全 文 ：鸭梨 ＡＣＣ氧化酶基因 ｃＤＮＡ片段的克隆及农杆菌
介导的反义遗传转化∗
齐　 靖１ꎬ 董　 祯２ꎬ 张玉星３
(１ 河北经贸大学生物科学与工程学院ꎬ 河北 石家庄　 ０５００６１ꎻ ２ 河北女子职业技术学院ꎬ
河北 石家庄　 ０５００９１ꎻ ３ 河北农业大学园艺学院ꎬ 河北 保定　 ０７１００１)
摘要: 研究根据 ＡＣＣ氧化酶基因的保守序列设计一对特异性引物ꎬ 以鸭梨果实为试材ꎬ 借助 ＲＴ￣ＰＣＲ 方
法扩增得到一条长度为 ８３１ ｂｐ的鸭梨 ＡＣＣ氧化酶基因 ｃＤＮＡ 片段ꎬ 该片段编码 ２７６ 个氨基酸残基ꎬ 与其
它梨品种 ＡＣＣ氧化酶基因序列同源性均在 ９４％以上ꎮ 将此片段反向插入真核表达载体 ｐＢＩ１２１ 的 ＣａＭＶ
３５Ｓ启动子和 ＮＯＳ终止子之间ꎬ 构建了鸭梨 ＡＣＣ氧化酶基因的反义表达载体ꎬ 并在农杆菌 ＬＢＡ４４０４的介导
下实现对鸭梨组培苗的遗传转化ꎮ 经 ＰＣＲ鉴定证实共有 ４株鸭梨组培苗中外源基因得到成功转化ꎬ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ
杂交显示在这 ４株转基因鸭梨中除有 １株外源基因呈双拷贝外ꎬ 其余 ３株中外源基因均以单拷贝形式存在ꎮ
关键词: 梨ꎻ ＡＣＣ氧化酶ꎻ ＲＴ￣ＰＣＲꎻ 反义表达载体ꎻ 遗传转化
中图分类号: Ｑ ７８４　 　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 　 　 　 文章编号: ２０９５－０８４５(２０１４)０５－６２２－０７
Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ＡＣＣ Ｏｘｉｄａｓｅ Ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｙａｌｉ Ｐｅａｒ ａｎｄ
Ｔｒａｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｔｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ
ｗｉｔｈ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ￣ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ
ＱＩ Ｊｉｎｇ１ꎬ ＤＯＮＧ Ｚｈｅｎ２ꎬ ＺＨＡＮＧ Ｙｕ￣Ｘｉｎｇ３
(１ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬ Ｈｅｂｅｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｂｕｓｉｎｅｓｓꎬ Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ ０５００６１ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ
２ Ｈｅｂｅｉ Ｗｏｍｅｎ′ｓ Ｖｏｃａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅꎬ Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ ０５００９１ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ３ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅꎬ
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｂｅｉꎬ Ｂａｏｄｉｎｇ ０７１００１ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙꎬ ａ ｐａｒｔｉａｌ ＡＣＣ ｏｘｉｄａｓｅ (ＡＣＯ) ｇｅｎｅ￣ｌｉｋｅ ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ￣
ｂａｓｅｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｆｒｏｍ Ｙａｌｉ (Ｐｙｒｕｓ ｂｒｅｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉ ｃｖ. ‘Ｙａｌｉ’ ) ｐｌａｎｔ. Ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎ￣
ｓｅｒｖｅｄ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ＡＣＯ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓꎬ ａｎｄ ＲＴ￣ＰＣＲ ｃｌｏｎｉｎｇ ｗａｓ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ Ｙａｌｉ ｆｒｕｉｔ ｃＤＮＡ.
Ｔｈｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ＡＣＯ￣ｌｉｋｅ ｃＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｏｎｔａｉｎｓ ８３１ ｂａｓｅ ｐａｉｒｓ ｗｈｉｃｈ ｅｎｃｏｄｅｓ ２７６ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓꎬ
ａｎｄ ｓｈａｒｅｓ ｎｏ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ ９４％ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｗｉｔｈ ａｌｌ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ＡＣＯ ｇｅｎｅｓ. Ｗｅ ｆｕｒｔｈｅｒ ｉｎｖｅｒｓｅｌｙ ｉｎｓｅｒ￣
ｔｅｄ ｔｈｅ ＡＣＯ￣ｌｉｋｅ ｃＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｉｎｔｏ ｐＢＩ１２１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒꎬ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｔ ｉｎｔｏ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｙａｌｉ ｐｌａｎｔｓ
ｂｙ ｕｓｉｎｇ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＬＢＡ４４０４. Ｆｉｎａｌｌｙꎬ ４ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｌｉｎｅｓ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｔｈｅ ａｎｔｉ￣ｓｅｎｓｅ ＡＣＯ￣ｌｉｋｅ ｆｒａｇ￣
ｍｅｎｔ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ. Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ａｓｓａｙ ｒｅｖｅａｌｅｄ ３ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｌｉｎｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｓｉｎ￣
ｇｌｅ ｃｏｐｙ ｏｆ ｔｈｅ ｆｏｒｅｉｇｎ ｇｅｎｅꎬ ａｎｄ １ ｌｉｎｅ ｗｉｔｈ ２ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｃｏｐｉｅｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｙａｌｉ ｐｅａｒꎻ ＡＣＣ ｏｘｉｄａｓｅꎻ ＲＴ￣ＰＣＲꎻ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒꎻ Ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
　 鸭梨 (Ｐｙｒｕｓ ｂｒｅｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉ ｃｖ. ‘Ｙａｌｉ’ ) 原产
我国ꎬ 是我国北方地区主栽的梨品种之一ꎬ 也是
我国出口创汇的重要果品ꎮ 鸭梨果实口感甜脆多
汁ꎬ 不但营养丰富ꎬ 还具有生津润燥、 镇咳止喘
植 物 分 类 与 资 源 学 报　 ２０１４ꎬ ３６ (５): ６２２~６２８
Ｐｌａｎｔ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ＤＯＩ: １０.７６７７ / ｙｎｚｗｙｊ２０１４１３２２５
∗ 基金项目: 河北省科技计划资助项目 (１１２２０１０３Ｄ￣９)ꎻ 河北省高等学校科学技术研究指导项目 (Ｚ２０１２０６５)
收稿日期: ２０１３－１１－２０ꎬ ２０１４－０２－２０接受发表
作者简介: 齐　 靖 (１９８１￣) 男ꎬ 博士ꎬ 讲师ꎬ 主要从事植物生理与分子生物学方面研究ꎮ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｑｉｊｉｎｇ＠ｈｅｕｅｔ􀆰 ｅｄｕ􀆰 ｃｎ
和润肺护肝等药用价值ꎮ 近年来ꎬ 随着生活水平
的不断提高ꎬ 对梨果品终年供应的需求问题日渐
突出ꎬ 果品的延熟保鲜及延长果实的货架寿命ꎬ
已经成为鸭梨果品生产经营中的一个重大难题ꎮ
