全 文 ：TaqMan 荧光定量 RT-PCR 检测水稻 RAc1
基因 mRNA 方法的建立
?
高 东 , 王云月 , 何霞红 , 李成云 , 朱有勇??
(云南农业大学农业生物多样性应用技术国家工程研究中心 , 农业生物多样性和控制病虫害
教育部重点实验室 , 云南省植物病理重点实验室 , 云南 昆明 650201)
摘要 : 构建包含 RAc1 基因 cDNA 片段的质粒 , 作为水稻肌动蛋白基因 RAc1 之 mRNA 定量检测的标准品 ,
建立检测方法 , 为水稻其他基因的定量建立内参。从水稻叶总 RNA 中逆转录扩增总 cDNA , PCR 扩增 RAc1
基因中设计的目的片段 , 将纯化的目的片段与 pMD19-T Simple载体进行连接 , 转化宿主菌 JM-109 , 提取重
组质粒 DNA , PCR 鉴定并测序分析。纯化质粒并检测 260 nm吸光值 , 确定重组质粒原液的拷贝浓度并以
此制备荧光定量 PCR 梯度浓度标准品 , 进行实时荧光定量 PCR 实验。建立了 RAc1 基因 mRNA 表达实时荧
光定量 PCR 检测方法 , 特异性好 , 检测灵敏度达 102 拷贝 , 线性范围为 102 ～107 拷贝 , 阈值循环数 (Ct)
与 PCR 体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系 ( r= 1 .000 ) , 扩增效率高 (E = 98 .2% )。建
立了基因 RAc1 实时定量 PCR 的质粒标准品。
关键词 : 水稻 ; 肌动蛋白 ; 基因表达 ; 实时定量 RT-PCR; TaqMan探针
中图分类号 : Q 943.2 文献标识码 : A 文章编号 : 0253 - 2700 (2009) 01 - 075 - 07
Establishment of Real-time TaqMan-Fluorescence Quantitative
RT-PCR Assay for Detection and Quantification of
mRNA Expression of RAc1 of Rice
GAO Dong, WANG Yun-Yue, HE Xia-Hong, LI Cheng-Yun, ZHU You-Yong**
( The National Center for Agricultural Biodiversity, Ministry of Education Key Laboratory of Agricultural Biodiversity for Plant
Disease Management, Key laboratory of Plant Pathology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201 , China)
Abstract: The cDNA was cloned as the standard for real-time quantifyingmRNA of RAc1 of riceandtheTaqMan fluores-
cence quantitative PCR assay for detecting RAc1 geneexpressionwas established as internal control genefor detectingother
gene expression of rice . Total RNA extracted fromleaf of rice was reverse transcribed to cDNA . The prospective amplicon
was amplifiedand purified, then was ligated with pMD19-T Simplevector and transformed intobacteriumJM-109 . Plasmid
DNA extracted from positive cloneswere verified by PCR amplification and sequenced . Theconcentration of purified DNA
template was detected by analyzing absorbance in 260 nm and then thecombined plasmidwas diluted to series as standard
for FQ-PCR . RAc1 was amplified by real-timefluorescence quantitative PCR fromthe plasmid DNA . Themethodof RAc1
mRNA real-time PCR was well established, which detectedas lowas 102 copieswith the linear range from102 to107 cop-
ies . The standard curvesshowed high correlations (r= 1 .000) and PCR efficiency ( E= 98.2 % ) . A series of standards for
real-time PCR analysis had been constructed successfully, and real-time TaqMan-Fluorescence Quantitative RT-PCR was
reliable toquantitatively evaluatemRNA of RAc1 of rice . Furthermore, RAc1 geneasthe internal control genefor detecting
云 南 植 物 研 究 2009 , 31 (1) : 75～81
Acta Botanica Yunnanica DOI : 10 .3724?SP. J . 1143 .2009.08142
?
?? ?通讯作者 : Author for correspondence; E-mail : yppl@ public.km. yn. cn; Tel : + 86 - 871 - 5227872
收稿日期 : 2008 - 07 - 19 , 2008 - 10 - 08 接受发表
作者简介 : 高东 ( 1978 - ) 男 , 在读博士研究生 , 从事遗传多样性控制作物病害及种质资源持续保护利用等工作。 ?
