全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 17 期 2016 年 9 月
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• 药材与资源 •
天山雪莲鲨烯合酶 SiSQS1 和 SiSQS2 调控 β-谷甾醇合成机制研究
刘 爽 1, 2，查良平 2，杨 健 2，赵玉洋 2，袁 媛 2*，黄璐琦 2，刘 勇 1*
1. 北京中医药大学中药学院，北京 100102
2. 中国中医科学院中药资源中心 道地药材国家重点实验室培育基地，北京 100700
摘 要：目的 通过比较天山雪莲 Saussurea involucrata 细胞中鲨烯合酶 SiSQS1 和 SiSQS2 的位点变异、蛋白原核表达及表
达水平差异以及下游产物 β-谷甾醇量的高低，探索天山雪莲细胞 SiSQS1 和 SiSQS2 催化 β-谷甾醇合成的机制。方法 从天
山雪莲细胞中克隆出 β-谷甾醇生物合成途径上关键酶 SiSQS1 与 SiSQS2 基因，并对其进行生物信息学分析；分别对 SiSQS1
和 SiSQS2 进行原核表达与条件优化，比较二者在天山雪莲细胞中的蛋白原核表达差异；采用 RT-PCR 技术对二者在天山雪
莲三色系细胞中的表达水平进行比较，采用 GC-MS 对雪莲三色系细胞中 β-谷甾醇进行定量分析，并对 β-谷甾醇量与 SiSQS1、
SiSQS2 表达水平做相关性分析。结果 SiSQS1 和 SiSQS2 在 242E/D 存在残基变异，原核表达及条件优化实验表明二者都
有目的蛋白条带出现，但二者之间的原核表达最适体系不同；化学定量与基因表达水平的相关性分析表明 β-谷甾醇量与
SiSQS1、SiSQS2 基因表达水平呈正相关，相关系数分别为 0.92 和 0.89。结论 SiSQS1 与 SiSQS2 二者 242E/D 残基变异可
能影响 SiSQS 蛋白的表达，二者在催化活性以及对 β-谷甾醇积累调控作用上可能存在一定的功能差异，为研究鲨烯合酶 SQS
调控天山雪莲细胞 β-谷甾醇积累的机制提供了技术支持和奠定了理论基础。
关键词：天山雪莲；鲨烯合酶；原核表达；RT-PCR；β-谷甾醇
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)17 - 3079 - 08
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.17.020
Study on mechanism of regulating synthesis of β-sitosterol by SiSQS1 and
SiSQS2 in Saussurea involucrata cells
LIU Shuang1, 2, ZHA Liang-ping2, YANG Jian2, ZHAO Yu-yang2, YUAN Yuan2, HUANG Lu-qi2, LIU Yong1
1. School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China
2. State Key Laboratory Breeding Base of Dao-di Herbs, National Resource Center for Chinese Materia Medica, China Academy of
Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China
Abstract: Objective To explore the synthetic mechanism of β-sitosterol by comparing the locus mutation, prokaryotic expression, expression level
of SiSQS1 and SiSQS2, and the content of β-sitosterol in three color types of cells. Methods Firstly, we preformed the cloning and bioinformatic
analysis of SiSQS1 and SiSQS2 which were key enzymes involved in the biosynthesis of β-sitosterol in Saussurea involucrata cells. Secondly, we
compared the differences of prokaryotic expression between SiSQS1 and SiSQS2, then optimized the expression conditions. Finally, we compared the
expression levels of SiSQS1 and SiSQS2 by Real-time PCR and the content of β-sitosterol by GC-MS in three color types of cells, and made the
correlative analysis on the expression level and the content of β-sitosterol. Results There was a locus mutation of amino acid residues in 242E/D
between SiSQS1 and SiSQS2. The results of prokaryotic expression analysis and conditions optimization showed that both target proteins had been
expressed successfully, but the optimal prokaryotic expression system was different. The results of expression level and quantitative analysis showed a
positive correlation to the expression levels of SiSQS1 and SiSQS2 and the content of β-sitosterol, the correlation coefficients were 0.92 and 0.89,
respectively. Conclusion A locus mutation of amino acid residues in 242E/D between SiSQS1 and SiSQS2 may influence the expression of SiSQS,
and there may exist the functional differences in catalytic activity and the accumulation of β-sitosterol. The study will provide technical support and lay
a theoretical foundation for studying the accumulated mechanism of β-sitosterol regulated by SQS in S. involucrata cells.