我国科技工作者围绕着延长鸭梨贮藏期的问题进
行了大量的研究工作ꎬ 先后探明了鸭梨果实在采
收、 贮藏和加工等过程中外界环境对果实衰老的
影响 (朱麟等ꎬ ２００９ꎻ 李家政等ꎬ ２０１２)ꎬ 并基于
此明确了一系列果品保鲜措施ꎬ 但这些举措并不
能从根本上实现对鸭梨果实衰老生理的调控ꎬ 因
而也就无法完全解决鸭梨果实保鲜问题ꎮ 只有对
影响鸭梨果实贮藏特性相关的基因进行改造ꎬ 培
育耐贮藏鸭梨新品种才是解决鸭梨果品保鲜问题
的关键ꎮ
已有研究证实ꎬ 鸭梨是典型的呼吸越变型果
实ꎬ 乙烯对其果实成熟具有重要调控作用 (张
宪省和阎先喜ꎬ １９９４)ꎮ 降低梨果实的内源乙烯
合成ꎬ 是延长其果实贮藏、 保鲜期的根本途径之
一ꎮ 乙烯在植物体内的生物合成途径为: Ｍｅｔ
(甲硫氨酸)→ＳＡＭ (Ｓ￣腺苷甲硫氨酸)→ＡＣＣ (１￣
氨基环丙烷￣１￣羧酸)→Ｅｔｈｙｌｅｎｅ (乙烯) (Ｙａｎｇ 和
Ｈｏｆｆｍａｎꎬ １９８４)ꎬ 这一过程的最终步骤乙烯直接
前体 ＡＣＣ的氧化受到 ＡＣＣ氧化酶 (ＡＣＯ) 调控ꎬ
改变 ＡＣＣ氧化酶在植物体内的含量将会直接影
响到乙烯的体内合成 (Ａｄａｍｓ 和 Ｙａｎｇꎬ １９７９)ꎮ
基于 ＡＣＣ氧化酶在乙烯内源合成中的重要调控
作用ꎬ 本研究借助反义 ＲＮＡ 技术抑制鸭梨 ＡＣＣ
氧化酶内源合成为目标ꎬ 围绕着鸭梨 ＡＣＣ 氧化
酶基因开展了 ｃＤＮＡ片段的克隆和反义表达载体
构建的研究ꎻ 并借助农杆菌介导的遗传转化技术
成功实现了 ＡＣＣ 氧化酶基因片段对鸭梨组培苗
的反义遗传转化ꎬ 从而为将来培育出耐储梨新品
种及其他果树耐储新品种的培育提供了优质种质
资源ꎬ 也为反义 ＲＮＡ 技术在鸭梨遗传改良研究
中的进一步应用提供了参考资料ꎮ
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
鸭梨果实采自河北农业大学标本园ꎮ 采摘成熟、 无
病害果实ꎬ 用冰盒带回实验室ꎬ ４ ℃低温保存ꎮ
大肠杆菌菌株 ＤＨ５α、 克隆载体 ｐＵＣｍ￣Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ、
ＵＮＩＱ￣１０柱式质粒小量抽提试剂盒和 ＤＮＡ胶回收试剂盒
为上海生工公司产品ꎻ Ｏｌｉｇｏ (ｄＴ) １５、 ＲＴａｓｅ Ｍ￣ＭＬＶ、 Ｔａｑ
酶、 ｄＮＴＰ、 限制性内切酶、 Ｔ４ 连接酶、 基因组提取试
剂盒以及 ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ 均购自 ＴＡＫＡＲＡ 公司ꎻ 地高辛标
记和检测试剂盒为美国罗氏公司产品ꎻ 其他常规化学试
剂均为国产分析纯ꎮ 真核表达载体 ｐＢＩ１２１ 和农杆菌
ＬＢＡ４４０４为本实验室保存ꎮ
１􀆰 ２　 引物设计
根据 ＧｅｎＢａｎｋ上公布的 ＡＣＣ 氧化酶基因保守序列ꎬ
利用 Ｏｌｉｇｏ６􀆰 ０软件设计一对 ＰＣＲ扩增引物: 上游引物为
５′ ＴＴＧＴＧＡＧＡＡＣＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＴＴＧＡＧ ３′ꎬ 下游引物为 ５′
ＴＣＡＴＡＧＣＴＴＣＡＡＡＣＣＴＴＧＧＴＴＣＴＴＴ ３′ꎬ 引物由上海生工
公司合成ꎮ
１􀆰 ３　 ＲＮＡ提取及 ＲＴ￣ＰＣＲ
鸭梨果实总 ＲＮＡ提取和纯化参考改良 ＣＴＡＢ法 (董
祯ꎬ ２００７) 进行ꎮ 纯化后的 ＲＮＡ在 ＲＴａｓｅ Ｍ￣ＭＬＶ的作用
下ꎬ 以 Ｏｌｉｇｏ (ｄＴ) １５为引物进行反转录合成ꎮ 以获得的
反转录产物为模板ꎬ 进行 ＰＣＲ 扩增ꎬ 反应总体系为 ２５
μＬꎬ 其中包含模板 ５０ ｎｇ、 １０ × ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ２􀆰 ５ μＬ、 Ｔａｑ酶
１􀆰 ５ Ｕ以及上下游引物各 ３０ ｎｇꎬ Ｍｇ２＋浓度为 ２􀆰 ０ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ－１ꎬ
ｄＮＴＰ 浓度为 ０􀆰 ２５ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ－１ꎮ ＰＣＲ 反应在德国 Ｂｉｏｍｅｔｒａ
公司生产的 Ｔ Ｇｒａｄｉｅｎｔ ＰＣＲ仪中进行ꎬ 扩增程序为: ９４℃
预变性 ７ ｍｉｎꎬ ９４ ℃变性 ５０ ｓꎬ ５２ ℃退火 １ ｍｉｎꎬ ７２ ℃延
伸 １ ｍｉｎꎬ 共 ３５个循环ꎻ ７２ ℃完全延伸 ５ ｍｉｎꎮ
１􀆰 ４　 目的片段的克隆与测序
ＰＣＲ产物经 １％琼脂糖凝胶电泳分离后ꎬ 用 ＤＮＡ 胶
回收试剂盒收集目的片段ꎬ 并与 ｐＵＣｍ￣Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ 连接ꎬ
