全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 16 期 2014 年 8 月

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铁皮石斛内生真菌 Verticillium sp. KY-18 的化学成分研究
任慧慧 1, 2，许 蕾 1, 2，杨胜祥 1, 2*，桂仁意 2
1. 浙江农林大学 浙江省林业生物质化学利用重点实验室，浙江 临安 311300
2. 浙江农林大学 亚热带森林培育国家重点实验室，浙江 临安 311300
摘 要：目的 研究铁皮石斛 Dendrobium officinale 内生真菌 Verticillium sp. KY-18 中氧杂环类化合物。方法 采用色谱分离
技术进行分离和纯化，并根据谱学数据鉴定化合物的结构。结果 从 Verticillium sp. KY-18 的发酵产物中分离得到 13 个氧杂
环类化合物，分别鉴定为2, 6-dihydroxy-2-methyl-7-(prop-1E-enyl)-1-benzofuran-3(2H)-one（1）、nigrosporapyrone D（2）、oosponol
（3）、2-甲基-4-吡喃酮（4）、6-甲基-5-[(1E)-丁烯基]-2-吡喃酮（5）、penicisochroman D（6）、verrucosapyrone B（7）、(1S, 3S)-1,
8-dimethoxy-3, 5-dimethyl-6-hydroxyisochroman（8）、phomopsinone A（9）、pseudohalonectrin A（10）、dictafolin-A（11）、2,
3-dihydro-5, 7-dihydroxy-2, 6, 8-trimethyl-4H-1-benzopyran-4-one（12）、2-pyrone-4, 6-dicarboxylic acid（13）。结论 化合物 2～
10 为首次从该属真菌中分离得到；化合物 11～13 为首次从该真菌中分离得到。
关键词：：铁皮石斛；内生真菌；氧杂环；nigrosporapyrone D；2-甲基-4-吡喃酮；6-甲基-5-[(1E)-丁烯基]-2-吡喃酮
中图分类号：R284.1 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)16 - 2312 - 04
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.16.006
Chemical constituents in endophytic fungus Verticillium sp. KY-18 isolated from
Dendrobium officinale
REN Hui-hui1, 2, XU Lei1, 2, YANG Sheng-xiang1, 2, GUI Ren-yi2
1. Zhejiang Provincial Key Laboratory of Chemical Utilization of Forestry Biomass, Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, China
2. The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture, Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, China
Abstract: Objective To study the chemical constituents in the endophytic fungus Verticillium sp. KY-18, isolated from Dendrobium
candidum. Methods The compounds were isolated and purified by means of chromatographic techniques and their structures were
identified on the basis of spectral features. Results Thirteen known compounds belong to oxygen heterocyclic compounds, named 2,
6-dihydroxy-2-methyl-7-(prop-1E-enyl)-1-benzofuran-3 (2H)-one (1), nigrosporapyrone D (2), oosponol (3), 2-methyl-4-pyrone (4),
5-(1E-butenyl)-6-methylpyran-2-one (5), penicisochroman D (6), verrucosapyrone B (7), (1S, 3S)-1, 8-dimethoxy-3, 5-
dimethyl-6-hydroxyisochroman (8), phomopsinone A (9), pseudohalonectrin A (10), dictafolin-A (11), 2, 3-dihydro-5, 7-dihydroxy-2,
6, 8-trimethyl-4H-1-benzopyran-4-one (12), and 2-pyrone-4, 6-dicarboxylic acid (13). Conclusion Compounds 2—10 are first
isolated from the plants of Verticillium genus, and compounds 11—13 are first obtained from fungi.