Key words: Saussurea involucrata (Kar. et Kir.) Sch.-Bip.; squalene synthase; prokaryotic expression; real-time PCR; β-sitosterol
收稿日期：2016-04-07
基金项目：国家高技术研究发展计划（SS2014AA022201）
作者简介：刘 爽，硕士研究生。E-mail: scarlett0706@163.com
*通信作者 袁 媛 E-mail: y_yuan0732@163.com
刘 勇 E-mail: yliu0126@yahoo.com.cn
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雪莲 Saussureae cum Flore Herba 为菊科
（Compositea）凤毛菊属 Saussurea DC. 植物，全世
界共有 40 余种及 3 个变种，药用雪莲共有 12 种和
1 个变种[1]，其中天山雪莲 Saussurea involucrata
(Kar. et Kir.) Sch. -Bip. 是我国珍稀的名贵中药[2]，
主要生长在我国西南和西北高寒地区，有着长期的
药用历史以及丰富的民间用药经验[3]，在抗风湿、
镇痛、调节心血管系统、抗癌、抗缺氧、延缓衰
老、终止妊娠、防辐射等多方面具有很大的开发
利用价值[4-8]。随着雪莲药用价值的发现，其用量增
大，资源大大减少，目前雪莲已濒危，资源贮量下
降，乱采滥挖野生雪莲现象十分严重，加之人工栽
培困难，已被列为国家三级濒危物种而受到保护[9]。
因此利用雪莲细胞生产活性成分是缓解野生雪莲资
源短缺的有效途径之一。
鲨烯合酶（squalene synthase，SQS）是三萜类生
物合成途径中的关键酶之一，使法呢基焦磷酸
（ gerany lpyrophosphate ， FPP ）缩合生成鲨烯
（squalene，SQ）[10-11]，再经过化学结构修饰成为三萜
类化合物。目前已经从拟南芥[12]、烟草[13]、水稻[14]、
青蒿[15]、人参[16]、三七[17]、乌拉尔甘草[18]、东北红豆
杉[19]、丹参[20]、大豆[21]、灵芝[22]、酵母[23]、刺五加[24]
等中克隆出不同的 SQS 基因，通过对这些 SQS 基因
进行研究，得出如下结论：（1）不同的物种含有 SQS
基因的数目不同；（2）不同的 SQS 基因存在着不同的
拷贝形式；（3）并不是所有的 SQS 基因都具有鲨烯合
酶活性；（4）SQS 基因表达的最适条件各不相同。由
于 SQS 基因存在特性与多态性[25-26]，因而对不同 SQS
的研究就显得十分必要。
雪莲中所含的甾醇类化合物主要为 β-谷甾醇[27]
等，由于其本身无毒性，且具有乳化性与稳定性，
还有降低胆固醇、消炎解热、抗氧化、抗肿瘤和抗
癌等药理作用，因此在医药、化妆品、饲料、化工
等领域都得到广泛应用[28-33]。根据甾醇类与三萜类
化合物的生物合成途径可知，其都以 SQS 为关键
酶，催化生成前体物质鲨烯，再经过不同化学结构
修饰而成[34]。因此研究 SQS 在天山雪莲细胞中的蛋
白特性和表达水平对于提高下游 β-谷甾醇的量至关
重要。
本实验拟利用天山雪莲红色系、绿色系、粉色
系细胞，克隆其 SQS 基因，并初步比较不同细胞系
SQS 蛋白特性和表达水平，且通过结合 β-谷甾醇的
化学定量分析结果，研究 SQS 基因结构和蛋白特性
对天山雪莲细胞 β-谷甾醇积累的影响，为进一步研
究 SQS 催化 β-谷甾醇合成机制提供理论依据。
1 材料与试剂
天山雪莲红色系、绿色系、粉色系细胞由大连
普瑞康生物技术有限公司提供；Trace 1310 TSQ
8000 气相质谱仪（美国 Thermo ScientificTM公司）；
对照品 β-谷甾醇（质量分数≥95%）和 5α-胆甾烷
均购自美国 Sigma 公司；BSTFA[双三氟乙酰胺，含
1% TMCS（三甲基氯硅烷）]购自 Supelco 公司；二
氯甲烷、正己烷、95%乙醇、浓盐酸、氢氧化钾（国
药集团化学试剂有限公司，分析纯）。pGEM-T3 载
体购自 Promega 公司；原核表达载体 pGEX-4T-1 为
本实验室保存；Trizol 试剂购自 Invitrogen 生物技术
有限公司；大肠杆菌 DH5α、Transetta（DE3）感受