热击法转化到大肠杆菌 ＤＨ５α 感受态细胞中进行篮白斑
筛选ꎮ 挑取阳性重组菌落扩繁后用小量抽提试剂盒提取
质粒ꎬ 酶切鉴定后ꎬ 将菌液送上海生工公司进行测序ꎮ
１􀆰 ５　 鸭梨 ＡＣＣ氧化酶基因反向插入表达载体及转化农
杆菌
对经测序鉴定后 ＡＣＣ 氧化酶基因片段反向插入在
ｐＵＣｍ￣Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ多克隆位点的重组质粒以及真核表达载
体 ｐＢＩ１２１进行 ＸｂａＩ / ＳａｃＩ双酶切ꎬ 电泳分离后分别回收
目标基因片段和切除 Ｇｕｓ 基因的 ｐＢＩ１２１ 线性载体ꎬ 用
Ｔ４连接酶连接过夜后ꎬ 冻融法转化农杆菌 ＬＢＡ４４０４ꎬ 在
Ｋａｎ / Ｒｉｆ抗生素平板上筛选重组菌落ꎬ 扩繁后小量抽提
试剂盒回收质粒ꎬ 分别用 ＸｂａＩ / ＳａｃＩ 酶切和 ＰＣＲ 鉴定ꎮ
ＰＣＲ引物及反应条件同前所述ꎮ
１􀆰 ６　 鸭梨的遗传转化
参照李桂琴等 (２０１０ａꎬｂ) 构建的鸭梨的再生体系
和遗传转化体系进行鸭梨的遗传转化ꎮ 将预培养 ２ ｄ 的
鸭梨叶片愈伤组织作为遗传转化的起始材料ꎬ 置于
ＯＤ６００为 ０􀆰 ８的农杆菌菌液中浸渍 １０ ｍｉｎꎬ 用滤纸吸去多
余的菌液ꎬ 接种于再生培养基 (ＮＮ６９＋ＢＡ３􀆰 ０ ｍｇ􀅰Ｌ－１ ＋
ＩＡＡ０􀆰 ５ ｍｇ􀅰Ｌ－１) 避光共培养 ２ ｄꎬ 再加入 ２００ μｇ􀅰ｍＬ－１的
３２６５期　 　 　 　 　 　 齐　 靖等: 鸭梨 ＡＣＣ氧化酶基因 ｃＤＮＡ片段的克隆及农杆菌介导的反义遗传转化　 　 　 　 　 　 　
头孢噻肟钠 (Ｃｅｆ) 抑菌ꎮ 然后将抗性芽转入芽再生选
择培养基 ( ＮＮ６９ ＋ ＢＡ３􀆰 ０ ｍｇ􀅰Ｌ－１ ＋ ＩＡＡ０􀆰 ５ ｍｇ􀅰Ｌ－１ ＋
Ｃｅｆ２００ ｍｇ􀅰Ｌ－１＋Ｋａｎ ５ ｍｇ􀅰Ｌ－１) 培养ꎬ 待不定芽长度为 ４~
６ ｃｍ时ꎬ 切取带有顶芽或腋芽的片段 １􀆰 ５~２ ｃｍꎬ 接种于
抗性苗筛选培养基 (ＭＳ＋ＢＡ１􀆰 ０ ｍｇ􀅰Ｌ－１＋ＮＡＡ０􀆰 ５ ｍｇ􀅰Ｌ－１
＋Ｃｅｆ ２００ ｍｇ􀅰Ｌ－１＋Ｋａｎ ２０ ｍｇ􀅰Ｌ－１) 上培养ꎬ 筛选卡那霉
素抗性鸭梨再生苗ꎮ
１􀆰 ７　 转基因鸭梨的 ＰＣＲ鉴定
根据 ＧｅｎＢａｎｋ公布的 ＮＰＴ ＩＩ基因序列设计一对特异
性引物ꎬ 上游引物 (５′ ＣＧＴＣＴＧＴＣＧＡＧＡＡＧＴＴＴＣ ３′) 和
下游引物 (５′ ＴＡＣＴＴＣＴＡＣＡＣＡＧＣＣＡＴＣ ３′)ꎬ 按大连宝生
物工程有限公司基因组提取试剂盒提供的方法提取卡那霉
素抗性转基因鸭梨 ＤＮＡꎬ 进行 ＰＣＲ扩增ꎮ 取 １０ μＬ ＰＣＲ产
物ꎬ 加入 ６ × Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ２ μＬꎬ 充分混匀后在 １％琼脂糖
凝胶、 ５ Ｖ/ ｃｍ电压下ꎬ 电泳 ２０ ｍｉｎ后显影、 照相ꎮ
１􀆰 ８　 转基因鸭梨的 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析
根据 ３５Ｓ 启动子序列设计一对引物ꎬ 上游引物
(５′ ＡＧＧＣＴＴＡＣＧＣＡＧＣＡＧＧＴＣＴＣＡＴ ３′) 和下游引物 (５′
ＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＴＧＣＧＡＡＧＧＡＡＴＧ ５′)ꎬ 以 ｐＢＩ１２１ 质粒为
模板ꎬ ＰＣＲ扩增制备 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交探针ꎬ 与 ＥｃｏＲ Ｉ 消化
的转基因鸭梨基因组进行 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交ꎬ 探针制备和
Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交参照美国罗氏公司地高辛标记和检测试剂
盒说明书ꎬ 以检测转入的反义 ＡＣＣ氧化酶基因片段在基
因组中的拷贝数ꎮ
２　 结果与分析
２􀆰 １　 鸭梨ＡＣＣ氧化酶基因 ｃＤＮＡ片段的克隆和分析
根据 ＡＣＣ氧化酶基因的保守序列设计一对
特异性引物ꎬ 以成熟鸭梨果实总 ＲＮＡ 为模板进
行 ＲＴ￣ＰＣＲ扩增ꎬ 得到一条长度约为 ８５０ ｂｐ 的
ｃＤＮＡ片段ꎬ 如图 １ 所示ꎮ 将该片段回收、 纯化
后与 ｐＵＣｍ￣Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ 连接ꎬ 转化大肠杆菌 ＤＨ５α
感受态细胞ꎬ 经篮白斑筛选后ꎬ 挑取阳性菌落扩
繁ꎬ 并用小量抽提试剂盒回收重组质粒ꎬ 经 ＥｃｏＲ
Ｉ和 Ｘｂａ Ｉ 双酶切后电泳ꎬ 结果如图 ２ 所示ꎮ 重
组质粒均可酶切出两条片段ꎬ 除 ２ ８００ ｂｐ左右的