Key words: Dendrobium officinale Kimura et Migo.; endophytic fungus; oxygen heterocycles; nigrosporapyrone D; 2-methyl-4-pyrone;
5-(1E-butenyl)-6-methylpyran-2-one

植物内生真菌是指那些生活史的一定阶段或全
部阶段生活在健康植物的各种组织或器官内部的真
菌。研究发现内生真菌能产生许多活性次生代谢产
物，从而能够增强植物的抗逆性，表现在非生物胁
迫（如抗高温、抗干旱等）和生物胁迫（如阻抑昆
虫和食草动物的采食、抵抗病虫害等）方面。通过
与寄主植物的长期“协同进化”，某些内生真菌具有
了产生与宿主植物相同或相似的生物活性物质的能
力。自从 1993 年，美国蒙大拿州立大学的 Strobel 小
组在短叶红豆杉内生真菌 Taxomyces andreanae
Andrea Stierle 中发现紫杉醇，国内外掀起对药用植
物和濒危植物内生真菌的研究热潮，很多新颖结构

收稿日期：2014-05-22
基金项目：国家自然科学基金资助项目（31200262）；浙江省重中之重林学一级学科开放基金（KF201302）；浙江农林大学人才启动基金（2012FR041）
*通信作者 杨胜祥，男，博士，主要从事微生物活性次生代谢产物的研究。Tel: (0571)63732775 E-mail: shengxiangyang2000@163.com
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的成分被发现，这些次级代谢产物具有抗菌、抗肿瘤、
抗病毒、提高免疫力、调节植物生长和杀虫等生物活
性[1-2]。铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo.
为兰科石斛属多年生附生草本植物的全草，为名贵中
药西枫斗的原植物，是国家重点保护药物，有除痹下
气、补五脏虚劳羸瘦、强阴之功，久服厚肠胃轻身延
年之效[1]。目前，关于铁皮石斛内生真菌化学成分的
研究较少。本实验对铁皮石斛内生真菌 Verticillium sp.
KY-18 的化学成分进行了研究，从该菌的发酵产物中
分离得到 13 个化合物，分别鉴定为 2, 6-dihydroxy-2-
methyl-7-(prop-1E-enyl)-1-benzofuran-3(2H)-one（1）、
nigrosporapyrone D（2）、oosponol（3）、2-甲基-4-
吡喃酮（2-methyl-4-pyrone，4）、6-甲基-5-[(1E)-丁
烯基 ]-2-吡喃酮 [5-(1E-butenyl)-6-methylpyran-2-
one，5]、penicisochroman D（6）、verrucosapyrone B
（7）、(1S, 3S)-1, 8-dimethoxy-3, 5-dimethyl-6-hydroxy-
lisochroman（8）、phomopsinone A（9）、pseudohalo-
nectrin A（10）、dictafolin-A（11）、2, 3-dihydro-5,
7-dihydroxy-2, 6, 8-trimethyl-4H-1-benzopyran-4-
one（12）、2-pyrone-4, 6-dicarboxylic acid（13）。其中
化合物 2～10 为首次从该属真菌中分离得到，化合物
11～13 为首次从该真菌中分离得到。
1 仪器与材料
XRC—1 型显微熔点仪（四川大学科仪厂）；
Bruker DRX—500 型核磁共振仪（Bruker 公司）；
VG AUTO Spec—3000 质谱仪（VG 仪器公司）。柱
色谱用硅胶（100～200 目和 200～300 目）和薄层
色谱用硅胶 GF254均由青岛海洋化工厂生产。反相用
材料 RP18为 Merck 公司产品。其余试剂均为分析纯。
本实验所用的铁皮石斛内生真菌由浙江农林大
学天然产物化学研究室提供（编号为 KY-18），是从
铁皮石斛 Dendrobium officinale Kimura et Migo. 的
新鲜枝中分离得到的，形态鉴定法确定该菌种为轮
枝菌属 Verticillium sp.。铁皮石斛和内生真菌由浙江
农林大学毛凤胜高级实验师鉴定。
2 液体发酵
发酵培养基（氯化钙 0.5 g、磷酸二氢钾 0.1 g、
氯化钾 0.05 g、硫酸镁 0.1 g、葡萄糖 20.0 g、蛋白
胨 15.0 g、1 000 mL 水、pH 6.0）。在 1 000 mL 的
三角瓶中加入 200 mL 液体培养基，灭菌。无菌条
件下取 8～10 mm2 大小的菌苔 2～3 块接入液体培
养基中，先在 28 ℃的摇床上静置培养 1 d，然后 120
r/min 旋转震荡培养 6 d，共发酵 30 L，经滤过后分
别获得菌丝体和发酵液。
3 提取与分离
将发酵产物滤过后分别得到发酵液和菌丝体，
菌丝体用甲醇超声提取 3 次后，合并提取液，减压
浓缩得到甲醇浸膏。甲醇浸膏加水悬浮，用环己烷