态购自全氏金有限公司；DNA 测序由北京睿博生物
科技公司完成；寡核苷酸引物由上海生工生物工程
公司合成；T4 DNA 聚合酶购自上海生工生物工程
公司；BamH I 和 Sma I 限制性内切酶购自 NEB 有
限公司；氨苄青霉素、β-巯基乙醇、IPTG 等化学试
剂购于 Sigma 公司；反转录试剂盒（Takara Prime
ScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit）购自TaKaRa
公司；其他生化试剂均为国产分析纯。
2 方法
2.1 总 RNA 提取及 cDNA 的合成
冰冷的 PBS 液 5～10 mL 洗涤天山雪莲细胞 2
次，采用 Trizol 法提取总 RNA，1.5%的琼脂糖凝胶
电泳用于评价 RNA 的质量。ND2000 测定总 RNA
的吸光度（A260、A280）值，选择 A260/A280 为 1.8～
2.0 的总 RNA 反转录成 cDNA。
2.2 SiSQS1 和 SiSQS2 基因 cDNA 的克隆
天山雪莲SiSQS1和SiSQS2来源于天山雪莲细
胞转录组数据。用 Primer Premier 5.0 软件设计特异
性引物。SiSQS-F：5’-ATGGGGAGTTTAAAAGCA-
GTGTTGA-3’；SiSQS-R：5’-TTACAACGTAAGCTT-
GATTTTATTT-3’。以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，
取阳性样品与 pEASY-T3 Cloning Kit 进行连接，并
导入大肠杆菌 DH5α 感受态细胞进行转化，并均匀
涂在含氨苄青霉素抗性的 LB 培养板上，取阳性
PCR 样品进行测序，将测序结果与天山雪莲细胞转
录组数据进行比对，判断目的片段是否与克隆载体
pEASY-T3 Cloning Kit 连接成功。
2.3 SiSQS1 和 SiSQS2 基因的生物信息学分析
将测序获得的序列结果使用 ORF Finder
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（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）查找开
放阅读框（ ORF ）。利用在线工具 Protparam
（http://www.expasy.ch/tools/protparam.html）预测基
因编码蛋白的相对分子质量、氨基酸数目、等电点、
不稳定系数、脂肪指数、亲水性/疏水性和编码区全
长等理化性质；采用 CDD（http://www.ncbi.mlm.nih.
gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）进行蛋白质结构域分析；
采用 CFSSP（http://swissmodel.expasy.org/）进行蛋
白质二级结构分析；利用 Swiss Model 程序
（http://swissmodel.expasy.org/），根据基因氨基酸序
列进行建模，预测蛋白质的三级结构。用 DNAMAN
软件对序列进行多重比对以及限制性酶切位点的预
测，用 ClustalW 软件与其他物种的氨基酸序列进行
比较（表 1 ），并用 MEGA 6.06 软件构建
Neighbor-joining 系统进化树，bootstrap 重复次数为
1 000 次。
2.4 pGEX-4T-1-SiSQS1 与 pGEX-4T-1-SiSQS2 原
核表达载体的构建
对测序后的序列进行分析，设计带有酶切位点
表 1 系统进化树中不同物种来源的 SQS 氨基酸序列
Table 1 SQS amino acid sequence in source of different
species in phylogenetic tree
物种 Genbank 号
雪莲 Saussurea involucrata SQS1 KU057087
雪莲 Saussurea involucrate SQS2 KU057088
黄花蒿 Artemisia annua SQS AAR20329.1
铁皮石斛 Dendrobium catenatum SQS AGI56082.1
丹参 Salvia miltiorrhiza SQS ACR57219.1