基金项目 : 国家 973 计划项目 (2006CB100200)
other gene expression of rice .
Key words: Rice; Actin; Gene expression; Real-time RT-PCR; TaqMan probe
水稻是单子叶植物的模式生物 , 因此 , 水
稻诸多基因表达量的研究就显得尤为重要。弄清
楚各基因的表达情况 , 对提高作物的产量具有重
要的意义。 RAc1 是水稻的一个肌动蛋白基因 ,
其在水稻不同类型的细胞和组织内中度、稳定表
达 , 而且其表达量近似 , 无显著性差别 ; 表达水
平与细胞周期以及细胞是否活化无关 ; 不受任何
内源性或外源性因素的影响 (McElroy等 , 1990)。
正确选择内参基因 , 很大程度上依赖于所研究的
细胞或组织 , 而寻找适合各自实验系统的特异性
稳定表达的内参基因尤为重要 (Lossos等 , 2003;
Radonic等 , 2004 )。
实时荧光定量 PCR ( fluorescence quantitative
PCR , FQ-PCR) 技术是近几年开发成功的准确的
基因定量方法 , 与 Northern印迹法、斑点印迹法
相比 , 具有准确、敏感、简便等特点 ( Orlando
等 , 1998; 阳成波等 , 2003; 欧阳松应等 , 2004 )。
其中 TaqMan 荧光探针法引入了特异性的探针 ,
利用 Taq酶的 5′→3′核酸外切酶活性使报告基团
和淬灭基团分离 , 进而实时监测荧光信号。Taq-
Man探针法可避免非特异产物产生荧光信号 , 克
服了荧光染料 SYBR Green I 在此问题上的缺陷 ,
使得检测结果更为准确 ( Holland 等 , 1991 )。本
研究旨在通过 T-A 克隆法克隆水稻肌动蛋白基因
RAc1 的目的片段 cDNA , 为 RAc1 基因的 mRNA
实时荧光定量检测提供质粒标准品 , 可作为水稻
其他基因定量检测的内标。
1 材料与方法
1 .1 材料
多糖多酚植物总 RNA 快速提取试剂盒 (北京百泰克
生物技 术有 限公司 ) ; RT-PCR 体 系 ( Invtrogen Super-
ScriptTM III First-Strand SynthesisSystemfor RT-PCR) ; 多功能
DNA 纯化回收试剂盒 (北京百泰克生物技术有限公司 ) ;
TaKaRa EX Taq? ( DRR100A)、dNTP Mixture (各 2 .5 mmol?
L)、DL2000 DNA marker、pMD19-T Simple 载体系统试剂
盒 (D102A)、感受态细胞 JM-109 (D9052)、Amp、X-Gal、
IPTG 、Premix Ex TaqTM ( DRR039 ) 均购自宝生物工程
(大连) 有限公司 ; 小量质粒抽提试剂盒购自上海华舜
生物工程有限公司 ; 梯度 PCR 仪 Eppendorf 5333 PCR Mas-
tercycler Gradiet ( 德国 ) ; 实时荧光定量 PCR 仪 iCycler
iQTM (伯乐 ) , 紫外凝胶分析系统 (伯乐 ) ; GeneAmp Se-
quence Detector 5700、Sequence Detection System 为 Applied
Biosystems公司产品。
1 .2 引物、探针的设计与合成
根据 RAc1 基因的 GenBank Accession ( X16280 ) 在
GenBank中查找其序列 , 用 Primer Express Versions 2 .0 设
计 RAc1 的 TaqMan引物及探针 , 并通过 NCBI 中的 Blast
功能 , 初步检测引物和探针的特异性。引物及探针序
列 : 上游引物 : 5′-TGGTATGGTCAAGGCTGGGT-3′; 下游
引物 : 5′-CGACGTAGGCGTCCTTCTG-3′; TaqMan荧光探针
序列 : 5′- (FAM) CCCTCGCCACACCGGTGTCA ( TAMRA )-
3′。引物及探针由中国科学院上海闪晶分子生物科技有
限公司合成。
1 .3 方法
1 .3 .1 RNA 的提取及纯化 按试剂盒说明提取水稻叶
的总 RNA , 加 30μl DEPC 处理水溶解沉淀 , 琼脂糖凝胶
电泳鉴定 RNA 的质量 , - 80℃保存备用。
