全 文 ：烟草雌、雄配子 DNA 含量变化
?
林美珍1 , 邓 桦2 , 魏冬梅2 , 田惠桥2
??
(1 漳州卫生职业学院药学系 , 福建 漳州 363000 ; 2 厦门大学生命科学学院 , 福建 厦门 361005 )
提要 : 采用显微分光光度法测定了烟草 ( Nicotiana tabacum) 精细胞和卵细胞的 DNA 含量。烟草是二胞花
粉 , 花粉萌发后生殖细胞在花粉管中分裂形成精细胞。授粉后 45 h花粉管到达子房 , 在花粉管内的精细胞
DNA 含量为 1C。当花粉管在退化助细胞中破裂 , 释放出的两个精细胞开始合成 DNA。在与卵细胞融合前 ,
两个精细胞 DNA 含量接近 2C。随着精细胞的到达及合成 DNA , 卵细胞也开始合成 DNA , 融合前的卵细胞
DNA 含量也接近 2C。精、卵细胞融合后 , 合子 DNA 含量为 4C。烟草雌、雄配子是在细胞周期的 G2 期发
生融合 , 属于 G2 型。
关键词 : 烟草 ; 精细胞 ; 卵细胞 ; DNA 含量
中图分类号 : Q 944 文献标识码 : A 文章编号 : 0253 - 2700 (2009) 04 - 303 - 06
Change of DNA Content in Male and Female Gametes
of Tobacco ( Nicotiana tabacum)
LIN Mei-Zhen
1
, DENG Hua
2
, WEI Dong-Mei
2
, TIAN Hui-Qiao
2 **
( 1 Department of Pharmacy, Zhangzhou Medical Vocational College, Zhangzhou 363000 , China;
2 School of LifeSciences, Xiamen University, Xiamen 361005 , China)
Abstract : The nuclear DNA content of maleandfemalegametesof tobacco ( Nicotiana tabacum) wasmeasuredusing DA-
PI stain andmicrospectrofluorimetric measurement . Tobaccopollen is bicellular at anthesis, containingavegetative cell and
a generative cell , which divides to formtwo sperm cells in a pollen tube . The nuclear DNA content of generativecell in a
pollen tube was at 2C level and that of two sperm cells in a pollen tube, which elongated in the style, at 1C level . Two
sperm cells beganto synthesizeDNA after both were released in thedegenerated synergid, and the quantityof nuclear DNA
in both sperm cells approached 2C level before both fusing with egg and central cells . During this process, the nuclear
DNA content of egg cell also began to increase and approached 2C level before fusing with spermcell . After maleand fe-
male gamete fused, the nuclear DNA content of zygote reached4C level . Therefore, thefusion of maleandfemalegametes
of tobacco was at G2 of cell cycle, and this fusionof fertilization belongedtoG2 type . This result displayedthefertilization
multiformity in angiosperms .
Key words: Tobacco; Spermcells; Egg cell; DNA content
前人研究结果表明 : 植物精细胞 DNA 含量是
1C 或 2C; 大部分已检测的植物卵细胞 DNA 含量
为 1C, 处于单倍水平 , 但大麦成熟卵细胞中的
DNA 含量是 2～4C ( 田国伟等 , 2002 )。Friedman
(1991) 报道了裸子植物长叶麻黄 ( Ephedra trifur-
ca) 的精、卵细胞是在 1C 的 DNA 水平融合 , 但
在显轴买麻藤 ( Gnetumgnemon) 中 , 精、卵细胞
是在 2C 的 DNA 水平融合 ( Carmichael and Fried-
云 南 植 物 研 究 2009 , 31 (4) : 303～308
Acta Botanica Yunnanica DOI : 10 .3724?SP. J . 1143 .2009.09035
?
?? ?通讯作者 : Author for correspondence; E-mail : hqtian@ xmu. edu. cn; Tel : 0592 - 2186486
收稿日期 : 2009 - 02 - 24 , 2009 - 04 - 14 接受发表
作者简介 : 林美珍 (1965 - ) 女 , 副教授 , 主要从事药用植物学教学与研究。 ?
