶绿素和光合作
用相关的基因, 如核酮糖 1, 5鄄二磷酸羧化酶激
酶基因、 光系统域相关蛋白基因和叶绿素 a / b 结
合蛋白基因等。 虽然还不清楚这些基因在热胁迫
环境下的具体功能, 但是可以推测这些基因在中
甸角蒿对高温胁迫响应方面起到重要的作用。 研
究还发现一些参与代谢与能量等相关蛋白基因也
相应出现在文库中, 推测 30益的温度对中甸角
蒿叶片造成了高温但非致死性胁迫, 中甸角蒿在
高温胁迫下光合作用受到了一定的阻遏, 植物为
了生存努力通过糖酵解、 蛋白质和脂肪降解等途
径利用更多的代谢产物。
本实验成功构建了中甸角蒿高温胁迫相关基
因抑制差减杂交文库, 较好的体现了 SSH 技术
是研究植物在非生物胁迫下基因差异表达模式的
成功方法。 中甸角蒿对高温胁迫响应存在着一个
多基因控制的、 复杂的抗逆信号应答和代谢调控
网络。 通过对文库中部分 EST 进行序列测定和
功能分析, 获得了多个可能与温度胁迫相关的基
因。 另外, 本研究构建的 SSH 文库中还存在一
些功能未知和未匹配的基因, 推测为新功能基
因, 它们可能在增强植物热耐受性方面具有重要
的作用。 为了更全面、 准确地了解中甸角蒿在高
温胁迫环境中生存的分子机制, 对 SSH鄄cDNA文
库的大规模测序及部分基因的全长克隆和功能验
证工作正在进行中。
也参摇 考摇 文摇 献页
王文采, 潘开玉, 张志耘等, 1990. 中国植物志 第 69 卷 [M].
北京: 科技出版社, 44—45
Bernacchi CJ, Portis AR, Nakano H et al., 2002. Temperature re鄄
sponse of mesophyll conductance. Implications for the determina鄄
tion of Rubisco enzyme kinetics and for limitations to photosynthe鄄
sis in vivo [J] . Plant Physiology, 130: 1992—1998
Buchner J, 1999. Hsp90 & Co. -a holding for folding [J] . Trends
in Biochemical Sciences, 24: 136—141
Cai YF (蔡艳飞), Zhang SB (张石宝), Hu H (胡虹) et al.,
2008. The response of Incarvillea delavayi (Bignoniaceae) grown
in different altitudes subject to water availability [ J] . Acta Bo鄄
tanica Yunnanica (云南植物研究), 30: 577—585
Crafts鄄Brandner SJ, Salvucci ME, 2000. Rubisco activase constrains
the photosynthetic potential of leaves at high temperature and CO2
[J] . Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA,
97: 13430—13435
Diatachenko L, Lau YFC, Campbell AP et al., 1996. Suppression
subtractive hybridization: A method for generating differentially
regulated or tissue鄄specific cDNA probes and libraries [ J] . Pro鄄
ceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 93:
6025—6030
Du YX (杜有新), Yang T (杨涛), Li CC (李成才) et al., 2003.
Investigation of alpine wild ornamental plants germplasm re鄄
sources in Yunnan province [ J] . Journal of Nanjing Forestry
University ( Natural Sciences Edition) (南京林业大学学报
(自然科学版)), 27: 80—84
Feng GM (冯国楣), 1981. The richness of the ornamental flora in
Yunnan [J] . Acta Horticulturae Sinica (园艺学报), 8: 59—
64
Frydman J, 2001. Folding of newly translated proteins in vivo: the
role of molecular chaperones [ J] . Annual Review of Biochemis鄄
try, 70: 603—647
Guy C, 1999. The influence of temperature extremes on gene expres鄄
sion, genomic structure, and the evolution of induced tolerance
in plants [A]. In: Lerner HR, ed. Plant Responses to Environ鄄
mental Stresses [M]. New York, NY: Marcel Dekker, 497—
548
Hartl FU, 1996. Molecular chaperones in cellular protein folding
[J] . Nature, 381: 571—580
45摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 34 卷
Harvey PJ, Campanella BF, Castro PML et al., 2002. Phytoremedi鄄
ation of polyaromatic hydro鄄carbons, anilines and phenols [ J] .
