全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45卷 第 17期 2014年 9月

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人参 β-actin基因实时荧光定量 PCR方法的建立
侯双利，韩 梅，刘翠晶，杨利民*
吉林农业大学中药材学院，吉林 长春 130118
摘 要：目的 建立人参 β-actin基因实时荧光定量 PCR的方法。 方法 根据 GenBank上其他高等植物 β-actin基因保守区
域设计一对特异性引物，将从人参中 PCR扩增得到的 β-actin基因克隆到 pMD20-T载体上构建重组质粒，经 1/10梯度稀释
后用于制定标准曲线，并进行反应的灵敏性、特异性和重复性试验。 结果 该方法检测 β-actin基因的最低拷贝数为 43 拷
贝/μL，在较广的范围内（43～4.3×107拷贝/μL）有良好的线性关系（R2＝0.995 3）；熔解曲线分析显示扩增产物为特异性单
峰，其 Tm值为（84.51±0.01）℃；5个不同浓度对照品组内试验变异系数为 0.58%～2.79%，组间试验变异系数为 2.61%～
4.41%。结论 该方法具有快速、灵敏、特异、高通量及重复性强等优点，为 β-actin基因作为内参基因进行人参功能基因表
达的定量分析提供了方法学基础。
关键词：人参；内参基因；基因克隆；实时荧光定量 PCR；SYBR Green I
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)17 - 2530 - 04
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.17.020
Development of real-time fluorescence quantitative RT-PCR assay for β-actin
gene of Panax ginseng
HOU Shuang-li, HAN Mei, LIU Cui-jing, YANG Li-min
College of Chinese Medicinal Materials, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China
Abstract: Objective To construct a real-time fluorescence quantitative RT-PCR method for the β-actin gene of Panax ginseng.
Methods According to the β-actin gene of other higher plants available in Genbank, A pair of primers weredesigned and the amplified
fragment of β-actin gene was linked with pMD20-T vector to construct recombinant plasmids. Then the positive plasmids were diluted
and the standard curve was established. The sensitivity, specificity, and repeatability were detected. Results The results showed that
the lowest copy number for detection of β-actin gene with this method was 43.0 copies/μL, and there was a good linear relationship in
a wide range from 43 to 4.3 × 107 copies/μL (R2 = 0.995 3). The melting curve showed a single peak with the temperature of (84.51 ±
0.01) ℃. The coefficient of variation (CV) of five different concentration of positive plasmids was 0.58% to 2.79% and 2.61% to 4.41%
in intra-assay and inter-assay, respectively. Conclusion The method established in this paper has the advantage of rapidity, sensitivity,
specificity, high throughput, and good repeatability, which provides a methodological basis for the quantitative analysis on the
functional genes of P. ginseng when β-actin gene is taken as a reference gene.
Key words: Panax ginseng C. A. Meyer; reference gene; gene cloning; real-time fluorescence quantitative PCR; SYBR Green I

实时荧光定量 PCR（ real-time fluorescence
quantitative PCR，RT-PCR）是 20世纪 90年代兴起
的一种准确、快速的核酸定量分析技术[1]，是定量
研究基因表达最为有效的方法之一[2-4]。它是指在
PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累
实时监测整个 PCR进程，最后通过标准曲线对未知
浓度的样品进行定量分析[5]。它分为相对定量和绝
对定量，在相对定量检测中，对来自不同样本中特
定基因的 mRNA表达量进行比较分析时，理想的条
件是不同样品之间的起始细胞数目、RNA提取效率
及目的基因扩增效率等都相同，但实际上这些条件
不可能同时得到满足[6]。因此，需要同时对不同样
本中的内参基因进行定量 PCR，以此对目的基因的
定量结果进行校正。内参基因通常是指在不同发育