ｐＵＣｍ￣Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ自身片段外ꎬ 还有一条 ８５０ ｂｐ 左
右的插入片段ꎬ 与扩增片段长度相符ꎬ 证实扩增
片段已成功的插入重组质粒中ꎮ
将经酶切鉴定的阳性菌落送交上海生工公司
进行测序ꎬ 测序结果表明ꎬ 所克隆的 ｃＤＮＡ片段
长度为 ８３１ ｂｐꎬ 其最大读码框位于 ２ ~ ８２９ ｂｐ 之
间ꎬ 共 ８２８个碱基ꎬ 编码 ２７６个氨基酸残基 (图
３)ꎮ 在 ＧｅｎＢａｎｋ上共检索到 ９ 个梨 ＡＣＣ 氧化酶
基因 ｃＤＮＡ 序列ꎬ ＧｅｎＢａｎｋ 编号分别为 ＥＦ４５１０６０
(幸水梨)、 Ｄ６７０３８ (长十郎梨)、 ＥＵ０４７７０８ (雪
花梨)、 ＡＢ２６５７９７ (鸭梨)、 Ｘ８７０９７ (帕斯－卡
桑梨)、 ＥＵ０４７７０９ (黄金梨)、 ＥＵ０４７７１０ (茄
梨)、 ＡＪ５０４８５７ (葡脆梨) 和 ＡＢ０４２１１１ (长十
郎梨)ꎮ 借助 ＤＮＡＳＴＡＲ 软件ꎬ 将这些序列与已
克隆片段 (ＰＹ￣ＡＣＯ１) 进行核酸序列同源性比
较可知 (图 ４)ꎬ 所克隆的基因片段与其它 ９ 个
品种梨 ＡＣＣ 氧化酶基因 ｃＤＮＡ 序列的同源性均
在 ９４％以上ꎬ 其中与幸水梨、 长十郎梨和雪花梨
的 ＡＣＣ氧化酶基因的 ｃｄｓ序列同源性近似 １００％ꎮ
这说明本研究所得到的片段与前人获得的其它梨
图 １　 ＲＴ￣ＰＣＲ电泳结果
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ＲＴ￣ＰＣＲ
Ｍ: ＤＬ２０００ Ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅ １: ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｅ
图 ２　 重组质粒经 ＥｃｏＲ Ｉ和 Ｘｂａ Ｉ双酶切后电泳图谱
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｐａｔｔｅｒｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ
ｄｏｕｂｌｅｄｉｇｅｓｔ ｂｙ ＥｃｏＲ Ｉ ａｎｄ Ｘｂａ Ｉ
Ｌａｎｅ １＆２: Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｄｏｕｂｌｅｄｉｇｅｓｔ ｂｙ
ＥｃｏＲ Ｉ ａｎｄ Ｘｂａ Ｉꎻ Ｍ: １ ｋｂ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ
４２６　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 植 物 分 类 与 资 源 学 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 第 ３６卷
品种 ＡＣＣ 氧化酶基因 ｃＤＮＡ 序列一致性很高ꎬ
因而可以判定此片段为鸭梨的 ＡＣＣ 氧化酶基因
ｃＤＮＡ片段ꎮ 将此片段命名为 ＰＹ￣ＡＣＯ１ꎬ 并登陆
ＧｅｎＢａｎｋꎬ 登陆号为 ＥＵ３３３２８２ꎮ
２􀆰 ２　 鸭梨 ＡＣＣ氧化酶基因反义表达载体的构建
ＰＹ￣ＡＣＯ１在克隆到载体 ｐＵＣｍ￣Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ时存
图 ３　 鸭梨 ＡＣＣ氧化酶基因片段的 ｃＤＮＡ序列及其推导的氨基酸序列
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ ｄｅｄｕｃｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｏｆ ｃＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ＡＣＣ ｏｘｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ Ｙａｌｉ ｆｒｕｉｔ
图 ４　 不同梨品种 ＡＣＣ氧化酶基因同源性分析
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｉｓｔａｎｃｅｓ ａｓｓａｙ ｏｆ ＡＣＯ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｉｖａｒ ｏｆ ｐｅａｒｓ
５２６５期　 　 　 　 　 　 齐　 靖等: 鸭梨 ＡＣＣ氧化酶基因 ｃＤＮＡ片段的克隆及农杆菌介导的反义遗传转化　 　 　 　 　 　 　
在正、 反两种插入方式ꎬ 选择经测序验证 ＰＹ￣
ＡＣＯ１反向插入 ｐＵＣｍ￣Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ 的重组质粒ꎬ 进