1 .3 .2 逆转录反应 (RT ) 用 Invtrogen SuperScriptTM III
First-Strand Synthesis System for RT-PCR Kit 进行逆转录反
应。使用前混匀、短暂离心各组分。配制 RNA、引物混
合体系 : 2μl 的 Total RNA , 1μl 的 50μmol?L oligo (dT) 20 ,
1μl 的 10 mmol?L dNTP mix, 6 μl 的 DEPC-treated water,
65℃温育 5 min, 迅速放于冰中至少 1 min; 配置 cDNA 合
成混合体系 : 2μl 的 10×RT buffer, 4μl 的 25 mmol?L MgC-
l2 , 2μl 的 0.1 mol?L DTT, 1μl 的 RNaseOUTTM , 1μl 的 Su-
perScriptTM III RT ; 将 10μl cDNA 合成混合体系加到 RNA、
引物混合体系中 , 离心混匀。50℃温育 50 min。85℃ , 5
min终止反应 , 迅速放于冰中。短暂离心 , 加入 1μl 的
RNaseH, 37℃温育 20 min。 - 20℃保存或立即用于 PCR。
1 .3 .3 PCR 扩增 20μl 的扩增反应体系中 : 13 .5μl
ddH2 O; 2μl 10 Ex Taq Buffer (Mg2 + Plus) ; 1 . 6μl 2 .5 mmol?
L 的 dNTPs; 0 . 4μl Forward Primer; 0 . 4μl Reverse Primer;
0 . 1μl TaKaRa Ex Taq (5 U?μl ) ; 2μl cDNA。扩增参数为 :
95℃ , 预变性 10 min, 95℃变性 30 s, 60℃退火 30 s, 共
40 个循环 ; 72℃延伸 3 min。
1 .3 .4 RAc1 PCR 产物的纯化 配制 1% 琼脂糖凝胶 ,
取 20μl PCR 产物与 4μl 6×载样缓冲液混合 , 5 V?cm电
泳 30 min左右。在长波紫外灯下用干净刀片切下含 122
bp条带的胶块 , 尽量切除不含 DNA 的凝胶 , 得到的凝
胶越小越好。将切下含 DNA 的凝胶放入 1 .5 ml 的离心
管 , 称出含 DNA 的凝胶重量。按多功能 DNA 纯化回收
试剂盒使用说明书纯化 PCR 产物。
67 云 南 植 物 研 究 31 卷
1 .3 .5 RAc1 cDNA 目的片段与 pMD19-T Simple载体的连
接 在微量 PCR 管中配制下列组份 , 全量为 10μl。5
μl Ligation Mix (使用前冰中融化充分振荡混匀 )、 1μl
pMD19-T Simple Vector、1μl 目的片断 (约 0 .2 pmol )、3μl
ddH2 O, 16℃连接反应 30 min。
1 .3 .6 转化 全量 10μl 加入至 100μl JM-109 感受态细
胞 (使用前冰中融化 ) 中 , 冰中放置 30 min。42℃加热
45 s 后 , 再在冰中放置 1 min。加入 890μl SOC 培养基 ,
37℃ , 150 rpm, 振荡培养 60 min。涂布于含有 X-Gal ( 40
mg?L )、IPTG (24 mg?L)、Amp (100 mg?L ) 的 LB - 琼脂平
板培养基上 , 将平板倒置于 37℃培养箱中过夜培养 , 形
成单菌落。
1 .3 .7 小量培养细菌 挑 1 个蓝色菌落 , 4 个白色菌
落 (选择菌落小的 ) , 各接种于含 3 ml LB、3μl Amp培养
基的试管里 , 37℃ , 220 r?min, 摇床培养 15 h。
1 .3 .8 重组质粒鉴定 用质粒的引物 ( 5′-GAGCG-
GATAACAATTTCACACAGG-3′和 5′-CGCCAGGGTTTTCCCAG-
TCACGAC-3′) 和 RAc1 (TaqMan) 引物对重组质粒进行
Nest PCR 扩增 , 观察是否有预期的目的片段。取正确插
入目的片断的质粒菌液 1 ml 送华大基因研究中心测序 ,
测序结果经 Blast进行同源性分析。
1 .3 .9 重组质粒浓度测定及标准曲线的建立 用质粒
提取试剂盒提纯质粒 , 测定 OD260?OD280 分析纯度 , 备用。
根据重组质粒提取物 OD260 nm吸光度 , 并通过如下公式
计算纯化产物原液的浓度。