光果甘草 Glycyrrhiza glabra SQS BAA13083.1
拟南芥 Arabidopsis thaliana SQS NP-195191.2
水稻 Oryza sativa Japonica SQS BAA22557.1
玉米 Zea mays SQS BAA22558.1
灵芝 Ganoderma lucidum SQS ABF57213.1
桦褐孔菌 Inonotus obliquus SQS AGA95493.1
嗜酸氧化亚铁硫杆菌 Acidithiobacillus
ferrooxidans SQS
ACH84005.1
人 Homo sapiens SQS NP_001274685.1
小家鼠 Mus musculu SQS AAF00038.1
斑马鱼 Danio rerio SQS NP_001189454.1
家牛 Bos taurus SQS NP_001013022.1
苏门答腊猩猩 Pongo abelii SQS NP_001126476.1
布朗葡萄藻 Botryococcus braunii SQS AAF20201.1
的引物。两条序列酶切位点引物一样，BamHI-F：
5’-CGCGGATCCATGGGGAGTTTGGGAGCGAT-3’；
Sma I-R：5’-TCCCCCGGGTCATTTAGTGGAGAG-
AAATGCAAAC-3’。以重组质粒为模板，进行 PCR
扩增，取琼脂糖凝胶电泳检测的阳性样品进行切胶
回收。并与表达载体 pGEX-4T-1 分别进行 BamH I
和 Sma I 双酶切处理，并进行切胶回收。将切胶回
收后的目的片段与表达载体 pGEX-4T-1 用 T4 DNA
连接酶在 22 ℃连接 4 h，将连接产物转化到 DH5α
感受态细胞。将转化后的沉淀物均匀涂布在含 amp
抗性的 LB 培养板上，挑取单克隆进行菌液 PCR 阳
性检验、双酶切检验与测序。挑选阳性菌于含 amp
抗性的 LB 培养液中扩大培养并提取质粒，将质粒
转化到大肠杆菌 Transetta（DE3）表达感受态中，
转化表达宿主菌。
2.5 pGEX-4T-1-SiSQS1 与 pGEX-4T-1-SiSQS2 原
核诱导表达及条件优化
将转化产物均匀涂布在含 amp 抗性的 LB 平板
上，挑取单克隆抗体进行菌液 PCR 阳性检验，取阳
性样品于含 amp 抗性的 LB 培养液中摇菌 10 h 后，并
于 37 ℃ 250 r/min 振荡扩大培养至宿主菌的 A600值
为 0.6 时，加终浓度为 0.4 mmol/L 的异丙基-β-D-硫代
半乳糖苷（IPTG）于 25 ℃，200 r/min 摇床中诱导表
达，诱导 12 h 后离心再重悬沉淀。同时对影响蛋白表
达的 4 个关键因素进行条件优化，包括诱导时间（4、
8、16、24 h），诱导温度（16、20、25、30、37 ℃），
IPTG 浓度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L）诱导时
宿主菌的 A600值（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0）。取 30 μL
菌液加 20 μL 的 2.5×蛋白染色上样，沸水浴 10 min
后，12 000 r/min 离心 10 min，取上清进行 SDS-PAGE
分析，考马斯亮蓝染色 2 h 后，用洗脱液脱色至条带
清晰，扫描图片后并保存。
2.6 RT-PCR 分析 SiSQS1、SiSQS2 基因表达水平
利用 Primer Primer 5.0 设计雪莲 SiSQS1 与
SiSQS2 基因实时荧光定量引物，扩增产物长度在
80～200 bp，送由生工生物工程（上海）有限公司
合成，见表 2。体系按照 SYBR Premix Ex TaqTM Kit
（Takara 公司）说明书配制，cDNA 材料来源于雪莲
红色系、绿色系和粉色系的悬浮细胞，每个色系包
括 3 个生物样本，每个反应重复 3 次（包括阴性对
照），在 LightCycler® 480 上进行，结束后进行熔解
曲线分析。各基因表达量以内参基因 GAPDH 作为
标准进行相对定量，相对定量方法采用 2−ΔΔCt 法。
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表 2 RT-PCR 引物
