全 文 ：Metabarcoding技术在植物鉴定和多样性研究中的应用*
唐摇 敏1, 伊廷双2, 王摇 欣1, 谭美华1, 周摇 欣1**
(1 深圳国家基因库, 深圳华大基因研究院, 广东 深圳摇 518083; 2 中国科学院昆明植物研究所
中国西南野生生物种质资源库, 云南 昆明摇 650201)
摘要: 目前植物学研究已进入后植物志时代, iFlora的实现需要以传统植物分类学及相关研究为基础, 整
合基于高通量测序的 DNA条形码 (DNA barcoding) 技术并开发便携式快速鉴定仪器及构建信息平台。 传
统植物鉴定多基于形态学分类, 而近年来快速发展的 DNA条形码快速鉴定技术被各界分类学家认可, 在
植物鉴定中也被广泛应用。 但 DNA条形码技术仍存在一些问题亟待解决, 如种的鉴定需要多个条形码的
解析、 Sanger测序平台无法处理混合样品。 本文介绍了传统植物分类技术和 DNA 条形码技术在植物研究
中的应用和遇到的瓶颈; 并重点介绍了基于高通量测序的 metabarcoding 技术在植物鉴定及多样性研究中
的应用及前景, 及其与 iFlora的关系。
关键词: 植物志; 植物多样性; DNA条形码; iFlora; metabarcoding 技术
中图分类号: Q 949, Q 78摇 摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 摇 摇 文章编号: 2095-0845(2013)06-769-05
The Application of Metabarcoding Technology in
Identification of Plant Species Diversity
TANG Min1, YI Ting鄄Shuang2, WANG Xin1, TAN Mei鄄Hua1, ZHOU Xin1**
(1 China National GeneBank鄄Shenzhen, BGI鄄Shenzhen, Shenzhen 518083, China; 2 Germplasm Bank of Wild Species
in Southwest China, Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650201, China)
Abstract: Botany has entered a post鄄Flora era. Benefited from traditional plant taxonomy and related studies, the
success of iFlora requires the integration of DNA barcoding through state of art high鄄throughput鄄sequencing technolo鄄
gies and portable equipment for rapid taxonomic identification and information platform. Traditional plant identifica鄄
tion relies mostly on morphological features, while DNA barcoding has been widely applied as a complementary mo鄄
lecular approach to facilitating fast species identification. However, issues remain in classic DNA barcoding, e. g. ,
species鄄level resolution can only be achieved via multiple barcode markers; taxon identity cannot be revealed for
pooled plant samples via Sanger sequencing. In this review, the authors introduce recent developments in metabar鄄
coding, which is based on the next鄄generation鄄sequencing technologies, and its applications in a few key aspects in
plant diversity and its potential role in iFlora.
Key words: Flora; Plant diversity; DNA barcoding; iFlora; Metabarcoding techonology
摇 李德铢等 (2012) 提出了新一代植物志 (iFlo鄄
ra) 的理念, 即整合现代植物学、 DNA 测序技
术与信息技术的集成装备和信息平台。 iFlora 将
囊括传统植物学、 物种分布、 DNA 条形码及系
统发育等信息, 其中亟待改进的重要环节是物种
快速鉴定技术, 是所有生物学研究的基础 (李德