行 Ｘｂａ Ｉ / Ｓａｃ Ｉ 双酶切ꎬ 电泳回收小片段ꎬ 与用
同样酶切的 ｐＢＩ１２１ 线性载体进行定向连接ꎬ 构
建鸭梨 ＡＣＣ 氧化酶的反义表达载体ꎮ 构建好的
反义表达载体图谱如图 ５所示ꎮ
将获得的反义表达载体转化农杆菌 ＬＢＡ４４０４ꎬ
在 Ｋａｎ / Ｒｉｆ抗生素平板挑取单菌落进行扩繁ꎬ 回
收质粒后进行 Ｘｂａ Ｉ / Ｓａｃ Ｉ 双酶切鉴定ꎬ 结果显
示酶切出 ８５０ ｂｐ左右片段 (图 ６)ꎬ 与 ＰＹ￣ＡＣＯ１
片段长度相符ꎻ 进一步以 ＰＹ￣ＡＣＯ１ 引物对提取
的质粒进行 ＰＣＲ鉴定ꎬ 扩增结果同图 １ꎬ 再次证
实鸭梨 ＡＣＣ氧化酶反义表达载体构建成功并已
导入农杆菌 ＬＢＡ４４０４ꎬ 该农杆菌工程菌可用于遗
传转化的研究ꎮ
２􀆰 ３　 农杆菌介导的反义表达载体对鸭梨的遗传转化
参照李桂琴等 (２０１０ａꎬｂ) 构建的鸭梨的再
生体系和遗传转化体系进行鸭梨的遗传转化ꎮ 以
预培养 ２ ｄ的鸭梨叶片愈伤组织为起始材料ꎬ 置
于 ＯＤ６００为 ０􀆰 ８的农杆菌工程菌液中浸渍 １０ ｍｉｎꎬ
其后接种于再生培养基中避光共培养 ２ ｄꎬ 再加
入 ２００ μｇ􀅰ｍＬ－１的头孢噻肟钠 (Ｃｅｆ) 抑菌ꎮ 一
周后ꎬ 共长出抗性芽 ４１２个ꎮ 将抗性芽转入再生
选择培养基培养ꎬ 待不定芽长度长至 ４ ~ ６ ｃｍ
时ꎬ 切取带有顶芽或腋芽的片段 １􀆰 ５ ~ ２ ｃｍꎬ 接
种于抗性苗筛选培养基上培养ꎬ 中间更换培养基
一次ꎬ 最终共得到 Ｋａｎ 抗性鸭梨苗 ２９ 株ꎬ 占抗
性芽总数的 ７􀆰 ０３％ꎮ
２􀆰 ４　 转基因鸭梨的 ＰＣＲ鉴定
提取 Ｋａｎ 抗性鸭梨转基因植株总 ＤＮＡꎬ 根
据 ＧｅｎＢａｎｋ 上公布的 ＮＰＴ ＩＩ 基因序列设计一对
特异性引物ꎬ 对鸭梨转基因植株进行 ＰＣＲ 鉴定ꎬ
结果如图 ７所示ꎮ 可以看出ꎬ 以未转基因鸭梨植
株 ＤＮＡ为模板的阴性对照 (泳道 ２) 没有扩增
产物ꎬ 而以反义表达载体质粒为模板的阳性对照
(泳道 １) 和 ４ 株转基因植株均能扩增出 ８００ ｂｐ
的目标片段ꎬ 与设计长度相符ꎬ 初步证实这 ４ 株
鸭梨植株中反义 ＡＣＣ氧化酶基因已经成功转化ꎮ
而另外 ２５株鸭梨未能扩增出目标片段ꎬ 表现为
假阳性ꎬ 占 Ｋａｎ抗性植株总数的 ８６􀆰 ２１％ꎮ
图 ５　 鸭梨 ＡＣＣ氧化酶反义表达载体图谱
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｄｉａｇｒａｍ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｅｘｐｒｅｓｓ ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ ＰＹ￣ＡＣＯ１
图 ６　 鸭梨 ＡＣＣ氧化酶反义表达载体经 Ｓａｃ Ｉ
和 Ｘｂａ Ｉ双酶切后电泳图谱
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｐａｔｔｅｒｎ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｅｘｐｒｅｓｓ ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ
ＰＹ￣ＡＣＯ１ ｄｏｕｂｌｅｄｉｇｅｓｔ ｂｙ ＥｃｏＲ Ｉ ａｎｄ Ｘｂａ Ｉ
Ｍ: １ ｋｂ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒꎻ Ｌａｎｅ １＆２: ａｎｔｉｓｅｎｓｅ
ｅｘｐｒｅｓｓ ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ ＰＹ￣ＡＣＯ１
图 ７　 鸭梨转基因植株 ＰＣＲ鉴定结果
(泳道 １为阳性对照ꎻ 泳道 ２为阴性对照ꎻ
泳道 ３~８为鸭梨转基因植株)
Ｆｉｇ􀆰 ７　 ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｙａｌｉ ｐｌａｎｔ
(Ｌｉｎｅ １ ｉｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ ｌｉｎｅ ２ ｉｓ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ
ｌｉｎｅ ３－８ ｉｓ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｙａｌｉ ｐｌａｎｔｓ)
６２６　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 植 物 分 类 与 资 源 学 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 第 ３６卷