脱脂后再用醋酸乙酯萃取得到浸膏 9.5 g。醋酸乙酯
部分经硅胶柱色谱，氯仿-甲醇（100∶0→0∶100）
梯度洗脱，通过薄层色谱检测合并相同的部分，得
到 7 个组分 Fr. 1～7。Fr. 2 经硅胶（200～300 目）
柱色谱，石油醚-丙酮（20∶1→1∶1）梯度洗脱后，
合并得到 5 个组分 Fr. 2A～2E。Fr. 2B经过 Sephadex
LH-20（甲醇）分离后得到化合物 1（7.2 mg）和 2
（5.9 mg）；Fr. 2D 经过 Sephadex LH-20（甲醇）分
离后，再通过 PTLC（石油醚-丙酮 5∶1）制备得到
化合物 3（6.3 mg）。Fr. 3 通过 RP18色谱，甲醇-水
（20∶80→0∶100）梯度洗脱，合并得到 5 个组分
Fr. 3A～3E。Fr. 3B 经过 2 次 PTLC（二氯甲烷-甲醇
15∶1）得到化合物 4（8.0 mg）、5（7.8 mg）和 6
（10.1 mg）；Fr. 3C 经 Sephadex LH-20（二氯甲烷-
甲醇 1∶1）分离后，再用甲醇重结晶得到化合物 7
（6.6 mg）和 8（10.2 mg）。Fr. 4 通过 RP18 色谱，甲
醇-水（20∶80→0∶100）梯度洗脱，合并得到 3 个
组分（Fr. 4A～4C）。Fr. 4B 经过 Sephadex LH-20（甲
醇）分离后，再通过 RP18分离得到化合物 9（5.9 mg）
和 10（9.2 mg）；Fr. 4C 经过 Sephadex LH-20（甲醇）
分离后，再通过 RP18分离和 PTLC 制备（二氯甲烷-
甲醇 9∶1）得到化合物 11（8.2 mg）、12（5.2 mg）
和 13（6.9 mg）。
4 结构鉴定
化合物 1：淡黄色粉末。1H-NMR (500 MHz,
CD3OD) δ: 7.18 (1H, dd, J = 16.0, 1.5 Hz, H-1′), 7.08
(1H, d, J = 8.0 Hz, H-4), 7.03 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5),
6.37 (1H, dd, J = 16.0, 7.0 Hz, H-2′), 1.86 (3H, dd, J =
7.0, 1.5 Hz, H-3′), 1.53 (3H, s, 2-CH3)；13C-NMR (125
MHz, CD3OD) δ: 202.7 (C-3), 160.3 (C-6), 143.5
(C-3a), 131.6 (C-7), 129.4 (C-2′), 126.9 (C-1′), 125.6
(C-5), 119.3 (C-4), 116.9 (C-7a), 105.1 (C-2), 22.6
(2-CH3), 19.1 (C-3′)。以上数据与文献报道一致[2]，故
鉴定化合物 1 为 2, 6-dihydroxy-2-methyl-7-(prop-
1E-enyl)-1-benzofuran-3(2H)-one。
化合物 2：无色粉末。1H-NMR (500 MHz,
CDCl3) δ: 6.68 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-5), 5.72 (1H, d,
J = 2.5 Hz, H-3), 3.88 (3H, s, H-9), 2.53 (3H, s, H-8)；
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13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ: 192.1 (C-7), 169.9
(C-4), 161.6 (C-2), 154.5 (C-6), 103.9 (C-5), 93.3
(C-2), 56.1 (C-9), 26.0 (C-8)。以上数据与文献报道一
致[3]，故鉴定化合物 2 为 nigrosporapyrone D。
化合物 3：无色针状结晶。1H-NMR (500 MHz,
CDCl3) δ: 8.09 (1H, dd, J = 8.0, 0.8 Hz, H-5), 7.91
(1H, s, H-10), 7.75 (1H, dd, J = 8.0, 0.8 Hz, H-6), 7.14
(1H, dd, J = 8.0, 0.8 Hz, H-7), 4.67 (2H, s, H-12)；13C-
NMR (125 MHz, CDCl3) δ: 196.2 (C-11), 164.1 (C-2),
162.0 (C-4), 150.6 (C-10), 138.7 (C-6), 134.3 (C-8),
117.6 (C-5), 116.1 (C-7), 115.9 (C-9), 106.0 (C-3),
65.6 (C-12)。以上数据与文献报道一致[4]，故鉴定化
合物 3 为 oosponol。
化合物 4：无色液体。1H-NMR (500 MHz,
CDCl3) δ: 7.67 (1H, d, J = 6.0 Hz, H-6), 6.27 (1H, dd,