铢等, 2012; 李洪涛等, 2012; 曾春霞等, 2012)。
传统的物种鉴定通常依赖于形态学特征, 其准确
植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 2013, 35 (6): 769 ~ 773
Plant Diversity and Resources摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 DOI: 10. 7677 / ynzwyj201313198
*
**
基金项目: 中国科学院科技创新 “交叉与合作团队冶 (31129001); 科技基础性工作专项重点项目 (2013FY112600); 国家高技
术研究发展计划 (863 计划) (2012AA021601)
通讯作者: Author for correspondence; E鄄mail: xinzhou@ genomics. cn
收稿日期: 2013-09-30, 2013-10-12 接受发表
作者简介: 唐摇 敏 (1987-) 女, 硕士, 主要从事生物遗传信息学相关研究。 E鄄mail: tangmin@ genomics. cn
性和效率极大地依赖于分类学家的经验。 而当前
训练有素的分类学家越来越少, 形态分类学工作
又不可避免地会遇到人为的错误及其他无法克服
的困难。 面对地球上数以万计的植物物种, 学界
亟需一套高效、 自动化的鉴定技术手段。 受微生
物物种鉴定的启发, 学者们开始使用遗传信息进
行物种鉴定。 分子生物学鉴定的理念被提出
(Arnot等, 1993; Floyd等, 2002), DNA条形码技
术被开发之后 (Hebert等, 2003), 该技术的研究
与应用迅速成为生物学研究热点。 为了研究环境
群落样品或混合样品, 整合 DNA条形码和高通量
测序技术的 metabarcoding 技术应运而生, 它以更
高的效率和更低的成本极大地拓展了 DNA条形码
在生物多样性的监测 (Yu等, 2012) 和食性分析
(Pompanon等, 2012; Shehzad 等, 2012) 等方面
的应用。 近年来 DNA 条形码与 metabarcoding 技
术在植物鉴定及其多样性研究中应用广泛, 本文
将重点介绍该方向已有的进展, 并分析该技术的
瓶颈及其与 iFlora的关系。
1摇 经典分类方法已制约植物多样性研究
传统植物多样性研究的第一步是经典分类工
作, 即标本采集和制作, 根据植物的外部形态和
内部解剖结构特征, 结合地理分布, 对种类进行
鉴定和描述 (方伟和刘恩德, 2012)。 经典分类对
认知生物界, 构建生物分类系统起着重要作用。
然而, 传统的物种鉴定已经无法满足植物多样性
研究对物种快速准确鉴定的需求。 一方面, 传统
分类学研究主要依赖于形态学特征, 而形态特征
的使用往往依赖于专家, 而专家对物种的认知依
赖于对某一类群的经验。 另一方面, 由于各种原
因, 分类学被贴上了 “传统冶 和 “古老冶 的标签
而被忽视, 对经典分类学这一基础学科的投入逐
渐减少 (Enghoff和 Seberg, 2006), 这已成为世界
性问题。 基于形态学鉴定的局限性和不断缩减的
分类学家队伍, 物种鉴定面临着巨大的挑战。 最
为重要的是, 当前植物多样性研究面对的研究对
象常常为一个区域, 群落或者集群, 所包含的物
种常常来自不同的门类, 并常常不具备完整的形
态分类学性状。 任何分类学家均不可能对诸如此
类的物种进行准确快速鉴定, 这将直接影响到植
物多样研究后续分析结果的准确性和可靠性。
2摇 植物 DNA条形码的应用和发展
DNA条形码技术是使用标准化的 DNA 片段
进行物种鉴定的方法 (Hebert 等, 2003)。 线粒体
上的 COI基因片段在动物鉴定中被普遍认可和应
用, 但对于植物, 分类学家一直在找寻象 COI 一
样可靠并具有普适性的条形码。 目前用于植物鉴
定的条形码主要是来自核基因组的 ITS 片段和来
自叶绿体基因组的 rbcL和 matK片段 (Lahaye等,
2008b; Starr 等, 2009; Li等, 2011; Yu等, 2012)。
对大多数被子植物, 叶绿体基因组具有母系遗传、
重组率低以及大小适中并能提供较多的变异位点
等特点, CBOL植物工作组 (CBOL Plant Working
Group, 2009) 推荐的叶绿体基因 rbcL 和 matK被
广泛认可 (Burgess 等, 2011)。 另外还有研究者
提议许多较为通用、 进化速度更快的叶绿体片段
作为候选条形码, 如 atpF鄄atpH、 psbI鄄psbK、 trnH鄄
psbA 等基因间区 ( Kress 等, 2005; Chase 等,
2007; Kress 和 Erickson, 2007; Lahaye 等, 2008a;
Newmaster 等, 2008; Whitlock 等, 2010; Holling鄄
sworth等, 2011)。 但这些条形码在不同的分类阶
元水平上分辨率不同 (Roy 等, 2010; Whitlock