２􀆰 ５　 转基因鸭梨的 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析
将经 ＰＣＲ鉴定呈阳性的转基因鸭梨植株总
ＤＮＡ用 ＥｃｏＲ Ｉ 酶切后ꎬ 电泳转膜ꎬ 以 ３５Ｓ 启动
子片段为探针进行 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交ꎬ 对转基因植株
进行进一步鉴定ꎮ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交结果 (图 ８) 表
明ꎬ ４株经 ＰＣＲ 鉴定呈阳性的鸭梨转基因植株
(泳道 ３~５) 均检测到了杂交信号ꎬ 外源基因转
入植株的拷贝数除 １ 株 (第 ６ 泳道) 为双拷贝
外ꎬ 其中 ３株均为单拷贝ꎻ 而未转化对照植株中
没有出现任何杂交信号ꎮ 从而再次证实鸭梨
ＡＣＣ氧化酶反义基因已经成功转化到了这 ４ 棵
植株中ꎮ
图 ８　 转基因鸭梨植株的 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析结果
(Ｍ为地高辛标记的 ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒꎻ １为阳性对照ꎻ ２为未转
基因鸭梨植株ꎻ ３~６为转基因鸭梨植株)
Ｆｉｇ􀆰 ８　 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｙａｌｉ ｐｌａｎｔｓ
(Ｍ: Ｄｉｇ ｌａｂｅｌｅｄ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒꎻ ｌｉｎｅ １ ｉｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ ｌｉｎｅ ２
ｉｓ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ ｌｉｎｅ ３~６ ｉｓ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｙａｌｉ ｐｌａｎｔｓ)
３　 讨论
鸭梨为多年生木本果树ꎬ 因其具有童期长、
基因高度杂合的特性ꎬ 使得借助传统育种方法育
种困难重重ꎬ 而反义 ＲＮＡ技术凭借其专一性高、
育种周期短的优势给梨育种带来了一条新的途
径ꎮ 借助反义 ＲＮＡ技术ꎬ 将 ＡＣＣ 氧化酶基因片
段反向连接在一启动子上并转化梨植株ꎬ 必将会
极大的加快耐储梨新品种的培育步伐ꎮ 对于反义
ＲＮＡ技术而言ꎬ 构建到反义表达载体中的基因
片段正确与否关乎整个实验的成败ꎮ 本研究根据
ＡＣＣ氧化酶基因保守序列设计引物ꎬ 借助 ＲＴ￣
ＰＣＲ方法所克隆的 ｃＤＮＡ片段经序列分析显示出
与其它梨品种来源 ＡＣＣ 氧化酶基因序列的高度
同源性ꎬ 这充分证实该片段为鸭梨 ＡＣＣ 氧化酶
基因组成部分ꎬ 以此片段制备的反义表达载体可
特异性抑制鸭梨内源 ＡＣＣ 氧化酶基因的表达ꎮ
同时ꎬ 也正是基于该片段与其他梨品种 ＡＣＣ 氧
化酶基因序列的高度同源ꎬ 本研究所构建的反义
表达载体也可以应用到其它梨品种的转基因研究
中ꎬ 而不受到品种区别的限制ꎬ 这会给今后开展
其它梨品种应用反义 ＲＮＡ 技术延长果实贮藏期
带来很大的方便ꎮ
李桂琴等 (２０１０ａꎬｂ) 构建了鸭梨的再生体
系和遗传转化体系ꎬ 本研究对鸭梨的遗传转化是
在其再生体系的基础上进行的ꎬ 但考虑到所应用
的农杆菌类型不同、 抑菌素类型不同 (其农杆
菌为 ＥＨＡ１０５ꎬ 抑菌素为羧苄青霉素)ꎬ 我们对
影响鸭梨遗传转化的因素进行了再次分析 (未
发表)ꎮ 结果发现ꎬ 除农杆菌工程菌液浓度、 侵
染时间不同外ꎬ 其它遗传转化条件均一致ꎮ 可
见ꎬ 与植物基因型相比ꎬ 农杆菌类型对遗传转化
体系的影响较小ꎬ 仅局限于侵染条件有所区别ꎮ
但是对于同一物种应用不同的农杆菌进行遗传转
化时ꎬ 还是应根据农杆菌的类型对已有的遗传转
化体系进行适当调整ꎬ 方能有效的实现外源基因
的转化ꎮ
一般说来ꎬ 对于转基因植物的鉴定ꎬ 最直
接、 简单的方式莫过于分子水平的检测ꎮ ＰＣＲ
扩增、 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ 杂交是常用的分
子水平检测方法ꎮ 在本研究中由于向鸭梨植株中
转化的是反义 ＡＣＣ 氧化酶基因片段ꎬ 受基因组
自身含有 ＡＣＣ 氧化酶基因的影响ꎬ 我们如果直
接针对转入的反义片段进行鉴定ꎬ 将有可能做出
错误的推断ꎮ 因此ꎬ ＰＣＲ 扩增、 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 分析都
是围绕着与反义片段同时转入的 ＮＰＴⅡ基因和