基金项目 : 国家自然科学基金 (30670126 )
man, 1995)。之后 Friedman (1999) 在拟南芥 ( Ar-
abidopsis thaliana) 中发现精细胞在花药的花粉粒
中就开始进入细胞周期的 DNA 合成期 (S期 ) , 临
近受精时 , 胚囊中的精细胞 DNA 含量达到 2C。
Friedman的研究结果还证实了裸子植物中存在受
精的 G1 型和 G2 型 , 在被子植物中 , 配子融合时
的 G2 类型则还需进一步证实。我们曾用显微荧
光测定法对经 DAPI 染色的烟草 ( Nicotiana taba-
cum) 雌、雄配子和合子核内的 DNA 含量进行了
测定 , 证实了烟草精、卵细胞在融合前分别合成
DNA的现象 ( Tian 等 , 2005 )。本文对烟草精、
卵细胞和合子中的 DNA 含量进行系统的测量 ,
从细胞周期的角度探讨烟草受精过程。
1 材料与方法
供试烟草品种大青叶在 20～27℃ , 光照 16 小时的生
长室中种植。开花前花被去雄 , 然后开花时再人工授粉
以确定发育时间。烟草是二胞花粉 , 人工萌发的花粉管
中生殖细胞不分裂形成精细胞。烟草花柱近 4 cm长 , 花
粉管需生长约 45 h到达子房。卵细胞受精后两天开始分
裂 (Tian and Russell , 1997 )。为了检测精细胞成熟过程中
的 DNA 含量变化 , 将授粉后在体内生长了 8 , 18 , 26 , 34
和 42 h、长度为 0 .5 , 1 , 2 , 3 和 4 cm的花柱切下 , 置于卡
诺固定液中固定 24 h, 保存在 70% 乙醇中备用。授粉或
不授粉花的胚珠在开花后 1、2 和 3 .5 d时用上述方法固
定和保存。固定的花柱和胚珠用石蜡包埋方法切片 , 切
片厚度 7～8μm。切片脱蜡后 , 用 0 .25μg?ml 4′, 6-Dia-
midino-2-Phenylindole (DAPI ) 染色 20 min, 封片后用 Zeiss
荧光光度显微镜观察和测量。以花粉管中精细胞的 100
荧光单位 ( RFU) 定为单倍体 ( 1C) , 以珠心细胞的 200
荧光单位定为二倍体 (2C) 作为测量的对照标准。测量
每个时期花柱的样品数量超过 100 个 , 测量胚囊的样品
数量均超过 50。
2 结果
2 .1 花粉管中的精细胞核 DNA 含量
烟草是二胞花粉 , 开花时的花粉粒含有一个
营养细胞和一个生殖细胞。花粉落到柱头 3 h后
开始萌发。花粉管在花柱中生长 5 h, 生殖细胞
开始分裂形成两个精细胞。在花粉管中的生殖细
胞的核细长 , 呈现出很强的荧光 ( 图版 I : 1 )。
因生殖细胞核的长度超出了荧光显微镜的测量圈
的范围 , 它的相对 DNA 含量大约为 180 荧光单
位 ( RFU) , 接近 2C 的含量。因此 , 可以确定花
粉管中的生殖细胞已基本通过细胞周期的 S 期 ,
是在 G2 期。营养细胞核与生殖细胞核很接近 ,
也呈细长形 , 但营养核的长度远远超过可测量的
范围 , 因此难以得出准确的营养核 DNA 含量的
数据。
生殖细胞分裂后 , 精细胞核依然呈长形 , 但
长度较生殖核小 ( 图版 I : 2 ) , 完全处于荧光显
微镜的测量圈范围内。在所取用的 4 个发育时期
中 , 精细胞的 DNA 荧光单位均在 93～97 RFU 之
间 (图 1 ) , 接近单倍体的 100 RFU, 相对 DNA
含量在 1C 水平。因此 , 在花柱内生长的花粉管
中的精细胞含有 1C 的 DNA 含量 , 精细胞是处在
细胞周期的 G1 期。
花粉管中两个精细胞之间在不同的发育时期
也显示出了 DNA 含量上的差异 , 与营养核相联
结的精细胞 (Svn) 比不与营养核相联结的精细
胞 (Sua) 高 2～3 个荧光单位。
图 1 生殖细胞、花粉管中的两个精细胞和被释放到助细胞中
的精细胞 DNA 相对含量比较。100≈1C DNA 相对含量