Table 2 Primers of RT-PCR
名称 引物序列 (5’-3’)
SiSQS1-F GAAGTTTTCAGGGGCGTAGTC
SiSQS1-R TTTGTAAGGGTGCCAGAGTCC
SiSQS2-F ACGAAGAGAACTCCAAGAAGGC
SiSQS2-R TGATCTGTGGTATGGCACAAAA
GAPDH-F TTCAACATTATTCCCAGCAGCAC
GAPDH-R TAAGTAGCCTTCTTCTCAAGTCTCACA
2.7 雪莲三色系细胞中 β-谷甾醇分析
2.7.1 色谱条件 采用 TraceGOLDTM TG-5MS 气
相色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm；Thermo
ScientificTM，美国），程序升温（初始温度 80 ℃，
保持 2 min；以 20 ℃/min 升温至 280 ℃，保持 15
min）。载气为氦气，体积流量 1.0 mL/min；进样量
1 μL，分流比 25∶1，进样口温度 250 ℃。
2.7.2 质谱条件：电离方式为电子轰击离子源（EI
离子源），电离电压 70 eV，质谱范围：40～550 m/z；
离子源温度 280 ℃。
2.7.3 对照品溶液的制备 精密称取适量 β-谷甾醇
对照品和 5α-胆甾烷内标置 50 mL 棕色量瓶中，正
己烷溶解并定容到刻度，摇匀，即得对照品溶液和
内标溶液。
2.7.4 供试品溶液的制备 分别称取 0.5 g 雪莲三
色系细胞干燥样品于 20 mL 具塞试管中，加入 1 mL
5α-胆甾烷内标溶液及3 mL 4 mol/L HCl的95%乙醇
溶液，于 80 ℃水解 120 min，水浴冷却至室温。
2.7.5 线性关系考察 精密移取适量 β-谷甾醇对照
品溶液于 10 mL 棕色量瓶中，配制成 1.0、5.0、10.0、
20.0、25.0、50.0 μg/mL 的对照品溶液，各加入 0.10
mg/mL 的内标溶液 1 mL，内标质量浓度均为 10
μg/mL。上述不同质量浓度对照品溶液各取 1 mL，
氮气吹干后，加入 200 μL BSTFA（含 1% TMCS）
试剂，80 ℃下衍生 60 min 后，冷却加入 0.25 mL
正己烷，按“2.7.1 和 2.7.2”项下条件进行 GC-MS
分析。以各对照品溶液质量浓度为横坐标（X），相
应对照品溶液与内标的峰面积之比为纵坐标（Y）
进行回归分析，得到回归方程为 Y＝0.023 9 X－
0.010 8（r＝0.999 7），线性范围 1.00～50.0 μg/mL。
2.7.6 β-谷甾醇测定 取“2.7.3”项溶液，酸水解
液中加入 6 mL 4.0 mol/L KOH 的 95%乙醇溶液，于
80 ℃皂化 120 min，水浴冷却至室温。取 2 mL 皂
化液于 20 mL 具塞玻璃试管中，加入 5 mL 正己烷、
1 mL 去离子水，室温下超声振荡 10 min。取 2.5 mL
正己烷萃取液于色谱瓶中，用氮气吹干；加入200 μL
BSTFA（含 1% TMCS）试剂 80 ℃下衍生 60 min
后，冷却加入 0.25 mL 正己烷，进行 GC-MS 分析，
进样量 1.0 μL。按“2.7.1 和 2.7.2”项下条件进行
GC-MS 分析，并分别计算雪莲三色系细胞中 β-谷
甾醇的量。
2.8 β-谷甾醇量与 SiSQS1、SiSQS2 基因表达水平
的相关性分析
参考 Liang 等[35]报道的方法，使用 SPSS 20.0
软件对雪莲细胞中 β-谷甾醇量与 SiSQS1、SiSQS2
基因表达水平做线性相关性分析。
3 结果与分析
3.1 SiSQS1 和 SiSQS2 基因的克隆
利用DNAMAN软件结合ORF Finder在线软件
对雪莲转录组数据中 SiSQS1、SiSQS2 基因序列进
行分析，通过设计特异性引物克隆雪莲 cDNA
SiSQS1、SiSQS2，并将其重组入 T3 载体中，菌液
PCR 后测序结果与预测结果相一致，表明 pGEM-T3
载体已经插入 SiSQS1、SiSQS2 基因。通过 blast 在
线比较，推测 SiSQS1、SiSQS2 基因为鲨烯合酶基
因，分别命名为 SiSQS1 （ GenBanK 注册号
KU057087）、SiSQS2（GenBanK 注册号 KU057088）。