收稿日期：2014-02-16
基金项目：国家自然科学基金资助项目（31270371）；国家科技支撑计划项目（2011 BA I03B01-02）；吉林省科技成果转化项目（20125068）
作者简介：侯双利（1989—），吉林长春人，硕士研究生，主要从事药用植物分子生态学研究。
*通信作者 杨利民 Tel: (0431)84533276 E-mail: ylmh777@126.com
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阶段和不同组织细胞中均恒定表达的管家基因，常用
的内参基因有 β-actin、GAPDH、UBC、Tub、TBP 及
ABL 基因等。其中，β-actin 基因作为内参基因被广泛
使用，它是构成细胞骨架的主要组成成分，具有基因
序列高度保守、mRNA 表达量高且稳定的特点[7-11]。
人参 β-actin 基因作为人参实时荧光定量 PCR 的内
参基因尚未见报道，本研究根据 GenBank 中其他高
等植物的 β-actin 基因保守区域设计一对引物，建立
了人参 β-actin 基因的实时荧光定量 PCR 方法，为
以 β-actin 基因作为内参基因进行人参功能基因的
表达差异研究奠定基础。
1 材料与仪器
1.1 材料
五年生人参取自吉林省抚松县抚南林场
（42°03′06′′ N、127°33′21′′ E），经吉林农业大学中药
材学院杨利民教授鉴定为五加科植物人参 Panax
ginseng C. A. Meyer。实验所用部位为人参主根。
1.2 主要试剂与仪器
植物 RNA 提取试剂盒购自北京艾德莱生物科
技有限公司，反转录试剂盒、2×Power Taq PCR
Mastermix、质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、
DNA 连接试剂盒等均购自北京百泰克生物科技有
限公司，SYBR Premix ex Taq 试剂盒、LB 培养基购
自宝生物工程（大连）有限公司，JM109 感受态菌
株购自北京鼎国生物技术有限公司。
荧光定量 PCR 仪（Mx3000P，美国）；凝胶成像
系统 [Tanon Gis 2010，天能科技（上海）有限公司]；
普通 PCR 扩增仪（Gene Amp 9700，西班牙）；核酸
蛋白质检测仪 DU800（Beckman，美国）；MDF—382E
超低温冰箱（Sanyo，日本）。
2 方法
2.1 引物设计与合成
通 过 对 刺 五 加 （ KC469585 ）、 陆 地 棉
（AY305726）、葡萄（FQ383380）、桦树（FJ410442）、
芍药（ JX310002 ）、白杨（ EF418792 ）、油桐
（JQ680035）等几种植物的 β-actin 基因核苷酸序列
进行同源性比较，找出高度保守区的片段，根据引
物设计原则，利用 DANMAN 和 Primer 5.0 生物软
件设计一对特异性定量 PCR 引物 F、R，用于扩增
人参 β-actin 基因片段，推测目的片段的长度为 140
bp 左右。引物由生工生物工程上海有限公司合成，
正向：5’-GGCATCACACTTTCTACAACG-3’，反向：
5’-GGCAGGAACATTAAAGGTTTC-3’。
2.2 总 RNA提取与反转录
人参根部总 RNA 提取方法按照试剂盒说明书
操作，并以提取的总 RNA 为模板，以 Oligo-dT 为
引物，将 RNA 反转录合成 cDNA，保存于−20 ℃。
2.3 β-actin基因目的片段扩增、克隆及鉴定
2.3.1 目的片段 PCR 扩增 以反转录合成的
