全 文 ：关于植物 DNA条形码研究技术规范*
高连明1, 刘摇 杰1, 蔡摇 杰2, 杨俊波2, 张摇 挺2, 李德铢1,2**
(1 中国科学院昆明植物研究所生物多样性与生物地理学重点实验室, 云南 昆明摇 650201;
2 中国科学院昆明植物研究所中国西南野生生物种质资源库, 云南 昆明摇 650201)
摘要: DNA条形码是利用标准的基因片段对物种进行快速鉴定的技术, 已经成功用于生物物种分类和鉴
定、 生态学调查和生物多样性评估等研究领域。 尽管生命条形码数据 (BOLD) 系统提供了主要针对动物
类群 DNA条形码研究的技术规范, 但由于植物本身的生物学特性与所使用的条形码不同, 因此已有技术
规范并不完全适用于植物 DNA条形码的研究。 本文根据植物 DNA 条形码研究的特点与我国的实际情况,
编写了植物 DNA条形码研究技术标准和规范指南, 具体包括十个方面的内容, 即植物 DNA条形码研究的
样品采集策略; 植物标本和野外数据的采集规范; 植物标本图像信息的采集规范; 植物 DNA 材料的采集
规范; 植物 DNA材料的干燥与保存规范; 植物总 DNA 的质量标准及保存规范; 植物标准 DNA 条形码的
选择与通用引物; DNA条形码的扩增与测序; DNA条形码数据的命名、 编辑和提交规范; 以及 DNA条形
码数据分析。 我们期望通过这些标准规范的实施和在实践中的不断修订和完善, 能为我国学者开展植物
DNA条形码和 iFlora研究提供参考和借鉴。
关键词: 植物 DNA条形码; 技术规范; 物种鉴定; 标准; 新一代植物志
中图分类号: Q 94-33, Q 948. 2摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 文章编号: 2095-0845(2012)06-592-15
A Synopsis of Technical Notes on the Standards
for Plant DNA Barcoding
GAO Lian鄄Ming1, LIU Jie1, CAI Jie2, YANG Jun鄄Bo2, ZHANG Ting2, LI De鄄Zhu1,2**
(1 Key Laboratory of Biodiversity and Biogeography, Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences,
Kunming 650201, China; 2 Germplasm Bank of Wild Species, Kunming Institute of Botany,
Chinese Academy of Sciences, Kunming 650201, China)
Abstract: DNA barcoding is a technique using one or a few standardized DNA regions from different genomes for
rapid species identification, which is used in the field of taxonomy, ecological surveys and assessment of biodiversi鄄
ty. Because of the plant natural particularity and the DNA barcodes used for plants differing from animals, the stand鄄
ards provided by BOLD which was initially dssigned for animals are not totally compatible in plants DNA barcoding re鄄
search. Thus, we synthesize and customize a synopsis of technical notes and standards with reference of the BOLD cri鄄
teria and experience of plant DNA barcoding projects, especial for the researchers with particular interest in plants
DNA barcoding in China. Ten aspects related to plants DNA barcoding are covered: 1) sampling strategy for a plant
DNA barcoding study, 2) collecting standards for vouches and associate information, 3) collection standards for speci鄄
men鄄referenced images, 4) collecting standards for DNA material, 5) standards for drying and preserving DNA mate鄄
rial, 6) quality control and preservation procedures for extracted total genomic DNA, 7) recommended plant barcodes
植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 2012, 34 (6): 592 ~ 606
Plant Diversity and Resources摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 DOI: 10. 3724 / SP. J. 1143. 2012. 12138
*
**
基金项目: 中国科学院大科学装置开放研究项目 (2009鄄LSFGBOWS鄄01); 云南省中青年学术技术带头人后备人才项目 (2008PY064);
国家科技部科技基础工作专项项目; 国家高科技研究发展计划 (863 计划) (2012AA021801)
通讯作者: Author for correspondence; E鄄mail: dzl@ mail. kib. ac. cn
收稿日期: 2012-11-05, 2012-11-09 接受发表
作者简介: 高连明 (1972-) 男, 博士、 副研究员, 主要从事植物系统发育、 群体遗传和 DNA条形码等研究。
E鄄mail: gaolm@ mail. kib. ac. cn
and universal primers, 8) procedures for PCR amplification and sequencing of the DNA barcodes, 9) naming, editing
and submission for DNA barcoding files, and 10) procedures and methods for the analysis of DNA barcoding data.
Key words: Plant DNA barcoding; Technical notes; Species identification; Standards; iFlora
摇 DNA条形码技术是利用标准的基因片段对
物种进行快速鉴定 (Hebert 等, 2003)。 该技术
提供了可信息化的分类学标准和有效的分类学手
段, 已经被成功用于生物物种鉴定和分类 (He鄄
bert等, 2004; Liu 等, 2011), 生物多样性调查
(Lahaye等, 2008) 和生态学研究 (Valentini等,
2009) 等领域, 并成为进展最迅速的学科前沿
之一。 随着贸易全球化的推进、 全球气候变化的
加剧, 对生物多样性的探索、 认识和理解已成为
人类可持续发展的重要物质基础, 物种的快速鉴
定及对生物多样性资源的可持续利用已成为世界
性的重大需求 (Che 等, 2010)。 准确的物种鉴
定是人类认知生物多样性和可持续发展的必要前
提, 而基于传统的形态学特征进行物种鉴定已难
以满足科学发展的需求, DNA 条形码技术正是
在这个背景下应运而生。
植物 DNA条形码不仅是传统植物分类与鉴
定的强有力补充, 而且能使标本鉴定过程实现自