等, 2010), 对于经历快速辐射进化、 杂交、 基因
渐渗等复杂进化且物种数目较多类群的鉴定, 则
需要分辨率更高的 DNA片段和分子标记 (Taber鄄
let等, 2007)。 对于这些困难类群, 可通过核心条
形码鉴定到属后辅以属内专用条码补充 (李洪涛
等, 2012)。 很多学者也建议利用多个条形码共同
协同鉴定方法 (Yang 等, 2012), 因此使用二维
或多维条码对植物鉴定获得了共识。 在动物物种
鉴定方面, 线粒体全基因组序列的获得将提供更
多的遗传信息以助于物种鉴定。 同样, 如果能构
建叶绿体全基因组数据库, 多维条形码鉴定将具
有更加广泛的用途, Stoeckle 等 (2011) 在鉴定
商业茶种中碰到的参考序列贫乏的问题也将得到
解决。 Parks等 (2009) 通过比较叶绿体全基因组
有效地对松属物种进行低阶分类, 发现 ycf1 和
ycf2两个基因有很高的变异速率, 可以作为植物
条形码。 虽然叶绿体全基因组远大于线粒体全基
因组 (几十 Kb至几 Mb), 但随着新一代测序技
术和混合测序技术的发展, 高通量、 低成本地获
取大量并不受特定片段限制的样品遗传信息成为
可能 (Nock等, 2011)。
077摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 35 卷
3摇 基于高通量测序的metabarcoding技术
的应用及前景
DNA高通量测序技术的发展和 DNA 条形码
应用需求的增长孕育了可同时获取多物种样品条
形码序列的 metabarcoding技术, Hajibabaei (2012)
认为两种技术的结合造就了 “ DNA 宏分类学
(DNA metasystematics)冶 的黄金时代。 这项技术
可以高通量地获得多个物种条形码序列, 应用生
物多样性研究的不同领域。
3. 1摇 植物多样性的快速检测
Metabarcoding技术的应用实现了植物多样性
的快速检测。 Pompanon (2011)、 Yoccoz (2012)
和 Taberlet (2012) 等人提倡用 metabarcoding 技
术监测环境样品, 并成功将该技术应用于植物的
多样性快速检测。 传统植物多样性调查包括采
样、 标本的制作、 形态学鉴定, 存在周期长和鉴
定准确率低等缺点。 而且, 植物多样性检测的样
品中往往混有不同物种, 如一个植物群落土壤样
品, 无法用经典分类和传统 DNA 条形码技术进
行鉴定。 而 Metabarcoding 技术的应用使此类问
题迎刃而解。 Yoccoz 等 (2012) 利用 Metabar鄄
coding技术, 使用叶绿体 trnL (UAA) 内含子的
P6 环作为条形码对环境土壤提取混合 DNA (大
部分为游离 DNA, 也含有部分植物组织如根)
进行准确的物种鉴定, 很好地反映地上植物的分
布。 该技术也被应用于热带植被的鉴定, 证实了
该技术的普适性和可靠性。 除能够准确鉴定植物
群落中的物种, 物种的丰度信息也能在 metabar鄄
coding的数据里体现。 Hiiesalu 等 (2012) 利用
传统手段和 metabarcoding 技术分析了地上植物
多样性结果, 发现两种技术获得物种的分布及丰
度信息在允许误差范围内。 另外发现对地下土壤
取样可以获得在传统分析中容易被忽视的信息,
如物种共存分布等, 能更全面地反映植被生态及
其所受到的影响。 上述所用到的条码 trnL (UAA)
内含子片段虽有其局限性, 但仍有很多优势, 如
引物通用性高、 扩增体系稳定及片段大小合适,
即使是游离和降解严重的土壤 DNA 样品也可以
扩增出来 (Taberlet等, 2007)。 但从长远的角度
来看, PCR 的偏向性会导致稀有的或者难扩增
物种的数据丢失和引入嵌合体等错误的产物, 另
外 454 平台本身较高的测序错误率会引入假阳性
结果, 因此应用更高通量和准确度的测序平台并
结合 PCR鄄free 的方法是未来的 metabarcoding 技
术的发展趋势 (Zhou等, 2013)。
3. 2摇 植食性动物的食性分析
食性分析及食物网络的研究结果可直接体现
出生态群落的功能结构, 是生态系统研究的重要
组成部分。 传统的食性分析通常通过收集粪便并
鉴别其中食物残留, 分析人员通过肉眼直接观察
或利用早期的分子实验获取食谱信息, 由于食物
残留情况各异, 这种方法耗时耗力, 对分析人员
的经验依赖性大而且解析度不高。 第二代高通量
测序技术对食性分析的研究进行了革新, 利用
metabarcoding技术, 研究人员可快速准确地进行
大量样品的食性分析 ( Pompanon 等, 2012 )。
Valentini (2009) 提议将 trnL片段用于植食性动
物的食性分析研究, 该方法被证实是快速有效
的, 50%以上的物种可用该条码鉴定到种。 Hibert
等 (2013) 在研究热带森林里难于追踪的植食
性动物貘的食谱时发现 trnL 的 P6 区可用于在科
或属的水平上鉴定出貘进食的绝大多数植物, 另
外一些困难类群可用辅助条码 ITS1 鉴定。 人类