Fig . 1 Comparison of relativeDNA content of generative cell
and two sperm cells in pollen tube and sperm cells
released in synergid . 100≈1C DNA content
2 .2 被释放的精细胞核 DNA 含量
进入子房的花粉管穿过珠孔进入胚囊。烟草
成熟胚囊中的细胞核都可被 DAPI 标记 (图版 I :
3)。在退化的助细胞中 , 花粉管破裂释放内含
物 , 包括两个精细胞 , 用 DAPI 标记的两个精细
胞核的荧光非常清楚 ( 图版 I : 4 )。刚释放的两
个精细胞在退化助细胞的珠孔端 , 然后移动到退
403 云 南 植 物 研 究 31 卷
化助细胞的合点端 , 位于卵细胞核的附近 ( 图版
I : 5 , 6)。经常可以看到处于同一平面上的两个
精细胞呈先后排列 ( 图版 I : 7) , 但仍难以断定
那一个精细胞与卵细胞融合。
进入退化助细胞中的两个精细胞核 DNA 含
量显现出增加的迹象。统计了在退化助细胞中的
51 个精细胞的 DNA 含量 , 大部分的核 DNA 含量
处于 150 以上的相对荧光单位 , 提示这些精细胞
核正在合成 DNA , 处于细胞周期的 S 期。其中有
3 个精细胞核的 DNA 含量已达到 200 相对荧光单
位 , 表明它们已通过了 S 期 , 进入 G2 期。在 11
个胚囊的退化助细胞中两个精细胞位于切片的同
一平面上 ( 图版 I : 7 ) , 为同时测量一对精细胞
提供了条件 , 结果两个精细胞中的 DNA 相对荧
光单位相差 18 .0±12 .9 , 但统计分析差异不显
著。也许是数量太少 , 也许是两个精细胞 DNA
合成不同步。
2 .3 卵细胞核的 DNA 含量
烟草成熟胚囊包括一个卵细胞 , 两个助细
胞 , 一个具两个极核的中央细胞和三个反足细
胞。用 DAPI 标记胚囊卵器细胞核的形态清晰 ,
根据卵细胞和助细胞的相反极性和核的排列位置
可区分出卵细胞核 , 助细胞核和中央细胞核 ( 图
版 I : 3)。烟草子房中约有 3700 个胚珠 , 其花粉
管生长 48 h, 有些胚囊中已有花粉管了。与精细
胞相比 , 卵细胞核的体积较大 , 荧光也比较分散
(图版 I : 4 )。在花粉管长入胚囊之前 , 卵细胞核
的相对荧光单位是 95 .8±8 .9 (图版 I : 5 ) , 反映
出卵细胞含 1C 的 DNA 水平 , 处在细胞周期的 G1
期。当花粉管进入胚囊 , 精细胞被释放到退化助
细胞中并开始合成 DNA 后 , 卵细胞核也开始合
成 DNA , 所测量的 53 个卵细胞核的相对荧光单
位平均是 158 .1±34 .7 , 提示卵细胞核开始合成
DNA , 处于 S 期。从形态上看 , 正在合成 DNA
的卵细胞核的荧光强度也比合成以前明显强 ( 图
版 I : 6)。此时 , 精细胞核的 DNA 含量是 192 相
对荧光单位 , 而卵细胞核是 161。卵细胞合成
DNA 的过程要晚于精细胞。
为了证实卵细胞中 DNA 的合成是否受精细
胞的影响 , 对去雄不授粉花的卵细胞 也做了
DNA 的测量。在开花后 48 h, 不授粉花的卵细胞
核 DNA 含量仍处于 1C 水平 , 但在开花后 84 h
(3 . 5 天 ) , 不授粉花的卵细胞 DNA 含量为 191±
11 相对荧光单位 , 接近 2C 水平。这比授粉花中
的卵细胞合成 DNA 推迟了约一天 , 暗示没有精
细胞 , 卵细胞也启动合成 DNA , 但精细胞的到
来可刺激卵细胞提前合成 DNA。
图 2 烟草不同时期卵细胞中的 DNA 相对含量比较
100≈1C DNA 相对含量
Fig . 2 Comparison of relative DNA content of egg cells in
different development stages . 100≈1C DNA content