动化和标准化, 突破了对经验的过度依赖, 并能
够在较短时间内建成易于利用的应用系统, 在物
种分类和鉴定方面展示出了强大的生命力 (He鄄
bert等, 2004; Li等, 2011b, c)。 DNA条形码最
大的优点在于可利用生物残迹来鉴定形态学无法
鉴定的已知或未知物种 ( http: / / www. barcode鄄
oflife. org), 因此, DNA 条形码技术在生物多样
性调查与监测、 分子系统发育与进化、 生态学、
食品安全、 生物检验检疫、 法医学、 流行病学等
领域具有广阔的应用前景。
iFlora是整合现代植物学、 DNA 测序技术与
信息技术的集成装备和信息平台, 能准确快速识
别植物, 并能提供相关数字化信息的智能植物志
(李德铢等, 2012)。 利用 DNA 条形码标准数据
库的构建真正实现对物种的快速鉴定, 同时通过
信息化平台实现相关信息获取。 由此可见, DNA
条形码不仅是 iFlora构建的核心内容, 更是联系
其它相关信息的纽带。
目前, 我国虽然有许多学者从事植物 DNA
条形码及相关研究, 但在从事该类研究过程中尚
缺乏统一的标准和规范可循, 致使很多研究尚不
规范, 不能满足国际生命条形码计划的相关要
求, 使得目前获得的大量 DNA 条形码数据不能
用作标准的参考条码, 在一定程度上造成资源的
浪费。 此外, 虽然 BOLD (The Barcode of Life Da鄄
ta) 系统提供了 DNA 条形码研究方面的技术规
范与要求 (Ratnasingham 和 Hebert, 2007), 但
这些技术规范主要针对动物类群, 由于植物与动
物的自然特性差异较大, 所采用的条形码与相应
规范不可能完全一致, 这对植物 DNA 条形码的
应用具有很大的局限性。 因此, 我们根据近几年
的研究实践, 针对植物 DNA 条形码本身的特点
与研究实际, 编写了植物 DNA 条形码研究技术
标准和规范, 旨在为我国学者进一步开展植物
DNA条形码研究和 iFlora构建提供参考和指导。
1摇 植物 DNA条形码研究的样品采集策略
自 DNA条形码提出后, 该技术虽然在生物
多样性调查和编目、 物种鉴定及新物种发现等方
面已得到广泛应用 (Li等, 2011a), 但是需要多
少标本 (样品) 才可以建立一个可靠的物种鉴
定参考数据库 (Reference library) 用于解决物
种鉴定的问题, 尚未得到很好解决 (Zhang 等,
2010)。 事实上, 样品采集的数量应最大限度地
覆盖物种的整个遗传变异范围, 这样的物种参考
数据库才能真正代表该物种的遗传多样性, 利用
DNA条形码鉴定的物种才更可靠。 为了获取更
多物种的条形码序列, 往往就会牺牲物种的样品
数量 (Matz 和 Nielsen, 2005), 例如, 目前建立
的 DNA条形码数据库中, 大多数的物种只包括 5
~10条序列, 且少数物种仅有 1 ~ 2 条 (http:/ /
www. barcodinglife. org / views / ligin. php)。 国际生
命条形码计划 ( iBOL Project) 要求每个物种要
有 10 个标本 (样品), 但这种要求是否合适并
没有得到验证。 在动物的 DNA 条形码研究中,
Matz和 Nielsen (2005) 建议每个物种样本数为
12 个个体。 然而 Zhang 等 (2010) 的研究表明,
通常认为的每个物种 5 ~ 10 个样品是不够的, 不
3956 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 高连明等: 关于植物 DNA条形码研究技术规范摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
能代表物种的遗传多样性, 而需要更多的样品
数。 Liu等 (2012) 通过对红豆杉属物种 DNA
条形码采集策略的研究, 提出居群内的遗传变异
通常小于居群间的遗传变异, 建议在采集时应尽
可能采集覆盖物种整个分布区不同居群的样品,
而每个居群只需要 1 个样品; 来自整个分布区的
8 ~ 10 个不同居群的样品 (个体) 能够代表物种
的遗传多样性, 用于植物 DNA 条形码研究似乎
已经足够了。 这可能与物种进化的历史及 DNA
条形码的进化速率有关 (Liu等, 2012)。 因为植
物的 DNA 条形码进化速率比动物的通用条码
COI要慢, 因此, 每个物种需要的样品数也是不
同的。 最近的研究表明, 取样的地理范围对
DNA条形码的全球应用具有关键的影响 (Berg鄄
sten等, 2012), 因此, 在 DNA 条形码采样时考
虑物种的地理分布范围至关重要。
摇 摇 DNA条形码样品采集策略的制定需要根据研
究目标来确定, 通常不同的研究目标, 样品的采
集策略也不尽相同。 目前关于植物 DNA条形码的
研究主要有两类, 一是对特定科属的 DNA条形码
研究, 即建立特定科属内物种的 DNA条形码参考
数据库, 用于物种的鉴定和新物种的发现等; 二
是基于生态样方或区域的 DNA条形码研究, 即开
展特定区域内的物种组成及生物多样性调查。
摇 摇 基于特定科属的 DNA 条形码研究, 每个物
种采集的样品数量与物种的分布范围相关, 物种
的分布范围越广, 则需要采集的样品数量越多,
这样才能最大限度地代表物种的遗传变异范围。
对于植物 DNA 条形码研究, 每个物种需要的样
品数为 8 ~ 10 个个体, 且至少来自 5 个不同的地
域或居群。 因为来自不同地域和居群的样品
(个体) 比来自相同地域和居群的多个样品 (个
体) 更能代表物种的遗传多样性, 所以用于
DNA条形码研究的材料, 最好采集来自不同地
域和居群的样品, 其来源应尽可能地覆盖物种的
整个分布区。 最好在分布区的中心或主要区域采
集, 尽量避免从分布区最边缘的区域采集。 对于
非狭域分布的物种, 每个居群不多于 2 个个体,
且个体间应保持一定的空间距离或来自不同的生
境, 形态特征上也有一定的代表性。 不同分布范
围的物种建议采集的样品数量见表 1。
植物 DNA条形码的研究材料可以通过野外
采集和馆藏标本检视等途径获得。 选择研究样品
时, 应尽量选择能代表该物种典型形态特征的标
本, 如果能使用模式标本最好 (目前大多数标
本馆是不允许的), 但来自模式标本产地的植物
材料也非常重要。 通常馆藏植物标本的 DNA 降
解比较严重, 较难获得可用于条形码研究的 DNA,
因此, 使用植物馆藏标本有一定的局限性。 野外
采集是获取 DNA 条形码研究材料的主要途径之
一。 用于植物 DNA 条形码的样品原则上不能使
用植物园或公园中栽培的植物材料, 但对于直接
从野外移栽到植物园或公园且来源清楚的植物材
料可谨慎使用。
基于样方或特定区域的 DNA 条形码研究,
其采集的策略与前者不同。 因为特定区域或样方
内的物种, 其种内遗传变异不大, 每个物种采集
2 ~ 3 个个体即可以代表该物种的遗传变异范围。
因此, 我们建议每个物种取 2 个个体, 但不同的
个体间最好保持一定的空间距离 (如不同的海
拔) 或来源于不同的小生境。
2摇 植物标本和野外数据的采集规范
物种的准确鉴定是建立一个可靠的物种鉴定
参考数据库的基础和核心, 因此采集完整、 具有
重要鉴别特征的凭证标本对于开展 DNA 条形码
研究至关重要, 这是物种准确鉴定的基础和保
障。 野外采集植物 DNA 条形码材料应包括物种
的凭证标本、 提取基因组 DNA 的植物材料和植
物本身特征及生境的图像或图片信息等。 每份样
表 1摇 不同分布范围的物种用于 DNA条形码研究的样品采集策略
Table 1摇 Sampling strategy for plant DNA barcoding according to distribution range
分布范围 样品数量 (个体) 取样来源 举例说明
广布种 10 ~ 12 不同区域或居群 全球或洲际分布
区域分布 10 不同区域或居群 东亚或喜马拉雅分布
地区分布 8 ~ 10 不同区域或居群 华东、 华南等
狭域分布 5 不同亚居群 玉龙雪山或金平县
495摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 34 卷
品 (或每号标本) 采集 3 份标本, 用于国内外主
要标本馆间的交换与鉴定。 采集的凭证标本必须
是具有物种重要鉴别特征的完整标本, 应包括根、