活动极大地影响了灵长类动物的栖息, Qu佴m佴r佴
等 (2013) 利用 metabarcoding 技术对濒临灭绝
的金冠狐猴的食性进行研究, 发现狐猴的食谱里
至少有 130 种植物, 多样性的食谱有利于狐猴灵
活改变食物结构应对环境的变化。 同样有着多样
食谱的还有亚北极圈小型啮齿类动物, 如棕背田
鼠和根田鼠, Soininen 等 (2013) 通过 metabar鄄
coding分析发现一个奇怪现象, 季节的变化并没
有对他们的食谱产生直接影响, 而它们的觅食行
为值得进一步研究。 对于季节性食谱的探究,
Czernik等 (2013) 对鹿科动物在冬天的食谱做
了研究, 再次证实了 metabarcoding 技术在植物
多样性分析中的可靠性。
3. 3摇 古植物学研究
传统古植物学的研究对象主要为化石中的
花、 果实、 花粉、 孢子及其它可见组织, 古植物
学家多通过光学仪器进行鉴定, 由于化石中的器
官和组织多不具备完整的形态鉴定性状, 常难以
进行鉴定。 而今很多学者借助 metabarcoding 技
术进行古植物的鉴定 (Gugerli 等, 2013)。 Mur鄄
ray等 (2012) 采用该技术分析植食性动物的粪
1776 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 唐摇 敏等: Metabarcoding技术在植物鉴定和多样性研究中的应用摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
堆遗存, 发现了一些之前没有报道过的动植物物
种。 虽然还不了解 DNA 如何在如此高温干旱环
境下保存下来, 但这些 DNA 成为这些地区古生
物学家的宝贵资源。 J覬rgensen 等 (2012) 对西
伯利亚北部的泰梅尔半岛古植物多样性研究时,
比较了基于冻土 DNA 样品的 metabarcoding 技
术、 花粉鉴定和大化石鉴定的三种研究方法, 发
现三种方法所得结果可以相互补充, 且三种方法
的结果整合后能更好的重现古植物多样性。 他们
的研究结果还发现冻土 DNA 样品 metabarcoding
技术鉴定结果与大化石物种鉴定结果一致性较
高, 但与基于花粉鉴定结果差异较大。 Parducci
等 (2013) 对斯堪的纳维亚古植物多样性研究
时同样发现冻土 DNA 样品 metabarcoding 技术鉴
定结果与基于花粉的鉴定结果差异较大, 可能的
原因是: 1. metabarcoding 技术基于 PCR, 扩增
过程有一定偏向性; 2. 引物不适用于某些古植
物类群; 3. 花粉可能不是来源于当地植物, 而
是由其它地方传播而来的。 因此在古植物多样性
研究中, metabarcoding技术无法完全取代传统研
究方法, 但它已经成为一种很好的辅助手段。
以上所述是目前 metabarcoding 技术在植物
鉴定及多样性研究中的应用介绍。 该技术最大的
优势在于能高通量、 低成本并快速地鉴定物种,
最大的局限为 PCR 的偏向性、 条形码的解析度
和普适性及数据库的完善度, 因此, 应用 PCR鄄
free技术和建立健全的数据库是未来工作的重点。
目前该技术在国内应用较少, 但预期将会得到广
泛的应用。
4摇 高通量metabarcoding技术与 iFlora结合
要实现 metabarcoding 技术高通量、 准确、
快速物种鉴定, 最为关键的是构建物种 DNA 条
形码的标准数据库、 物种信息库、 信息共享和应
用平台, 而这些是正在实施构建的 iFlora 的关键
和核心内容 (李德铢等, 2012)。 在 iFlora 相关数
据库和平台构建完成后, 通过 metabarcoding 技术
可以实现物种准确快速鉴定, 突破对经验和材料
的过度依赖, 物种确定后, 可以通过 iFlora 装备
获得所需要的生物多样性信息。 metabarcoding 技
术与 iFlora结合, 可以充分发挥 metabarcoding 技
术的效能, 也能使 iFlora得以充分利用, 它将在
生物多样性保护和资源可持续利用、 国家生态安
全、 社会公共教育和服务等方面发挥重要作用。
5摇 结语
整合了 DNA高通量测序和 DNA条形码技术的
metabarcoding技术, 可以准确、 快速鉴定混合样
品, 解析群落物种多样性。 该技术将成 iFlora 连接
物种和物种多样性的强力纽带, 为充分发挥 iFlora
在生物多样性中的研究和提高其利用效能提供保
障。 Metabarcoding 技术与 iFlora 结合必将推动生
物物种鉴定和多样性研究进入一个崭新的时代。
也参摇 考摇 文摇 献页
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3776 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 唐摇 敏等: Metabarcoding技术在植物鉴定和多样性研究中的应用摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