J = 6.0, 2.5 Hz, H-5), 6.16 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-3),
2.26 (3H, s, H-2′)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ:
179.4 (C-4), 166.8 (C-2), 155.4 (C-6), 116.7 (C-5),
115.5 (C-3), 20.0 (C-2′)。以上数据与文献报道一致[5]，
故鉴定化合物 4 为 2-甲基-4-吡喃酮。
化合物 5：无色胶状物。1H-NMR (500 MHz,
CDCl3) δ: 7.50 (1H, d, J = 9.5 Hz, H-4), 6.18 (1H, d,
J = 9.5 Hz, H-3), 6.14 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-5a), 5.91
(1H, dt, J = 16.0, 6.5 Hz, H-5b), 2.29 (3H, s, H-6a),
2.20 (2H, m, H-5c), 1.06 (3H, t, J = 7.5 Hz, H-5d)；
13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ: 162.2 (C-2), 157.9
(C-6), 142.8 (C-4), 133.3 (C-5b), 120.7 (C-5a), 113.7
(C-3, 5), 26.3 (C-5c), 17.2 (C-6a), 13.8 (C-5d)。以上
数据与文献报道一致[6]，故鉴定化合物 5 为 6-甲基-
5-[(1E)-丁烯基]-2-吡喃酮。
化合物 6：无色胶状物。1H-NMR (500 MHz,
CDCl3) δ: 7.12 (1H, t, J = 8.0 Hz, H-3), 6.74 (1H, d,
J = 8.0 Hz, H-2), 6.70 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-4), 4.86
(1H, d, J = 13.0 Hz, H-8a), 4.79 (1H, d, J = 13.0 Hz,
H-8b), 3.91 (1H, m, H-6), 1.24 (3H, d, J = 6.0 Hz,
H-9)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ: 156.3 (C-1),
137.8 (C-4a), 129.1 (C-3), 124.9 (C-8a), 122.6 (C-4),
115.0 (C-2), 69.2 (C-6), 58.6 (C-8), 41.8 (C-5), 23.5
(C-9)。以上数据与文献报道一致[7]，故鉴定化合物
6 为 penicisochroman D。
化合物 7：无色粉末。1H-NMR (500 MHz,
CD3OD) δ: 6.06 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-5), 5.45 (1H, d,
J = 2.5 Hz, H-3), 4.17 (1H, dd, J = 8.0, 4.5 Hz, H-1′),
3.77 (3H, s, 3-OCH3), 0.88 (3H, t, J = 7.5 Hz, H-3′)；
13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ: 175.8 (C-4), 170.8
(C-6), 169.2 (C-2), 102.0 (C-5), 90.7 (C-3), 74.4
(C-1′), 59.1 (C-3-OMe), 31.0 (C-2′), 11.8 (C-3′)。以上
数据与文献报道一致 [8]，故鉴定化合物 7 为
verrucosapyrone B。
化合物 8：白色针状结晶。1H-NMR (500 MHz,
CD3OD) δ: 6.27 (1H, s, H-7), 5.42 (1H, s, H-1), 4.16
(1H, m, H-3), 3.67 (3H, s, H-13), 3.40 (3H, s, H-14),
1.94 (3H, s, H-12), 1.28 (3H, d, J = 6.5 Hz, H-11)；
13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ: 157.2 (C-8), 157.0
(C-6), 136.1 (C-10), 114.9 (C-9), 114.5 (C-5), 97.7
(C-7), 97.4 (C-1), 63.9 (C-3), 55.9 (C-13), 55.2
(C-14), 34.7 (C-4), 21.7 (C-11), 10.1 (C-12)。以上数
据与文献报道一致[9]，故鉴定化合物 8 为 (1S, 3S)-1,
8-dimethoxy-3, 5-dimethyl-6-hydroxyisochroman。