茎、 叶、 花、 果和其它鉴别特征 (如芽、 鳞茎、
球根等), 完整的标本有助于对标本的准确鉴定。
由于植物与动物的特性不同, 标本压制后, 很多
鉴别特征会丢失, 如花色和花形等性状。 因此,
在野外需要对标本的重要特征进行记录和拍照,
并进行初步的鉴定 (至少鉴定到属)。 最终, 再
请相关的分类学家进行物种鉴定。 对于体型较大
的植物 (如乔木和灌木等), 要确保采集的若干
份凭证标本来自同一植株; 对于体型较小的植物
(如星叶草 Circaeaster agristis), 最好一份标本采
集多个植株, 但要保证这些不同的植株均来自同
一个小居群。 如何采集凭证标本可以参考 《标
本馆手册》 (Bridson和 Forma, 1992)。
采集的标本还需要填写相关的野外采集信息,
如采集地点、 生境、 压制标本后容易丢失的特征
(如花的颜色、 气味等) 和鉴别特征等。 BOLD提
供了一个标准的 “标本信息电子表格冶 (Ratnas鄄
ingham和 Hebert, 2007)。 由于 BOLD提供的 “标
本信息电子表格冶 主要依据动物的特性设计的,
有些信息并不适用于植物标本。 因此, 我们根据
实际工作需要和植物本身的生物学特性, 在 BOLD
提供的 “标本信息电子表格冶 的基础上进行了
一些必要的调整和补充。 标本采集信息电子表格
文件由三个部分内容组成 (附表 1, http:/ / journal.
kib. ac. cn / UserFiles / File / Excel% 20of% 20field%
20collection%20information(1). xls), 各部分所要
求的信息分述如下。
2. 1摇 标本采集信息 (Collection Data) (表 2)
采集编号 (Collection Number): 采集编号
是指样品在野外采集过程中由采集者对每份样品
给予的编号。 每份样品具有唯一的采集编号, 我
们建议使用采集人的单位英文缩写+采集负责人
拼音首字母+数字 (流水号) 的形式, 如中国科
学院昆明植物研究所 (KIB) 高连明 (GLM) 采
集的标本可编号为: KIBGLM0001, 中国科学院
华南植物园 (SCBG) 葛学军 (GXJ) 采集的标
本可编号为: SCBGGXJ0002, 最好不要采用仅包
括数字的采集编号, 如 001, 232 等, 这样的编
号很容易与其他人的采集编号相同, 而造成后期
数据管理的不便和混淆。
采集人 (Collectors): 是指实际采集标本的
人员。 英文书写方式按姓在前名在后的方式, 如
高连明, Gao Lian鄄Ming。
采集时间 (Collection date): 书写方式为
“日-月-年冶, 月用三个字母缩写, 如采集时间
为 2012 年 9 月 2 日, 写成 02鄄Sep鄄2012。
采集地信息 (Locality information):
包括以下字段信息
国家 (Country): 采集地所属的国家
省 (Province): 填省、 自治区和直辖市一
级, 按国家区划的省级拼音写法书写, 如云南省
(Yunnan), 西藏自治区 (Xizang)。
地区 (Prefecture / Region): 行政区一级, 按
国家区划的行政区拼音写法书写, 如昆明 (Kun鄄
ming), 红河 (Honghe) 等。
区县 ( Country / District): 县区 (县级市)
一级, 如石林县、 五华区、 安宁市等。
具体地点 (Exact Site): 具体的采集地点描
述, 至少到乡镇级或山头, 如双龙乡小河村后
山, 玉龙雪山第一峰。
纬度 (Latitude): 以十进制, 小数点后保留
表 2摇 标本采集信息表
Table 2摇 Excel file of collection data information
5956 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 高连明等: 关于植物 DNA条形码研究技术规范摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
4 位, 如 29. 4300; 或按度 -分 -秒的形式, 如
29毅25忆48义 N。
经度 (Longitude): 以十进制, 小数点后保
留 4 位, 如 102. 3956; 或按度-分-秒的形式,
如 102毅23忆44义 E。
海拔 (Altitude): 单位米 (m), 如3430, 3950。
生境 (Habitat): 所采集样品的生长环境,
如常绿阔叶林内, 高山草甸等。
摇 摇 标本信息 (Specimen details)
植物习性 (Plant Habit): 乔木 ( tree), 灌
木 (shrub), 半灌木 (suffrutex), 木质藤本 ( li鄄
ana), 草质藤本 ( vine), 一年生草本 ( annual
herb), 两年生草本 ( biennial herb), 多年生草
本 (perennial herb), 附生植物 ( epiphyte), 寄
生植物 (parasitic plant)。
植株高度 (Height): 所采集植株的高度,
使用标准的长度单位, 如米 (m), 厘米 (cm) 等。
其它描述 (Description): 用于描述标本突
出的鉴别性状或其它重要信息 (如雌雄同株、
雌雄异株等)。
备注 (Notes): 可以用于记录标本的状况,
如一般标本, 正模标本或副模标本等信息, 也可
以记录标本采集的份数等信息。
摇 摇 野外鉴定 ( Field identification): 在野外鉴
定的物种暂定名。
DNA材料是否采集 (DNA sample): 注明是
否采集了 DNA材料。
整理好的采集信息需要按照一定的格式排版
后, 制作成采集标签, 与标本一起进行装订。 采
集标签的格式可参考图 1。
2. 2摇 标本鉴定信息 (Specimen identification in鄄
formation) (如表 3)
图 1摇 标本的采集标签
Fig. 1摇 Example of the collecting label
摇 摇 分类学信息包括样品所在的目、 科、 属和
种。 按拉丁语正规写法书写。 种 (Species) 的书
写按双名法的格式书写, 即 “属名+种加词冶 及
命名人信息, 如 Rhododendron decorum Franch. 。
此外, 为便于中国学者之间的交流, 还增加了科
中文名和种中文名的字段信息 (表 4)。
物种的名称: 虽然用于植物物种鉴定的工具
书很多, 但为了避免不同的工具书之间存在的异
名问题, 种子植物的物种鉴定名统一以 “Flora of
China冶 为准, 苔藓植物的物种鉴定名称以 “Bry鄄
ophyflora of China冶 为准, 其他孢子植物以现有
《中国孢子植物志》 为准。 “Flora of China冶 出版
后如有新的增补或修订的类群, 可将最新的专著
和修订作为重要参考。 在科及以上等级的归属,
裸子植物按 Christenhusz 等 (2011) 的系统, 被
子植物按 APG 芋系统 (APG, 2009)。
表 3摇 标本鉴定信息表
Table 3摇 Excel file of specimen identification information
695摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 34 卷
摇 摇 样品鉴定人为该样品的具体鉴定人, 书写方
式如前所述; 鉴定日期是指鉴定该标本的具体日
期, 格式如标本采集日期; 联系方式和所在单位
原则上是样品鉴定人的联系方式 (电子邮件地
址) 与所在单位全称; 如果使用的样品是标本
馆的馆藏标本, 应提供可以联系到的具体人员的
联系方式, 以便检视到该标本。
凭证标本经过专家鉴定后, 需要附上鉴定标
签。 鉴定标签中包括的内容除物种的中文名、 拉
丁名、 鉴定人、 鉴定日期等外, 还应包括采集编
号, 以免粘贴鉴定标签时 “张冠李戴冶。 鉴定标
签的格式可参考图 2。
图 2摇 标本的鉴定标签
Fig. 2摇 Example of the identification label
2. 3摇 标本凭证信息 (Voucher information)
(附表 1,参看以下链接: http: / / journal.kib.