DNA模板浓度 ( copies?μl ) = [ A260 × 0 .05× 10 - 6 g·
μl - 1 ×50 (稀释倍数 ) ? ( 660 g·mol - 1 ×碱基对数 ) ] ×
6 .02×1023 。其中 , 1 OD260 = 0 .05 g·L - 1 双链 DNA ; 1 对碱
基平均分子量 = 660 g·mol - 1 ; RAc1 重组质粒 2 814 bp;
6 . 02×1023 为阿佛加德罗常数。
制备 108 copies?μl 数量级的溶液作为标准品原液 , 贮
于 - 80℃。将重组质粒标准品原液梯度稀释成 107 、106 、
105 、104 、103 、102 、101 copies?μl 梯度数量级的标准品 ,
进行 RAc1 实时荧光定量 PCR 检测 , 每个样品 3 次重复 ,
根据临界循环数 (Threshold cycle, Ct) 以及模板起始拷贝
数制作标准曲线和标准方程。
1 .3 .10 实时荧光定量 PCR 检测 RAc1 mRNA 在荧光
定量 PCR 仪上扩增并检测荧光。25 .0μl PCR 反应液包
括 : 8 .5μl ddH2 O、上下游引物各 0.5μl (10μmol?L )、1 .0
μl TaqMan水解探针 (10μmol?L)、12.5μl premix Ex Taq (2
×) 和 2 .0μl cDNA。扩增参数为 : 95℃ , 预变性 10 s;
95℃变性 30 s; 59℃ , 退火 30 s, 收集荧光 , 循环 42 次。
2 结果与分析
2 .1 水稻叶总 RNA
提取 的总 RNA 有清 晰、完整 的 2 条带 ,
OD260?OD280 值为 1 .9 左右 , 符合试验纯度和逆转
录要求 ( 结果未列出 )。
2 .2 阳性质粒的 PCR 扩增鉴定
提取质粒 DNA 质量高 ( 图 1: C)。以重组
质粒 DNA 作模板 , 用质粒引物和 RAc1 (TaqMan)
图 1 重组质粒的 PCR 鉴定 (M 是 DL2000 markers)
A . 以 cDNA PCR 得到的 RAc1 目的片断 1 .5 %琼脂糖电泳图 , 1、2 泳道均为目的片段 ; B . 割胶回收纯化得到的 RAc1 目的片断
1 .5 % 琼脂糖电泳图 , 1 泳道为纯化目的片段 , C . RAc1 克隆质粒 0 .8 %琼脂糖电泳图 , 前 4 泳道为白斑 , 5 为蓝斑 ;
D . 用 RAc1 引物和 pMD19-T 自身引物 Nest PCR 抽提到质粒的 1 .5 % 琼脂糖电泳图 , 1、2、3 泳道是白菌落质粒
RAc1 引物的 PCR 产物 , 4 为蓝菌落 , 分别对应的 8、7、6、5 泳道是用 pMD19-T 自身引物的 PCR 产物
Fig . 1 Identification of recombinant plasmids by PCR (M are DL2000 markers)
A . Agarosegel electrophoresis (1 . 5 % ) of theprospective ampliconwas amplified from the cDNA , 1 and 2 are the prospective amplicons; B . Agarose
gel electrophoresis ( 1 . 5 % ) of the purified prospective amplicon, 1 is thepurified prospective amplicon; C . Agarose gel electrophoresis ( 0 . 8 % ) of
the combined plasmid, 1 - 4 are white lawns, 5 is blue lawn; D . Nest PCR combined plasmid by primersof RAc1 and pMD19-T, 1 - 4 are amplicons
of primers of RAc1 , 1 - 3 arewhite lawns, 4 is blue lawn; 8 - 5 are amplicons of primers of pMD19-T , respectively symmetrical to 1 - 4
771 期 高 东等 : TaqMan荧光定量 RT-PCR 检测水稻 RAc1 基因 mRNA 方法的建立