β-actin cDNA 为模板，进行普通 PCR 扩增。反应总
体系为 20 μL：ddH2O 8 μL，2×Taq PCR Mastermix
10 μL，上下游引物各 0.5 μL，反转录产物 1 μL。PCR
反应程序：94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性 30 s，60 ℃
退火 30 s，72 ℃延伸 15 s，进行 33 个循环，最后
72 ℃延伸 10 min。取 5 μL 扩增产物在 2%琼脂糖凝
胶电泳上检测，目的片段回收和纯化按照回收试剂
盒说明书操作。
2.3.2 克隆与转化 将纯化产物与 pMD20-T Vector
连接，总体系为 10 μL：目的片段 3 μL，pMD20-T
Vector 1 μL，ddH2O 1 μL，Solution I 5 μL，16 ℃反
应 30 min。将连接产物转化到大肠杆菌 JM109 感受
态细胞中，涂布于含 X-gal 和 ITPG 且具氨苄青霉素
（Amp）抗性的 LB 琼脂平板培养基上，37 ℃倒置培
养 13～16 h 至平皿上长出蓝白菌落。
2.3.3 阳性克隆的 PCR 鉴定及测序 挑取白色菌
落接种于 LB（Amp）液体培养基中，37 ℃振荡培
养过夜，以菌液为模板进行 PCR 扩增鉴定，并将
PCR 检测为阳性克隆的菌液送生工生物工程上海
有限公司进行测序。
2.4 SYBR Green I RT-PCR方法的建立
2.4.1 阳性对照品的制备 含目的片段的重组质粒
经 PCR 扩增和测序鉴定后，采用质粒提取试剂盒提
取质粒，用核酸蛋白质检测仪检测并准确定量，换
算出单位体积的拷贝数，即为 β-actin 阳性的对照品。
2.4.2 反应体系的优化 采用 SYBR Green I 染料
法，在 Mx3000P 荧光定量 PCR 仪上进行扩增和数
据分析，以得到最小 Ct 值和最大的荧光值（ΔRn）
为标准，分别对退火温度、引物浓度、循环条件（2
步法和 3 步法）进行优化，确定最佳扩增条件。优
化后的反应体系为 25 μL：去离子水 9.5 μL，SYBR
Premix ex Taq 12.5 μL，上下游引物各 0.5 μL，Rox
Reference Dye II 0.5 μL，cDNA 2 μL；反应条件：95
℃预变性 30 s，95 ℃变性 15 s，60 ℃退火 30 s，72
℃延伸 15 s，进行 40 个循环。
2.4.3 熔解曲线分析 为排除引物二聚体及非特异
性扩增产物对 RT-PCR 结果的影响，在 PCR 后进行熔
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解曲线分析以确定得到的产物是否为目的产物，温度
以 0.5 ℃/10 s 的速率从 55 ℃缓慢递增到 95 ℃，连
续测定样品的荧光强度以获取熔解曲线。
2.4.4 标准曲线的建立 以定量的阳性对照品进行
10 倍系列稀释作为模板，采用优化好的条件进行
SYBR Green I 荧光定量 RT-PCR。
2.5 可重复性评价
分别对 5 个不同浓度的阳性对照品及 2 个阴性
对照品（以水为模板）在同一次扩增中进行 4 次重
复测定，计算每个样品各反应管之间的批内变异系
数；对上述样品分别进行 4 次测定（各相隔 1 周），
计算同一样品每次测定结果之间的组间变异系数。
3 结果与分析
3.1 PCR扩增
人参根部总 RNA 经反转录合成 cDNA 后，进
行常规 PCR 后，得到约 140 bp 大小的目的片段，
与预期结果一致（图 1）。