ac.cn / UserFiles / File / Excel%20of%20field%
20collection%20information(1). xls)
样品编号 (Sample ID): 样品编号是样品
在进行 DNA条形码实验过程中用到的唯一编号,
可由字母和数字组成。 作者可以根据自己所做的
类群和项目的名称代码来编号, 但应该便于记忆
且最好为连续的编号, 强烈建议使用与采集编号
相同的编号。
凭证标本编号 (Museum ID): 凭证标本编
号是按样品所存放标本馆的编号系统对应的编
号, 不同的标本馆有不同的凭证编号系统, 在标
本馆制作馆藏标本时给予凭证编号。
收藏代码 (Collection code): 如为个人收
藏, 则注明个人收藏代码。
标本存放处 ( Institution storing): 标本目
前存放的标本馆名称或研究机构名称。
样品提供者 (Sample donor): 样品的提供
者指提供样品的人, 如果是研究者, 应提供具体
的姓名。 英文书写方式如前所述。
提供者联系方式 (Donor email): 标本提供
者的电子邮箱, 按标准书写。
以上字段信息中, 样品编号和标本存放处为
必须填写的信息。
3摇 植物标本图像信息的采集规范
植物标本图像信息包括植物在野外生长环境
中拍摄的图像和图片, 能反映该物种的生长环
境、 伴生物种、 植株本身的形态鉴定特征 (如
叶、 花、 果及种子等) 等信息; 也包括凭证标
本的图片信息, 使用的相机像素不低于 500 万像
素, 图像清晰, JPG格式。 图片的一般要求: 生
境照片 1 张、 全株特写 1 ~ 2 张、 形态鉴别特征
3 ~ 5 张; 图片的像素推荐不小于 2048 伊 1536 或
1536伊 2048, 图像的长宽比例为 3 颐 2; 图像的命
名按照采集编号+物种拉丁名+照片内容 (如:
“生境冶、 “植株冶、 “花冶、 “果冶), 如果照片内容
相同, 则在照片内容后加数字加以区分 (如
KIBGLM0001鄄Taxus wallichiana鄄seed 1, KIBGLM0001鄄
Taxus wallichiana鄄seed 2), 并将同一物种的图片
放在一个文件夹内, 文件夹使用采集编号命名。
4摇 植物 DNA材料的采集规范
植物 DNA材料指获取植物基因组 DNA的组
织或器官, 通常采集植物的叶片材料, 当叶片材
料难以获取或被真菌或细菌感染时, 也可以采集
植物的其它组织或器官 (如芽、 花、 果实和种
子等) 用于获取基因组 DNA。 对于叶片容易获
得且不易被真菌等感染的植物, 采集当年生的近
成熟的、 健康的新鲜叶片作为提取基因组 DNA
的材料; 对于植物叶片不易获得或容易被真菌等
感染的植物, 可采集植物的花、 芽或种子等作为
DNA材料。 每份样品 (每号标本) 采集 1份 DNA
材料, DNA材料应采集 3 ~ 5 g 叶片 (鲜重) 或
其它组织和器官材料, 或叶表面积不小于 50 cm2
(尺寸大小约等于成年人的手掌面积), 每号 DNA
材料最好分为 2 份保存。 可以将新鲜的植物
DNA材料置于柔软且透气性较好的纸袋中进行
干燥。 透气的纸袋可以将植物 DNA 材料在干燥
时与硅胶 (干燥剂) 分开, 这样即便植物叶片
因干燥变脆后, 也不会在运输过程中被硅胶挤
碎, 不会与硅胶混杂, 并造成样品间的交叉污
染。 如果没有类似的纸袋也可用塑料的自封袋替
7956 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 高连明等: 关于植物 DNA条形码研究技术规范摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
代, 但植物 DNA 材料就需要与硅胶置于一起进
行干燥。 存放植物 DNA 材料的袋子上要注明采
集编号和采集日期等信息。
由于植物习性多样 (如草本、 藤本、 灌木、
小乔木、 大乔木等), 植物叶片类型复杂 (如纸
质的、 革质的、 蜡质的、 多浆的、 刺状的等),
因此很难制定统一的采集规范。 但在采集植物
DNA材料时应注意以下事项:
4. 1摇 对于体型较大的植物 (如乔木、 灌木和大
型草本植物等), 要确保 DNA 材料与采集的凭
证标本来自相同的植株, DNA 材料的编号与凭
证标本的采集编号必须相同; 对于体型较小的植
物 (小草本或小灌木等), 可采集整个植株作为
DNA材料, 也可采集多个植株作为 DNA 材料,
但不同的植株应采自同一小居群, 且不同植株要
分开保存和干燥, 并赋予不同的编号 (如 KIB鄄
GLM001A、 KIBGLM001B、 KIBGLM001C), 而不
能将不同的植株混在一起进行干燥和保存。
4. 2摇 对于易失水的植物 DNA材料 (如纸质叶或
幼嫩叶片等), 应在野外采集 DNA 材料并立即
进行快速干燥; 对于不易失水的植物遗传物质材
料 (如革质叶或蜡质叶等), 可在采集后放置一
段时间 (在叶片失水前), 然后再进行干燥, 但
最好在采集后立刻干燥; 对于难于用硅胶快速干
燥的遗传物质材料 (如较厚或具多浆的叶片或
种子等), 可将这些材料碎成小片 (块) 后用硅
胶快速干燥。
4. 3摇 为保证遗传物质材料能快速干燥, 同一份
遗传物质材料不易过多。 如需采集较多量的遗传
物质材料, 可分别放入不同的纸袋中进行干燥。
5摇 植物 DNA材料的干燥与保存规范
为确保植物材料中的基因组 DNA的完整性,
植物 DNA材料采集后需要快速干燥, 目前快速
干燥植物 DNA材料的最佳方式是硅胶 (一种干
燥剂), 能够使植物材料在短时间内快速脱水,
并且对 DNA的损伤较小。 干燥用的硅胶最好是
粉末状的白色硅胶 (直径为 20 ~ 30 魡) 与变色硅
胶 (蓝色) 混合使用, 粉末状硅胶能最大限度
地与植物材料接触, 可快速使植物材料脱水干
燥, 变色硅胶不但可以脱水, 还可以清楚地指示
硅胶的干燥状态, 了解植物 DNA 材料的干燥程
度, 但由于变色硅胶为直径较大的圆形颗粒
(通常直径为 1. 5 ~ 3 mm), 与植物 DNA 材料接
触面较粉末状的硅胶小, 植物材料脱水干燥的时
间要长一些。 没有粉末状硅胶的情况下也可以完
全使用颗粒状的变色硅胶干燥植物 DNA材料。
5. 1摇 植物 DNA材料的干燥规范
将新采集的植物 DNA 材料放入透气良好的
纸袋中并密封, 然后置于密封性能好的干燥箱