3 讨论
在动、植物的生长发育过程中 , 细胞周期调
控起着关键的作用。在雌雄配子融合之前 , 其细
胞周期需达到一致。在动物中 , 雌、雄配子都是
含 1C 的 DNA 状态下发生融合。含 1C DNA 的配
子显然是处在细胞周期的 G1 期。当雌、雄配子
融合后 , DNA 含量加倍 , 二倍体的受精卵被激
活 , 包括开始合成 DNA , 通过细胞周期的 S 期。
当受精卵 DNA 含量达到 4C 后启动分裂 , 开始胚
胎发育。
早在上世纪 50 年代就有人用孚尔根反应
(Feulgen reaction) 结合显微分光光度法测量植物
雌、雄配子 DNA 的含量。然而 , 早期的这方面
研究也碰到了一些技术上的障碍 : 同一种材料的
细胞在不同的生理状态下以及不同的操作条件下
得出 的 结 果 有 差 异 ( Shink 等 , 1957; Iskida,
1961)。D′Amato等 (1965) 用孚尔根反应的方法
测得大麦在花粉粒中的精细胞 DNA 含量是 2C,
但 Hesemann (1973) 的测量结果为 1～2C。Meri-
cle and Mericle ( 1973 ) 测得二棱大麦的精细胞
DNA 含量为 1C, 卵细胞是 2～4C。尤其是有些
植物的精细胞能染色 , 而卵细胞核在开花时难以
染色 , 但这并不意味着卵细胞核中没有 DNA ,
5034 期 林美珍等 : 烟草雌、雄配子 DNA 含量变化
而是卵细胞的生理状态不同。这些技术上的困难
以及有出入的研究结果使得早期有关生殖细胞中
DNA 含量的研究逐渐很少有人问津。
随着植物性细胞分离技术的发展以及新的
DNA 荧光染料的发现 , 有关配子及合子 DNA 含
量的研究逐渐又有新的报道 ( Sherwood, 1995;
Mogensen and Holm, 1995; Mogensen 等 , 1999;
Pònya等 , 1999) 。这些作者用 DNA 特异荧光染料
DAPI 或 H33258 对植物精、卵细胞中的 DNA 含
量做了分析 , 都证实精、卵细胞为单倍体 , 其
DNA 含量为 1C。值得注意的是麻黄双受精的发
现者 Friedman 将雌、雄配子的 DNA 含量变化与
细胞周期的概念结合起来研究 , 提出了配子核融
合时的不同模式 : 处于配子融合发生在 G1 期的
称为 G1 型 , 而将通过 S 期的配子融合类型称为
G2 型 (Friedman, 1991) 。如在裸子植物显轴买麻
藤中 , 精、卵细胞都含 2C 的 DNA , 处在细胞周
期的 G2 期 , 是配子融合的 G2 类型 ( Carmichael
and Friedman, 1995 )。后来他又检测了被子植物
拟南芥精细胞核中 DNA 的含量 , 发现拟南芥生
殖细胞有丝分裂后 , 刚形成的两个精细胞很快进
入细胞周期的 S期 , 在花药内的花粉粒中 , 两个
精细胞就开始合成 DNA , 到传粉时精细胞中的
DNA 含量已达 1 .5C。传粉后在花粉管生长过程
中精细胞继续合成 DNA。当花粉管到达子房时 ,
精细胞约含 1 .75C DNA。临近受精时 , 在胚囊中
的精 细 胞 平 均 含 1.98C 的 DNA ( Friedman,
1999)。他的研究结果表明拟南芥也应该属于 G2
类型。然而他未能测量拟南芥卵细胞的 DNA 含
量 , 因为成熟的卵细胞没有荧光 ( 私人交谈 )。
烟草是二胞花粉 , 花粉管萌发后其生殖细胞
DNA 含量约为 2C。授粉后 8 h左右生殖细胞分裂
形成两个精细胞。之后花粉管在花柱中生长的
30 多个小时中 , 精细胞 DNA 含量始终保持在 1C
水平。当花粉管进入胚囊 , 在退化助细胞中释放
出两个精细胞后 , 两个精细胞的 DNA 含量开始
增加并最终达到 2C , 说明烟草精细胞在退化助
细胞中进入细胞周期的 S期。随着精细胞到来并
合成 DNA , 卵细胞的 DNA 含量也开始增加并在