引物对重组质粒进行 Nest PCR 扩增。结果显示 :
RAc1 引物对白菌落质粒 (1、2、3 泳道 ) 扩增产
物与理论值 122 bp吻合 , 而对蓝菌落质粒 ( 4 泳
道 ) 没有扩增产物 ( 图 1: D) ; 质粒引物对白菌
落质粒 ( 8、7、6 泳道 ) 扩增产物与理论值 278
bp吻合 , 而对蓝菌落质粒 ( 5 泳道 ) 扩增产物与
理论值 156 bp也吻合 (图 1: D)。同时 , 阳性质
粒的测序鉴定结果显示 , 插入片段序列与 NCBI
上公布的序列同源性为 100% (图 2) 。
2 .3 重组质粒序列分析
用通用引物 M13F-47 和 M13R-48 对重组质粒
DNA 进行双向测序 , 序列分析结果经 GenBank
Blast 比对 , 与已知 RAc1 cDNA 序列相同 (图 2) 。
说明目的片段已成功重组于载体中并保持了序列
的完整性。
2 .4 标准曲线的建立及线性检测范围
从我们实验得出的常态型扩增曲线 ( 图 3)
和对数型扩增曲线 ( 图 4 ) 可以看出 : 总体看所
有曲线拐点清楚 , 指数期明显 , 扩增曲线整体平
行性好 , 基线平无上扬现象 , 低浓度样本扩增曲
线指数期明显 ; 曲线指数期斜率大 , 说明扩增效
率高 , 试剂灵敏度、引物和探针效果好 ; 相邻浓
度标准品扩增曲线与曲线之间的间距都十分接近
3 .32 , 是扩增效率都高的表现 ; 低浓度曲线指数
期明显 , 一方面不易出现假阴阳性误判 , 另一方
面说明灵敏度高 ; 扩增曲线的 Ct 值范围都大致
在 16～36 范围内 , 保证了定量准确性。
本研究成功地建立 RAc1 基因实时荧光 PCR
定量标准曲线方程 ( 图 5 ) : Y = - 3 .365X +
41 .534 , r= 1 .000 , 其中 Y 代表 Ct值 , X 代表模
图 2 重组质粒测序结果及同源性比对 (带下划线的序列为测序结果 )
Fig . 2 Sequencing result of recombinant plasmids alignment with RAc1 ( sequence marked with underline is sequencing result)
图 3 RAc1 基因的实时荧光定量 PCR 扩增曲线 (常态型 )
Fig . 3 Real-time fluorescence quantitative amplification curve of RAc1 ( normal view)
87 云 南 植 物 研 究 31 卷
图 4 RAc1 基因的实时荧光定量 PCR 扩增曲线 (对数态型 )
Fig . 4 Real-time fluorescence quantitative amplification curve of RAc1 ( log view)
图 5 RAc1 基因的实时荧光定量 PCR 标准曲线
Fig . 5 Real-time fluorescence quantitative standard curve of RAc1
板量的对数值。其线性范围可达 6 个数量级 , Ct
值和起 始模板 拷贝数 的相关 性均 较好 ( r =
1 .000 ) , 标准曲线的斜率接近理想值 - 3 . 320 , 扩
增效率为 98 .2%。
2 .5 标准品的重复性和灵敏度
将系列稀释的标准品各浓度梯度用荧光定量
PCR 重复测定 , 批内、批间各 5 次 , 每次每个稀
释度重复 3 管 , 结果 ( 表 1 ) 显示批内和批间重
复性均较好。批内变异系数 ( CV ) 为 : 0 . 10%
～0 .28% ; 批间变异系数为 : 0 . 14% ～0 .31%。
结果显示相同样本不论其稀释度如何 , Ct 值都具
有良好的重现性 , 并且 CV 值都很小 , 说明同一
样本的扩增效率在批内、批间都是比较一致的。
我们建立的克隆质粒标准品检测范围宽、灵
敏度高 , 102 数量级拷贝数的初始模板也可准确
检测到 , 定量结果可靠。
3 讨论
mRNA 表达检测成为许多学者所关注的问题
之一 , 经常采用 Northern印迹法、半定量 RT-PCR
971 期 高 东等 : TaqMan荧光定量 RT-PCR 检测水稻 RAc1 基因 mRNA 方法的建立
表 1 RAc1 标准品的批内和批间重复性
Table 1 The fidelity intra- and inter-batch of RAc1