(或盒), 并放入足够的硅胶 (使硅胶覆盖全部
的遗传物质材料) 进行快速干燥; 在没有干燥
箱 (盒) 的条件下, 将植物遗传物质材料放入
透气良好的纸袋中并密封, 然后放入塑料的自封
袋中并加入足够量的硅胶进行快速干燥; 如果使
用塑料的密封袋干燥植物 DNA 材料, 则需要将
颗粒状的变色硅胶与植物 DNA 材料放在密封袋
一起干燥。 如果变色硅胶变为粉红或红色, 要及
时更换硅胶, 直到变色硅胶保持为蓝色, 表明遗
传物质材料已完全干燥。
5. 2摇 硅胶干燥的植物 DNA材料保存规范
干燥好的 DNA 材料可根据采集编号或保存
编号进行排列, 将有植物材料的纸袋密封好放入
到密封盒中, 有开口的一侧朝上, 然后再放入少
量的变色硅胶进行保存; 对于易碎的纸质叶或质
地较薄的叶片材料用透气性较好的纸袋保存, 并
防止相互挤压; 定期检查变色硅胶的颜色, 保持
变色硅胶始终为蓝色, 以防止遗传物质材料再度
吸水; 植物 DNA材料保存的条件为: 温度 (4 ~
15 益)、 湿度 (相对湿度小于 10% ~30%), 如果
没有相应的保存条件, 可在室温下保存, 但一定
保持在通风条件良好且干燥的环境下; 植物 DNA
材料也可以在低温 (-20 益) 或超低温 (-80 益)
条件下保存, 但需要保持 DNA材料的干燥状态;
由于植物 DNA材料 (如叶片等) 很难长期保存,
如在室温下保存超过 2 年的植物 DNA 材料其基
因组 DNA就会发生降解, 因此建议最好保存总
DNA。 将保存在干燥密封盒中的植物 DNA 材料
编号等信息的标签贴在密封盒外面的相应区域,
便于查找或检索。
6摇 植物总 DNA的质量标准及保存规范
目前, 植物总 DNA 提取的方法很多, 传统
上主要有 CTAB法、 SDS 法、 低盐高渗法。 近年
895摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 34 卷
来出现了以螯合树脂、 特异性 DNA 吸附膜、 离
子交换纯化柱及磁珠或玻璃粉吸附等为基础的植
物 DNA 提取新方法, 并开发出了许多种商业用
植物总 DNA提取的试剂盒。 研究表明, 在植物
总 DNA 的提取方法中, CTAB 法和试剂盒法对
大部分野生植物均能得到较高质量的 DNA, 但
有时 CTAB法得到的总 DNA 纯度较低, 还需要
进一步纯化, 但成本比较便宜; 而试剂盒法提取
DNA操作简单、 高效、 DNA 质量较高, 但价格
昂贵, 且得率较低 (刘杰和高连明, 2011)。 高
速离心密度梯度法是获取大量高质量基因组
DNA的一种有效的方法, 但由于成本昂贵, 需
要专用的设备, 当前使用并不普遍, 但是该方法
是建立 DNA库所选用方法的最佳选择。 经典的
CTAB法是由 Doyle 和 Doyle (1987) 提出, 后经
过多位学者的改良, 是目前使用最为普遍的一种
植物总 DNA提取方法。
植物总 DNA作为一种重要的遗传物质材料
用于保存, 不但要求总 DNA 有很高质量, 而且
还能够长时间保存, 因此, 总 DNA 本身在完整
性、 纯度、 浓度和含量等方面需要达到一定的标
准和要求。 完整性: 基因组 DNA 长度大于 15
kb; 纯度: 1. 7 检测为单一明亮的 DNA 条带, DNA 限制性酶切
反应产物琼脂糖凝胶电泳检测为均匀弥散状
DNA; 浓度: 总 DNA 浓度不小于 100 ng·滋L-1,
体积不少于 100 滋L; 含量: 每个保存样本的总
DNA含量应大于 10 滋g。
植物总 DNA的保存最好以干粉状态保存, 如
果总 DNA以溶液形式保存, 则用 1伊TE缓冲液稀
释, 且 TE的缓冲液的 pH值为 8. 0 ~8. 5之间; 植
物总 DNA 低温保存最好在-80 益以下或液氮保
存, 无条件的也可在-20 益保存; 总 DNA应避免
经常冻融; 同时建议每份样品保存 3 ~ 5 个样本。
此外, 植物总 DNA还需要定期检测与更新, 每隔
2年一次, 随机抽样检测保存的样品, 若检测结
果不符合上述总 DNA的保存要求, 则按以上的规
范, 重新采集、 提取、 测定与保存样品。
7摇 植物标准DNA条形码的选择与通用引物
虽然 COI 基因作为动物的通用条形码已得
到了广泛应用, 但并不适合作为植物的 DNA 条
形码。 国际生命条形码联盟植物工作组 (CBOL
Plant Working Group, 2009) 通过对 7 个叶绿体
DNA片段的综合分析评估, 最后推荐 rbcL 和
matK组合作为陆地植物的核心 DNA条形码, 用于
植物物种鉴定的统一框图。 此外, 在第三届国际生
命条形码大会上, 提出 ITS (包括 ITS2) 和 trnH鄄
psbA可作为植物条形码的辅助条形码, 并建议在
18个月内进行进一步的评估 (Hollingsworth 等,
2011)。 中国植物条形码研究组 (China Plant BOL
Group) 根据对主要来自中国的种子植物 75 科 141
属 1 757种共约 6 286个样本的 4个 DNA候选条形
码片段 (rbcL, matK, trnH鄄psbA和 ITS) 的综合分
析, 建议 ITS (或 ITS2) 也作为种子植物的核心条
形码之一, 提出 rbcL +matK + ITS 组合 (Li 等,
2011a)。 鉴于 trnH鄄psbA片段在多数植物类群具有
较高的通用性和物种分辨率, 在此我们也提供了该
条码的相关信息, 便于相关研究人员参考使用。
我们将目前推荐的 4 个植物 DNA 条形码和
推荐使用的主要引物的名称、 引物序列、 来源及
适用的类群进行了总结 (表 4)。 在植物的 4 个
DNA条形码中, rbcL 片段所推荐的 2 对引物均
具有很高的通用性, 可以选择其中的任何 1 对引
物用于条形码的扩增和测序。 针对 matK 引物通
用性较差的问题, 由国际生命条形码植物工作
组主席 Hollingsworth 教授领导的 matK 指导组
(matK Steering Group) 对陆地植物中不同植物类
群 (如苔藓植物、 蕨类植物、 裸子植物和被植
物等) 开发了专门的 matK 引物, 并给出了相应
的扩增及测序的实验程序和反应条件, 相关引物
信息见表 4, 具体的反应条件和实验程序可参考
下面网址中的相关 PDF 文件 ( http: / / connect.
barcodeoflife. net / group / plants)。 ITS 在种子植物