M-Marker 1～4-目的片段
M-Marker 1—4-target fragment
图 1 β-actin基因的 RT-PCR结果
Fig. 1 RT-PCR of β-actin gene
3.2 目的片段的克隆与鉴定
回收目的片段进行 T-A 克隆，经转化大肠杆
菌 JM109，然后对阳性克隆菌液进行 PCR 扩增
鉴定，电泳结果得到约 140 bp 左右的条带，与预
期结果一致（图 2）。对 β-actin 基因阳性克隆进
行测序，发现阳性克隆中含 137 bp 的外源碱基，
经序列比对，证实与其他高等植物 β-actin 基因
核苷酸序列同源性达到 92%，说明重组质粒构建
正确，可作为建立荧光定量 RT-PCR 方法的阳性
对照品。
3.3 熔解曲线分析
将荧光定量 RT-PCR 产物进行熔解曲线分析
（图 3），β-actin 基因片段在 Tm＝（84.51±0.01）℃

M-Marker 1-阴性对照 2～4-阳性克隆
M-Marker 1-negative control 2—4-target fragment
图 2 菌液 PCR鉴定结果
Fig. 2 PCR identification of bacteria liquid

图 3 β-actin基因的熔解曲线
Fig. 3 Melting curve of β-actin gene
处显示特异性单峰，说明扩增产物无引物二聚体及
非特异性扩增，证实了引物设计的合理性和特异性。
3.4 标准曲线的建立
本实验 β-actin 阳性对照品原始质量浓度为
14.14 μg/mL，换算成拷贝数即 4.3×109 拷贝/μL。
将定量的阳性对照品进行 10 倍系列稀释，以优化好
的条件进行荧光定量 RT-PCR 扩增，得到的扩增曲
线（图 4）和标准曲线结果显示。以 Ct 值为纵坐标
（Y），以稀释倍数的对数为横坐标（X）建立相对定量
标准曲线，回归方程为 Y＝−3.339 8 X＋30.989。该方
法检测的 β-actin 最低拷贝数为 43 拷贝/μL，在 43～
4.3×107拷贝/μL 有良好的线性关系（R2＝0.995 3），
扩增效率为 99.3%。
3.5 可重复性评价
对线性范围内的 5 个不同质量浓度进行了批
内检测和批间检测，计算出组内变异系数和组间
变异系数。结果显示，β-actin 阳性对照质粒组内
试验变异系数为 0.58%～2.79%，组间试验变异
系数为 2.61%～4.41%，表明该方法具有良好的
重复性。
250 bp
100 bp
M 1 2 3 4
500 bp
750 bp
1000 bp
2000 bp

2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
500 bp
100 bp
250 bp
750 bp
1000 bp
2000 bp

M 1 2 3 4
2 0 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
0
0
0
0
0
0
NTC
1 410
1 110
810
51
21
−90
荧
光
强
度

55 60 65 70 75 80 85 90
Tm / ℃
M 1 2 3 4
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图 4 β-actin基因的扩增曲线
Fig. 4 Amplification curve of β-actin gene
4 讨论
RT-PCR 技术是分析目的基因转录水平最为敏
感的方法，与传统的定量方法如 Northern blotting、
竞争性 PCR、RT-PCR 半定量检测相比，具有重复
性好、灵敏度高、定量准确、速度快等优点，能对
mRNA进行准确定量[12]。SYBR Green I是一种DNA
结合染料，能非特异性地掺入到双链 DNA 中去，
在游离状态下，SYBR Green I 不发出荧光，但结合
到双链 DNA 中以后，便可以发出荧光[13]。然而，
由于其能与任意 DNA 双链结合，并可用于任意反
应体系中，所以一旦反应体系中出现非特异性扩增，
就会影响到定量结果的准确性与稳定性[14]。因此对
引物的设计和反应体系的优化显得尤为重要。
RT-PCR 分为绝对定量和相对定量，绝对定量是
根据已知标准曲线来检测未知样品的精确拷贝数[15]；
相对定量只比较不同样本之间基因表达差异，不对基
因表达水平进行精确的拷贝数计算。相对定量通常需
要内参基因作为对照，以此对目的基因进行校正和标
准化，进而减少不同样本间 RNA 提取效率、逆转录
及扩增效率的差异对定量结果带来的误差，提高相对
定量结果的可靠性和重复性。因此，内参基因在荧光
定量RT-PCR技术对目的基因进行相对定量和定性分
析中起着至关重要的作用。
β-actin基因常作为内参基因对定量结果进行校
正，但目前尚未见到有关人参 β-actin 基因用于荧光
定量 PCR 分析的报道。近年来，随着对人参各种功
能基因的克隆和测序的完成，对这些基因在不同种
组织细胞及不同个体中表达水平的定量分析，有助
于阐明这些基因的功能及其与人参药效成分含量的
关系，进而有利于选育优良品种，增加人们对人参
主要药效成分生物合成途径的分子机制的认识。因
此，为了给人参基因表达的定量分析提供必要的方
法手段，本研究建立了基于 SYBR Green I 染料技术
的人参 β-actin 基因 RT-PCR 方法。实验结果表明，
所建立的方法具有用时短、高通量、扩增效率高、
线性范围广及重复性强等优点，为 β-actin 作为内参
基因对人参相关基因 mRNA 水平的荧光定量 PCR
分析提供了有力的方法学基础。
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2010, 354(1/2): 34-39.
NTC
11 408
9 408
7 408
5 408
3 408
1 408
−592
荧
光
强
度

1 6 11 16 21 26 31 36
循环次数