Enviromental Science and Pollution Research international, 9:
29—47
Huang JW (黄锦文), Wu WX (吴文祥), Chen DM (陈冬梅) et
al., 2009. Analysis of different expression of genes in Zoysia
Matrella exposed to high temperature treatmen [J] . Acta Agres鄄
tia Sinica (草地学报), 17: 435—439
Karlin S, Brocchieri L, 1998. Heat shock protein 70 family: multiple
sequence comparisons, function, and evolution [ J] . Journal of
Molecular Evolution, 47: 565—577
Lei M (雷鸣), Li SY (李树云), Zhang SB (张石宝) et al.,
2009. Effects of nitrogen on photosynthesis and growth in Incar鄄
villea delavayi ( Bignoniaceae) [ J] . Acta Botanica Yunnanica
(云南植物研究), 31: 82—88
Mandhania S, Madan S, Sawhney V, 2006. Antioxidant defense
mechanism under salt stress in wheat seedlings [ J] . Biologia
Plantarum, 50: 227—231
Miernyk JA, 1997. The 70kDa stress鄄related proteins as molecular
chaperones [J] . Trends in Plant Science, 2: 180—187
Mittler R, Zilinskas BA, 1991. Purification and characterization of
pea cytosolic ascorbate peroxidase [ J] . Plant Physiology, 97:
962—968
Mittler R, Zilinskas BA, 1994. Regulation of pea cytosolic ascorbate
peroxidase and other antioxidant enzymes during the progression of
drought stress and following recovery from drought [ J ] . The
Plant Journal, 5: 397—405
Pratt WB, Krishna P, Olsen LJ, 2001. Hsp90鄄binding immunophil鄄
ins in plants: the protein movers [ J] . Trends in Plant Science,
6: 54—58
Richter K, Buchner J, 2001. Hsp90: chaperoning signal transduction
[J] . Journal of Cellular Physiology, 188: 281—290
Scandalios JG, 2005. Oxidative stress: molecular perception and
transduction of signals triggering antioxidant gene defenses [ J] .
Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 38: 995—
1014
Vani B, Saradhi PP, Mohanty P, 2001. Characterization of high tem鄄
perature induced stress impairments in thylakoids of rice seed鄄
lings [J] . Indian Journal of Biochemistry and Biophysics, 38:
220—229
Wang WX, Vinocur B, Shoseyov O et al., 2004. Role of plant heat鄄
shock proteins and molecular chaperones in the abiotic stress re鄄
sponse [J] . Trends in Plant Science, 9: 244—252
Weis E, Berry JA, 1988. Plants and high temperature stress [ J] .
Symposia of the Society for Experimental Biology, 42: 329—346
Xi X (席雪), Li SY (李树云), Yan N (严宁) et al., 2010. Pho鄄
tosynthetic response of Incarvillea zhongdiannensis (Bignoniace鄄
ae) subject to growth irradiance [J] . Acta Botanica Yunnanica
(云南植物研究), 32: 519—527
Young JC, Moarefi I, Hartl FU, 2001. Hsp90: a specialized but es鄄
sential protein鄄folding tool [ J] . Journal of Cell Biology, 154:
267—274
Zhang SB (张石宝), Hu H (胡虹), Wang H (王华) et al., 2005.
The germplasm resources and exploitation of alpine ornamental
plants in Yannan [J] . Chinese Wild Plant Resources (中国野生
植物资源), 24: 19—22
Zhang Y, Mian MAR, Chekhovskiy K et al., 2005. Differential gene
expression in Festuca under heat stress conditions [ J] . Journal
of Expetimental Botany, 56: 897—907
Zhang Y, Zwonitzer J, Chekhovskiy K et al., 2004. A functional ge鄄
nomics approach for identification of heat tolerance genes in tall
fescue [J] . Molecular Breeding of Forage and Turf, 11: 87—
96
Zhao J (赵剑), Yang WJ (杨文杰), Zhu WH (朱蔚华), 1999.
Cytochrome P450 and plant secondary metabolism [J] . Chinese
Bulletin of Life Sciences (生命科学), 11: 127—131
551 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 丁摇 勇等: 热胁迫下中甸角蒿叶片 SSH文库的构建及初步分析摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