中的通用性较低 (Li等, 2011a), 今后还需要开
发在陆地植物中通用性更高的 ITS 引物。 表 4 中
列出的 ITS引物是目前种子植物中通用性较高的
引物组合, 对某些特定类群使用的引物本文中没
有列出, 研究人员可以参考相关的文献。 ITS 片
段的三个正向引物 ( ITS5, ITS5a 和 ITS1) 均可
以与反向引物 ITS4 组合进行 PCR 反应 (表 4),
其通用性高低在不同类群间可能存在差异, 研
究者可根据特定研究类群确定使用哪个引物组
合。 本文中也提供了一对裸子植物的 ITS引物组合
9956 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 高连明等: 关于植物 DNA条形码研究技术规范摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
006摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 34 卷
1066 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 高连明等: 关于植物 DNA条形码研究技术规范摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
(ITS鄄Leu / ITS4), 其通用性是目前最高的一对引
物。 裸子植物的 ITS 序列长度变异极大, 作为
DNA条形码并不合适, 但其变异区主要存在于
ITS1基因间区 (变异范围为 630 ~ 3 125 bp), 而
ITS2的长度变异不大 (225 ~ 255 bp) (Liston 等,
1996; Gernandt和 Liston, 1999), 因此, ITS2可作
为裸子植物的 DNA条形码 (Yao等, 2011)。 表 4
中列出的 2 对 ITS2 的引物均具有很高的通用性。
辅助条形码 trnH鄄psbA 推荐的引物通用性高, 可
用于绝大部分陆地植物。
8摇 DNA条形码的扩增与测序
通过 PCR扩增和测序过程获取 DNA 条形码
序列, 建立物种鉴定的参考数据库, 以便开展后
续的 DNA条码分析和物种鉴定工作。 PCR 扩增
成功与否是获得 DNA条码序列的关键步骤。
8. 1摇 DNA条形码的扩增
PCR扩增体系中, 聚合酶非常重要。 现在
使用的聚合酶种类很多, 其功能也有所不同, 有
些可以提高降解 DNA 的 PCR 扩增, 如 Restorase
和 Restorase II 酶 (Sigma); 有的可以缩短 PCR扩
增反应时间, 如 Z Taq酶 (Takara), 一次 PCR扩
增反应只需 20 min; 有的酶则可以提高 DNA复制
的准确性, 如 Puhsion Taq (BioLabs), DeepVent
Taq酶 (NEB) 和Diamond Taq酶 (Bioline) 等。 因
为 Invitrogen公司生产的 Taq 聚合酶 (Platinum襆
Taq DNA Polymerase) 比其它 Taq 酶的扩增效果
好, 已成为 CCDB 的标准酶, 但价格相对较高。
我们建议选择可以提高 DNA 复制的准确性的聚
合酶, 如 Puhsion Taq (BioLabs), 不仅可以提高
PCR的扩增效率, 对含有单核苷酸重复序列可
以提高序列的读长 (Fazekas等, 2010)。 国外公
司的 Platinum Taq ( Invitrogen) 和 Biolase Taq
(Bioline), 以及国内天根生化科技有限公司
(TIANGEN) 的 Taq DNA Polymerase 扩增效率和
复制准确性也较高。
8. 2摇 PCR反应体系
在开展 PCR扩增的过程中, 所有的 PCR 试
剂都需要使用灭菌消毒的吸头或过虑吸头, 以免
污染, 移取 Taq 酶和其它试剂时, 要用无菌吸
头, 实验中还要设置阴性对照和阳性对照。
有关 matK基因在不同陆地植物类群中的 PCR
扩增与测序的反应体系及反应程序参考 http: / /
connect. barcodeoflife. net / group / plants。 本文仅给
出其它三个 DNA 条形码的反应体系。 我们推荐
使用 20 滋L 的 PCR反应体系, 具体如表 5。
表 5摇 PCR反应体系
Table 5摇 The reaction system of PCR
Reagents 1 reaction/ 滋L
100 reactions
/ 滋L
10 伊 buffer 2. 0 200
50 mM MgCl2 1. 0 100
10 mM dNTPs 0. 8 80
10 滋M Forward Primer 0. 25 25
10 滋M Reverse Primer 0. 25 25
Polymerase (5 U / uL) 0. 2 20
ddH2O 4. 5 450
Additives (10% Trehalose) 10 1000
Total 19 1900
DNA template (10-50 ng·滋L-1) 1. 0 per reaction
海藻糖 (trehalose) 是一种广泛使用的 PCR
优化剂。 将它加入到 PCR 反应体系中, 即可以
降低 DNA熔融温度, 又可以使 Taq 聚合酶更稳
定, 消除 DNA抑制物对 PCR 扩增的影响, 提高
PCR扩增成功率, 还可以增加序列的读取长度。
在大多数类群中不使用优化剂也可获得很高的
PCR扩增效率, 但使用优化剂往往会提高 PCR
扩增效率。 此外, 其它 PCR 优化剂还有 DMSO,
BSA和 Betaine等, 在不同的 DNA条形码或类群
中效果可能不同, 可选择使用。
8. 3摇 PCR反应条件
rbcL, trnH鄄psbA和 ITS ( ITS2) 三个条码的
PCR反应条件不尽相同, 且在不同的类群中所
要求的反应条件也可能不同, 在此只给出三个
DNA条码在我们实验室中扩增效率最高的程序,
供参考。
rbcL 的 PCR反应程序:
95 益 4 min; [35 cycles: 94 益 30 s; 54 益 1
min; 72 益 1 min]; 72 益 10 min; 4 益 肄。
trnH鄄psbA的 PCR反应程序:
95 益 4 min; [35 cycles: 94 益 30 s; 55 益 1