３５Ｓ启动子进行的ꎮ 尽管从分子水平上讲这种验
证是间接的ꎬ 但在反义表达载体构建时ꎬ ＮＰＴⅡ
基因、 ３５Ｓ启动子和目的基因是连接在一起的ꎬ
因而我们有理由相信目的基因也一并插入到了受
体基因组中ꎬ 这在其它反义遗传转化中也己得到
证实 (叶志彪ꎬ ２０００)ꎮ
在转基因的研究中ꎬ 抗生素筛选呈阳性ꎬ 而
经分子水平检测呈假阳性的现象常有发生 (Ｕｒ￣
ｂａｎ等ꎬ １９９４ꎻ Ｍｉｔｉｏｕｃｈｋｉｎａ和 Ｄｏｌｇｏｖꎬ ２０００)ꎮ 在
本研究中ꎬ 共得到 ２９ 个卡那霉素抗性苗ꎬ 但经
７２６５期　 　 　 　 　 　 齐　 靖等: 鸭梨 ＡＣＣ氧化酶基因 ｃＤＮＡ片段的克隆及农杆菌介导的反义遗传转化　 　 　 　 　 　 　
ＰＣＲ检测确定为转化株的抗性苗仅有 ４株ꎬ ＰＣＲ
阳性率为 １３􀆰 ７９％ꎮ 导致假阳性率偏高的原因ꎬ
可能由于我们仅对抗性苗进行了两代筛选ꎬ 且卡
那霉素浓度较低ꎬ 筛选压不够造成的ꎻ 或者有可
能在假阳性苗上存在有残留农杆菌ꎬ 降低了其周
围培养基中的卡那霉素浓度ꎬ 从而让其逃避了选
择压力而继续生长ꎮ 过多假阳性苗给我们的鉴定
工作带来了诸多不便ꎬ 因此我们建议在鸭梨的遗
传转化研究中可适当加大卡那霉素的筛选浓度并
增加筛选代数ꎬ 同时也要注意残留农杆菌的清除
工作ꎬ 以最大程度的抑制假阳性的发生ꎬ 节省科
研工作量ꎮ
大量研究证实 ＡＣＣ 氧化酶在植物体内存在
同工酶ꎬ 其编码基因构成多基因家族 (Ｋｉｍ 和
Ｙａｎｇꎬ １９９４ꎻ Ｋａｈａｎａ 等ꎬ １９９９)ꎬ 基因家族成员
间具有不同的功能和时空表达模式ꎬ 分别负责系
统 １型和系统 ２ 型乙烯的内源合成 (ＭｃＭｕｒｃｈｉｅ
等ꎬ １９７２ꎻ Ｙａｎｇ和 Ｈｏｆｆｍａｎꎬ １９８４)ꎮ 梨上是否存
在 ＡＣＣ氧化酶基因家族目前虽然并不清楚ꎬ 但
在本研究中所用反义转化的鸭梨 ＡＣＣ 氧化酶基
因片段克隆自鸭梨果实ꎬ 并仅在鸭梨花和果实中
表达 (结果将于近期发表)ꎬ 所以我们推测该
ＡＣＣ氧化酶基因主要负责鸭梨生殖器官中系统 ２
型乙烯的合成ꎬ 而营养器官中低速率基础乙烯的
生成ꎬ 即系统 １ 型乙烯的生物合成由其它 ＡＣＣ
氧化酶基因家族成员调控ꎮ 也正是由于该鸭梨
ＡＣＣ氧化酶基因在营养器官中不表达ꎬ 受材料
的限制ꎬ 我们未对转基因鸭梨中反义 ＲＮＡ 的抑
制效果做 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交等基因表达水平检测ꎬ 相
关的鉴定只能等待转基因鸭梨日后开花、 结果后
方能进行ꎮ
〔参　 考　 文　 献〕
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ｃｕｌｔｉｖａｒ ｉｎ ｔｏｍａｔｏ [Ｄ]. Ｗｕｈａｎ: Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒ￣
ｓｉｔｙ
Ｚｈａｎｇ ＸＳ (张宪省)ꎬ Ｙａｎ ＸＸ (阎先喜)ꎬ １９９４. Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｆｒｕｉｔ
ｒｉｐｅｎｉｎｇ ｂｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｅｔｈｙｌｅｎｅ [Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ａｇｒｉ￣
ｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ (山东农业大学学报)ꎬ ２５ (４): ４８７—４９０
Ｚｈｕ Ｌ (朱麟)ꎬ Ｌｉ ＪＫ (李江阔)ꎬ Ｚｈａｎｇ Ｊ (张静) ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００９.
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ １￣ＭＣＰ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｎ Ｙａ ｐｅａｒ ｓｔｏｒａｇｅ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｈａｒｖｅｓｔ
[Ｊ] . Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ (北方园艺)ꎬ ５: ２２２—２２４
８２６　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 植 物 分 类 与 资 源 学 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 第 ３６卷