融合前达到 2C 水平。新形成的合子 DNA 含量为
4C 并一直保持到合子分裂为止。在只去雄不授
粉的花中 , 卵细胞要推迟 36 h 后才开始合成
DNA , 进入 S 期。烟草精、卵细胞在到达 G2 期
才发生融合 , 属于 G2 类型。在被子植物中也证
实了雌、雄配子融合的 G2 类型的存在 , 从细胞
周期的角度揭示了被子植物受精过程的多样性。
细胞合成 DNA 意味着其细胞周期由 G1 期进
入 S期 , 启动细胞周期变化的机制是深入研究的
关键点。拟南芥精细胞在花粉粒中就 开始了
DNA 的合成 (Friedman, 1999) , 它由 G1 期进入 S
期的启动机制发生在花粉粒中。而在烟草中 , 精
细胞在退化助细胞中被释放后才开始合成 DNA ,
启动精细胞由 G1 期进入 S 期的机制发生在退化
助细胞中 , 这表明在两种植物中启动细胞周期的
机制可能不同。另外 , 烟草未授粉花的卵细胞推
迟合成 DNA 意味着卵细胞在没有精细胞存在的
条件下也会启动细胞周期进入 S期 , 但在有精细
胞存在时可促进该过程提前启动 , 说明卵细胞合
成 DNA 是其本身就具有的特性。裸子植物显轴
买麻藤是四倍体植物 , 烟草也是四倍体植物 , 植
物的多倍体特征是否与其配子融合的 G2 类型有
关 ? 这需要在其它植物中进行广泛检验。
〔参 考 文 献〕
田国 ?伟 , 申家恒 , 胡适 宜 , 2002 . 雄性和雌 性配子及 合子核中
DNA 的含量与细胞周期的状态 [ A ] . 见 : 胡适宜 , 杨弘远
主编 . 被子植物受精生物学 [M ] . 北京 : 科学出版社 , 188—
192
Carm ?ichael JS, Friedman WE, 1995 . Double fertilization inGnetum gne-
mon: the relationship between the cell cycle and sexual reproduction
[ J ] . Plant Cell , 7 : 1975—1988
D′Am ?ato F , Devereux M, Scarascia M et al. , 1965 . The DNA comtent
of thenuclei of the pollen grain in tobacco and barley [ J ] . Caryo-
logia, 18 : 377—382
Frie ?dman WE, 1991 . Double fertilization in Ephedra trifurca, a nonflow-
ering seed plant: the relationship between fertilization events and the
cell cycle [ J ] . Protoplasma, 165: 106—120
Frie ?dman WE, 1999 . Expression of the cell cycle in sperm of Arabidop-
sis: implications for understanding patterns of gametogenesis and fer-
tilization in plants and other eukaryotes [ J ] . Development, 126:
1065—1075
Hese ?mann CU , 1973 . Untersuchungen zur Pollenentwicklung und Pollen-
schlauchbildung bei h?heren Pflanzen [ J ] . Theoretical and Applied
Genetics, 43 : 232—241
Iski ?daMR , 1961 . A cytochemical study of nucleic acid in plant cells Ⅴ .