RAc1 ?标准品
gradient RAc1
( copies?2μl)
批内重复性
intra-batch
Ct ( mean) SD CV ( % )
批间重复性
inter-batch
Ct ( mean) SD CV ( % )
3 ?. 82×107 15 J. 96 0 .043 0 ?. 27 16 .02 0 <. 050 0 .31
3 ?. 82×106 19 J. 35 0 .025 0 ?. 13 19 .40 0 <. 030 0 .15
3 ?. 82×105 22 J. 77 0 .028 0 ?. 12 22 .71 0 <. 032 0 .14
3 ?. 82×104 26 J. 22 0 .026 0 ?. 10 26 .25 0 <. 036 0 .14
3 ?. 82×103 29 J. 50 0 .029 0 ?. 10 29 .54 0 <. 040 0 .14
3 ?. 82×102 32 J. 66 0 .091 0 ?. 28 32 .70 0 <. 098 0 .30
及竞争性 RT-PCR 等 ( Ladu等 , 1991; Ranganathan
等 , 1995; Kratky 等 , 2001; Esenabhalu 等 , 2002;
高勤学等 , 2004 ) 。近年出现的荧光定量 PCR ,
具有很高的灵敏度和非常好的动力学检测范围
(Giulietti 等 , 2001; Alkan 等 , 2006; 杨凤秋和朱
正歌 , 2006) , 其中 TaqMan探针法的原理是设计
一条能与 PCR 产物特异杂交的探针 , 该探针的
5′端标记荧光报告基团 FAM, 3′端标记荧光淬灭
基团。探针在无特异性 PCR 发生时 , 检测不到
荧光信号 ; 当有特异性 PCR 扩增发生时 , 探针
与模板结合 , 激活 Taq酶的 5′外切酶活性 , 将探
针 5′端连接的荧光分子从探针上切割下来 , 引起
报告基团荧光信号的增长 (Stryer, 1978; Cardullo
等 , 1988; Bustin等 , 2000 ) 。荧光信号强度与探
针和特异性片段的结合数成正相关 ; 循环阈值与
PCR 体系中起始 DNA 量的对数值之间有严格的
线性关系 , 因此根据样品的循环阈值参照标准曲
线 , 经计算机处理后可准确计算出标本内目标基
因的拷贝数 ( Heid 等 , 1996; 杨建荣和陈晓东 ,
2002; 王梁燕等 , 2004 )。许多研究证明 TaqMan
荧光定量比 Northern 印迹法灵敏 , 且与半定量
RT-PCR 及竞争性 RT-PCR 相比更为灵敏、省力
(Bonnet 等 , 2000) 。应用荧光定量 RT-PCR 技术
检测水稻农艺性状相关基因表达鲜见报道。
本研究选择 TaqMan 荧光探针法对水稻 actin
基因 RAc1 的 mRNA 表达进行定量检测。考虑到
mRNA 的易降解性可能导致标准品的不稳定从而
引起结果的不准确 , 笔者采用 T-A 克隆法 , 克隆
RAc1 cDNA 重组质粒 DNA 作为标准品制备法
(Bielefeldt-Ohmann and Fitzpatrick, 1997) , 所设计
引物及探针序列特异 , 扩增测序显示与 NCBI 公
布的序列同源性为 100%。经反应条件优化 , 成
功地建立了优化的标准曲线。靶基因 RAc1 标准
曲线方程为 : Y = - 3 .365X + 41 .534 , 其线性范
围可达 6 个数量级 , 扩增效率高 , Ct 值和起始
模板拷贝数具有良好的相关性。在进行样本检测
时 , 先进行逆转录 , 再与标准品同时进行 PCR ,
从而达到绝对定量目的。
Actin基因是常用的基因表达定量内对照基
因 , 建立一套优质的内对照基因标准品能很好的
消除取样和提取效率不同带来的系统误差 , 是其
他基因准确定量的基础。本研究为进行其他基因
的准确定量提供了可靠、准确的方法。
标准曲线的斜率及相关系数显示 , 本研究建
立的 TaqMan 荧光定量 RT-PCR 法能够准确检测
基因 RAc1 的 mRNA 表达量 , 与传统检测方法相
比更为迅速、准确、灵敏。
致谢 朱书生、陆春明老师在实验中给予大力帮助。
〔参 考 文 献〕
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