化合物 9：白色固体。1H-NMR (500 MHz,
CDCl3) δ: 5.44 (1H, s, H-3), 4.58 (1H, d, J = 14.5 Hz,
H-5a), 4.34 (1H, d, J = 14.5 Hz, H-5b), 3.81 (3H, s,
4-OCH3), 3.66 (1H, m, H-7), 0.96 (3H, t, J = 7.0 Hz,
H-11)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ: 168.6 (C-4),
164.2 (C-2), 156.6 (C-8a), 107.6 (C-4a), 88.0 (C-3),
73.9 (C-7), 56.1 (4-OCH3), 61.6 (C-5), 37.6 (C-9),
32.6 (C-8), 18.6 (C-10), 13.9 (C-11)。以上数据与文献
报道一致[10]，故鉴定化合物 9 为 phomopsinone A。
化合物 10：淡黄色无定形粉末。1H-NMR (500
MHz, CDCl3) δ: 7.30 (1H, s, H-2), 5.34 (1H, s, H-7),
4.45 (1H, s, H-4), 2.19 (3H, s, H-15), 1.86 (3H, s,
H-14), 1.62 (2H, q, J = 7.0 Hz, H-12), 1.14 (3H, s,
H-11), 0.86 (3H, t, J = 7.0 Hz, H-13)；13C-NMR (125
MHz, CDCl3) δ: 201.4 (C-6), 154.8 (C-10), 144.8
(C-8), 144.5 (C-2), 120.1 (C-3), 112.2 (C-9), 105.6
(C-7), 74.6 (C-4), 50.5 (C-5), 24.6 (C-12), 18.9
(C-11), 18.4 (C-15), 13.3 (C-14), 9.2 (C-13)。以上数
据与文献报道一致 [11]，故鉴定化合物 10 为
pseudohalonectrin A。
化合物 11：无色油状物。1H-NMR (500 MHz,
CDCl3) δ: 7.50 (1H, dd, J = 8.5, 7.0 Hz, H-7), 7.05
(1H, d, J = 8.5 Hz, H-8), 6.88 (1H, d, J = 7.0 Hz, H-6),
4.51 (1H, m, H-2), 3.87 (3H, s, 3-OCH3), 1.39 (3H, d,
J = 6.0 Hz, H-11)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ:
186.9 (C-4), 161.3 (C-5), 141.9 (C-9), 134.4 (C-7),
119.9 (C-8), 113.8 (C-10), 110.9 (C-6), 74.1 (C-2),
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56.3 (3-OCH3), 36.1 (C-3), 20.8 (C-11)。以上数据与
文献报道一致[12]，故鉴定化合物 11 为 dictafolin-A。
化合物 12：淡黄色针状晶体。1H-NMR (500
MHz, CD3OD) δ: 4.53 (1H, m, H-2), 2.00 (6H, s,
H-12, 13), 1.48 (3H, d, J = 6.5 Hz, H-11)；13C-NMR
(125 MHz, CD3OD) δ: 197.7 (C-4), 163.0 (C-7), 159.6
(C-5), 157.8 (C-9), 103.9 (C-6), 103.0 (C-8), 102.7
(C-10), 74.6 (C-2), 43.7 (C-3), 21.0 (C-11), 8.0
(C-12), 7.5 (C-13)。以上数据与文献报道一致[13]，故
鉴定化合物 12 为 2, 3-dihydro-5, 7-dihydroxy-2, 6, 8-
trimethyl-4H-1-benzopyran-4-one。
化合物 13：淡黄色油状物。1H-NMR (500 MHz,
CD3OD) δ: 7.45 (1H, d, J = 1.5 Hz, H-3), 7.08 (1H, d,
J = 1.5 Hz, H-5)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ:
165.1 (C-7)；162.1 (C-8), 161.7 (C-2), 151.3 (C-6),
145.8 (C-4), 122.7 (C-5), 109.8 (C-3)。以上数据与文
献报道一致[14]，故鉴定化合物 13 为 2-pyrone-4,
6-dicarboxylic acid。
参考文献
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