603 云 南 植 物 研 究 31 卷
Nucleic acid of Fulgen negativeplants [ J ] . Cytologia, 26 : 359—371
Meri ?cle LW, Mericle RP, 1973 . Confounding the quandary of zygote
DNA [ J ] . Barley Genetic Newsletter, 3 : 39—42
Moge /nsen HL , Holm PB , 1995 . Dynamics of nuclear DNA quantities
during zygote development in barley [ J ] . Plant Cell , 7 : 487—494
Moge /nsen HL , Leduc N , Natthys-Rochon E et al. , 1999 . Nuclear DNA
amounts in the egg and zygoteof maize ( Zea mays L ) [ J ] . Planta,
197: 641—645
Sher ?wood RT , 1995 . Nuclear , DNA amount during sporogenesis and ga-
metogenesis in sexual and aposporous buffelgrass [ J ] . Sexual Plant
Reproduction, 8 : 85—90
Shin ?ke N , Ishida MR , Ueda K , 1957 . A study of the Feulgen reaction of
plant cells [ J ] . Process of Internatioanl Gene Symposium, Supple-
ment Vol . of Cytologia, 156—161
Tian ,HQ, Russell SD, 1997 . Calciumdistribution in fertilized and unfer-
tilized ovules and embryo sacs of Nicotiana tabacumL [ J ] . Planta,
202 : 93—105
Tian *HQ, Yuan T , Russell SD, 2005 . Relationship between double fer-
tilization and the cell cycle in male and female gametes of tobacco
[ J ] . Sexual Plant Reproduction, 17 : 243—252
图版说明
A : 反足 细胞核 ; DS: 退化助细胞 ; E: 卵 细胞核 ; EN: 胚乳
核 ; PN: 极核 ; S: 助细胞核 ; VN: 营养核 ; Z: 合子
图版Ⅰ : 1 . 在花柱中的花 粉管内的 生殖细胞 ( 箭 头 ) 和营养
核 ; 2 . 在花柱中的花粉管内的两个精细胞核 ( 箭头 ) 和营养核 ;
3 . 烟草成熟胚囊中的卵细胞核 , 助细胞核 , 极核和反足细胞核 ;
4 . 花粉管进入退化助细胞后释放的两 个精细胞核 ( 箭头 ) ; 5 .
在退化助细胞中精细胞核 ( 箭头 ) 已移动到其合点端 ; 6 . 在退
化助细胞中精细胞核 ( 箭头 ) 已移动到其合点端 , 卵核的荧光
亮度明显增加 ; 7 . 受精胚囊中的两个精细胞核 ( 箭头 ) , 领先的
已移动到卵核附近 ; 8 . 受精胚囊中 , 胚乳核已开始分裂 ; 9 . 精
细胞 ( 箭头 ) 刚被释放到退化助 细胞时 , 两个极 核还未融 合 ;
10 . 当精细胞 (箭头 ) 移动到退化助细胞的合点端时 , 两个极核
融合成次生核 (所有图片放大 900 倍 ) .
Explanation of Plate
A : antipodal nucleus; DS : degenerated synergid; E : egg nucleus; EN:
endosperm nucleus; PN: polar nucleus; S: synergid nucleus; VN: vege-
tative nucleus; Z: zygote
Plate Ⅰ : 1 . Generative cell ( arrow) and vegetative nucleus in a pollen
tube in the style; 2 . Two sperm nuclei in a pollen tube in the style after
generative cell divided; 3 . A mature tobacco embryo sac with egg nucle-
us, synergid nucleus, a polar nucleus and a antipodal nucleus; 4 . Two
sperm nuclei ( arrows) were released in degenerated synergid after pollen
tube broken; 5 . A sperm nucleus (arrow) in degenerated synergid; 6 . A
sperm nucleus (arrow) in degenerated synergid . The fluorescence of egg
nucleus increased evidently; 7 . Between two sperm nuclei ( arrows) , one
moved faster than another one and arrived at egg cell ; 8 . In a fertilized
embryo sac, endosperm nucleus was dividing; 9 . When sperm cell ( ar-
row) was just released in degenerated synergid, two polar nuclei still were
intact and no fusion; 10 When sperm ( arrow) moved to chalazal end of
degenerated synergid, two polar nuclei began to fuse each other . ( All of
the figures enlarge 900 times)
7034 期 林美珍等 : 烟草雌、雄配子 DNA 含量变化
林美珍等 : 图版Ⅰ LIN Mei-Zhen et al . : Plate Ⅰ
803 云 南 植 物 研 究 31 卷