min; 72 益 1 min]; 72 益 10 min; 4 益 肄。
ITS 的 PCR反应程序:
被子植物: 94 益 4 min; [35 cycles: 94 益 45 s;
206摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 34 卷
50 益 1 min; 72 益 1 min]; 72 益 10 min; 4 益 肄。
裸子植物: 94 益 4 min; [35 cycles: 94 益 1
min; 52 益 1. 5 min; 72 益 2 min]; 72 益 10 min;
4 益 肄。
ITS2 的 PCR 反应程序:
94 益 3 min; [35 cycles: 94 益 30 s; 52 益 30
s; 72 益 45 s]; 72 益 7 min; 4 益 肄。
8. 4摇 PCR产物的检测与纯化
PCR产物可以用琼脂糖凝胶电脉进行检测,
大多数实验室都使用这种方法。
为去除 PCR产物中未结合的核苷酸和剩余引
物, 需要对 PCR产物进行纯化。 如果不进行产物
纯化, 那么序列前 50个左右碱基在测序反应中将
无法正确解读, 因此, 测序反应前必须要对 PCR
产物进行纯化。 PCR产物纯化的方法有多种, 如
用试剂盒纯化 (有很多公司提供相关的产品)、
酶消化法纯化等。 我们在此推荐使用 ExoSAP鄄IT
(USB Corporation, USA) 酶消化法纯化。 反应步
骤如下: 将2 滋L的 ExoSAP鄄IT (稀释10倍) 加入
到 5 滋L 的 PCR 产物中混合, 然后 37 益温育 30
min以降解多余的引物和核苷酸, 然后在 80 益温
育 15 min使 ExoSAP鄄IT酶失活, 纯化后的 PCR产
物可直接用于测序反应, 这种方法可在 PCR 仪
上完成, 比使用试剂盒的方法简单快速。
8. 5摇 测序反应体系
为了获取可靠的 DNA 条形码序列, 每个
DNA条形码必须对正反两个引物进行测序。 为
得到较好的测序结果的同时减少成本, 原始的
BigDye可稀释 24 倍后进行测序反应。 如果 PCR
产物浓度过高, 可在测序前定量 PCR产物浓度,
加水稀释至 25 ng·滋L-1。 我们推荐使用 5 滋L 的
测序反应体系, 具体如表 6。
表 6摇 测序反应体系
Table 6摇 Sequencing reaction system
Reagents 1 reaction/ 滋L
100 reactions
/ 滋L
5 伊 buffer 1. 0 100
10 滋M primer 0. 5 50
BigDye 0. 3 30
ddH2O 2. 2 220
Total 4 400
Purified PCR product 1. 0 per reaction
摇 摇 如果在 PCR 扩增反应中使用了优化剂, 建
议在测序反应中也加入相同的优化剂, 加入的比
例与 PCR反应相同, 这样通常会提高测序的成
功率和序列读长。
8. 6摇 测序反应条件
96 益变性 10 s, 50 益退火 5 s, 60 益延伸 4
min, 共 32 个循环。
8. 7摇 测序产物纯化
目前, 测序反应产物纯化方法主要包括酒精
沉淀 (ethanol precipitation), 磁珠吸附 (magnetic
bead) 或交联葡聚糖 (Sephadex鄄based)。 磁珠吸
附方法适用于高通量设备, 具有更高的灵敏度,
可以减少测序反应中使用的 BigDye 的用量, 从而
减少测序成本。 而交联葡聚糖方法适用于低或中
等通量设备, 廉价且可靠。 酒精沉淀很多实验室
也经常使用, 效果也不错。 纯化后的测序产物可
使用测序仪进行序列测定 (如 Applied Biosystems
3730或 3730xL DNA Analyzer; Applied Biosystems)。
9摇 条形码数据的命名、 编辑和提交规范
因为植物有多个核心 DNA条形码, 为了规范
植物 DNA条形码序列的命名, 我们对不同植物
DNA条形码给予统一的缩写格式 (参考 CBOL
Plant Working Group, 2009; Li等, 2011a)。 各条
码的缩写为: rbcL (R), matK (M), trnH鄄psbA
(P), ITS (I) 和 ITS2 (I2)。 正反向引物的命名
原则为正向引物 ( Forward) 为 F, 反向引物
(Reverse) 为 R。
9. 1摇 DNA条形码序列的命名
获得 DNA条形码序列的原始峰图文件 (trace
file) 后, 需要对这些原始文件和编辑后的文件进
行命名和分析。 原始峰图文件的命名原则为:
DNA条形码缩写字母+样品编号 (Sample ID)+引
物方向, 中间以下画线分开。 如样品编号为
KIB002样品的 rbcL片段正反两个引物的原始峰图
文件的命名分别为: R_KIB002_F 和 R_KIB002_
R。 对于编辑好的序列文件的命名原则为: DNA
条形码缩写字母+样品编号 (Sample ID), 中间
以下画线分开, 如 R_KIB002。
9. 2摇 序列编辑
序列编辑软件使用最广泛的是 SequencherTM
(Gene Codes Corporation), SeqScape襆 ( Applied
3066 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 高连明等: 关于植物 DNA条形码研究技术规范摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Biosystems) 和 DNA Star (Lasergene襆)。 我们建
议使用 Sequencher进行序列编辑, 先剪去序列两
端不可靠的碱基序列和引物序列, 然后再将正反
两个引物的序列进行比对 ( assemble), 对序列
进行编辑最后获得正反引物序列一致的 ( con鄄
sensus) DNA 条形码的序列。 编辑好的 DNA 条
形码序列保存为 fasta格式 (* . fasta)。
条码序列长度原则上越长越好 (紧接着引物
开始), 最好不要短于引物后的 20 bp。 如果反向
引物能够测通整条序列, 建议 DNA条形码序列从
引物区以后保留, 如果反向引物不能够测通整条
序列, 建议在引物区后尽量保留更多的可靠碱基
的序列, 即在不确定区之后开始保留, 如图 3。
9. 3摇 序列比对
目前很多序列比对软件, 如 Clustal, Bioedit
和 Mega等都可用于条形码基因序列比对, 可根
据自己的喜好选择使用。
9. 4摇 序列质量与矩阵核查
获得的 DNA条形码原始峰图应清晰可辩, 无
干扰峰 (图 3)。 原始序列质量的评价使用软件
Sequencing Analysis 5. 3. 1 (Applied Biosystems),
即在 20 bp的窗口内, 平均 QV值设定为逸20 时,
修剪后的序列应长于原始序列读长的 50%。 序列
拼接时要求正反引物重叠序列区长于 100 bp, 并
且不确定的碱基数小于 1% (Li等, 2011b)。
对于比对好的序列, 需要检查该序列中是否
存在测序仪读取或编辑时造成的错误。 对于编码
基因 ( rbcL和 matK) 来说, 检查矩阵中是否有
非 3 倍整数或大片段的插入 /缺失, 翻译的氨基
酸是否有提前终止密码子等, 排除假基因及可
能的污染序列。 对于非编码片段 (ITS和 trnH鄄
psbA), 由于种间可能存在较大的碱基或长度差
异, 矩阵排列可能相对困难, 检查时应更仔细。
首先对同种的不同个体进行排列, 检查是否存在
私有的变异位点 (只发生在单个个体中), 回去
检查原始峰图确认该私有变异位点是否真实存
在; 然后再对近缘种进行排列, 以相同的方法进
行检查, 这样可以最大限度地避免仪器错读或编
辑时发生的错误。
10摇 DNA条形码数据分析
DNA条形码数据的分析使用最多的方法有
BLAST法, 距离法 (distance) 和建树法 (Tree鄄
building)。 其中 BLAST 法得到的物种鉴定率最
高, 尤其在使用组合片段进行物种鉴定时, 显著
高于其它方法得到的物种鉴别率, 而距离法与
建树法得到的物种鉴别率相差不大 ( Li 等,
2011a)。 我们推荐使用距离法和建树法用于
DNA条形码数据的分析。 经序列比对和人工校
对后, 通过MEGA或 PAUP等软件可计算种内和
种间的 Kimura鄄2鄄parameter distance (K2P) 遗传
距离。 根据该距离模型构建 NJ 树 (Neighbour鄄
joining tree)。
10. 1摇 遗传距离计算
种间距离通常采用 pairwise uncorrected p鄄dis鄄
tance (Newmaster等, 2008) 或 Kimura鄄2鄄parameter
distance (K2P) (Meyer和 Paulay, 2005; Lahaye等,
2008) 模型计算。 K2P 距离是生物条形码联盟
(CBOL) 推荐使用的距离计算模型 (barcoding.
si. edu / )。 种内遗传距离通常采用 3 种参数表示
(Meyer 和 Paulay, 2005; Lahaye 等, 2008): K2P
距离, 平均 兹值和平均溯祖度 (average coalescent
图 3摇 trnH鄄psbA片段引物 trnH的原始峰图。 灰色标记区示引物区, 白色标记框内示碱基不确定区
Fig. 3摇 The chromatogram of primer trnH for trnH鄄psbA region
The grey highlight region shows primer region, and white rectangle shows ambiguous region
406摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 34 卷
depth)。 其中平均 兹值是指每个物种内不同个体
间的平均 K2P 距离, 目的是消除不同物种因采
样个体数不均引起的偏差; 平均溯祖度是指物种
内所有个体间最大的 K2P 距离, 用以反映种内
最大变异范围。 K2P距离可以通过 MEGA或 PAUP
计算, 在此基础上计算其余两个参数。
10. 2摇 系统树构建
DNA条形码分析中通常采用标准的系统树构
建方法 (如 NJ、 UPGMA、 ML、 MP、 Bayes)。 建
树的目的并不是利用条形码重建系统发育树, 而
是为了检验每个物种的单系性, 即同一物种的不
同个体能否紧密聚类到一起。 不同的建树方法可
能得到不同的物种分辨率, 但不同方法得到的结
果差别并不大。 此外, 不同方法的运算时间差别
很大, 而且适用的条件不同, 在使用时应根据需
要进行选择。 目前使用最多的建树方法是 NJ法。
11摇 植物 DNA条形码研究展望
DNA条形码概念自 Herbert等 (2003) 首次
提出后, 在近十年时间内得到了快速发展, 已广
泛应用于物种的分类和鉴定、 发现新种和隐型
种、 生态监测及生物多样性编目等研究领域, 表
现出强大的生命力。 虽然我国开展 DNA 条形码
的研究起步较晚, 特别是植物 DNA 条形码的研
究到 2008 年才真正开始, 但发展十分迅猛, 发
表了系列的相关文章, 并参与了国际植物核心
DNA条形码的评估与推荐, 相信不久的将来我
国在国际生命条形码研究中会发挥更大的作用。
中国是全球生物多样性极为丰富的国家之
一, 拥有约 10%的全球植物物种, 在全球生物
多样性研究中占有重要的地位 (Yang 等, 2005)。
2010 年 10 月日本名古屋联合国 《生物多样性公
约》 第 10 次缔约方大会更新版 《全球植物保护
战略 》 ( Global Strategy for Plant Conservation:
GSPC) 明确提出, 到 2020 年完成世界在线植物
志 (World Flora Online) 的战略目标, 这既是机
遇也是挑战。 而 iFlora将现代植物学、 DNA测序
技术和信息技术的结合, 通过系列的关键技术的
集成和攻关, 构建便捷、 准确识别植物和掌握
相关数字化信息的新一代植物志 (李德铢等,
2012), 是在这一战略目标基础上的创新和发
展, 将表现出更大的生命力。 通过相关关键技术
的集成将极大促进植物分类学、 分子系统学、 演
化生物学、 生态学、 保护生物学、 生物地理学等
学科的发展。
致谢摇 感谢英国爱丁堡皇家植物园 Pete Hollingsworth 教
授和 Alan Forrest博士提供的相关信息和有益讨论。
也参摇 考摇 文摇 献页
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