3.2 SiSQS1、SiSQS2 基因的生物信息学分析
利用在线工具 Protparam 预测 SiSQS1 和
SiSQS2 都含 1 257 bp 完整的开放阅读框，编码的氨
基酸数目都为 418 aa；NCBI 的 Conserved domains
在线工具表明 38～320 aa 都为 Isoprenoid_ Biosyn_
C1 superfamily家族；跨膜域分析结果表明 386～408
aa 都有跨膜结构域。SiSQS1、SiSQS2 编码蛋白的
理化性质如等电点都为 7.14，脂肪指数都为 95.93，
但 SiSQS1 编码蛋白的相对分子质量为 47 691，
SiSQS2 编码蛋白的相对分子质量为 47 677。
3.2.1 SiSQS1与SiSQS2基因氨基酸序列比对 对雪
莲 SiSQS1 与 SiSQS2 基因编码的氨基酸序列进行比
对，发现一致性为 99.76%，氨基酸序列只在 242 aa
位点处发生了变异，根据 NCBI 的 Conserved domains
分析结果可得知该变异位点处于 Isoprenoid_Biosyn_
C1 superfamily 结构功能域中（图 1）。
3.2.2 SiSQS1 与 SiSQS2 系统进化树分析 雪莲
SiSQS1、SiSQS2 与 GenBank 中 20 种不同物种来源
的 SQS 氨基酸序列进行比对，软件 MEGA 6.06 采
用邻接法构建系统进化树进行聚类分析。从进化树
物种可以明显地看到，植物、藻类、动物、真菌、
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图 1 SiSQS1 和 SiSQS2 基因的氨基酸序列比对 (A) 与结构功能域 (B)
Fig. 1 Comparison on amino acid sequences (A) and structure function domain (B) of SiSQS1 and SiSQS2
细菌分别聚为一支，在进化树上的远近与其所属类
别的亲缘关系一致。且雪莲 SiSQS1 与 SiSQS2 明显
聚为一支，亲缘关系最近，与这 2 条基因来源于同
一植物雪莲的事实相符；与同为菊科植物青蒿的亲
缘较近，与植物进化的亲缘关系也相符合（图 2）。
3.3 pGEX-4T-1-SiSQS1 与 pGEX-4T-1-SiSQS2 原
核表达载体构建与原核表达
将 pGEX-4T-1-SiSQS1 和 pGEX-4T-1-SiSQS2
转化至大肠杆菌 transetta（DE3）中，挑取若干单克
隆抗体，进行菌液 PCR 检验，并挑取阳性单克隆菌
液进行测序，重组质粒测序结果表明目的基因成功
插入表达载体中，可进行下一步原核表达。同时
将构建好的原核表达载体于大肠杆菌 transetta
（DE3）进行原核表达，SDS-PAGE 电泳结果表明与
图 2 SiSQS1、SiSQS2 与其他物种 SQS 氨基酸序列的系统
进化树分析
Fig. 2 Phylogenetic tree of SQS amino acid sequences
encoded by SiSQS1 and SiSQS2 with other species
空载 pGEX-4T-1 相比，pGEX-4T-1-SiSQS1 与 pGEX-
4T-1-SiSQS2 在 68 000 处出现目的蛋白条带（图
3），表明 pGEX-4T-1-SiSQS1 和 pGEX-4T-1-
SiSQS2 在大肠杆菌中成功表达。
3.4 诱导温度对 pGEX-4T-1-SiSQS1 与 pGEX-4T-
1-SiSQS2 原核表达的影响
保持诱导时间 16 h，IPTG 浓度为 0.4 mmol/L，
诱导时宿主菌 A600 值为 0.6 这 3 个因素不变，探讨
5 个诱导温度（16、20、25、30、37 ℃）对
pGEX-4T-1-SiSQS1与 pGEX-4T-1-SiSQS2原核表达
的影响（图 4），结果表明 pGEX-4T-1-SiSQS1 与
pGEX-4T-1-SiSQS2 最适表达温度不同，pGEX-
4T-1-SiSQS1 蛋 白 最 适 表 达 温 度 为 25 ℃ ，
pGEX-4T-1-SiSQS2 蛋白最适表达温度为 16 ℃。
M-Marker CK-空载pGEX-4T-1 1-pGEX-4T-1-SiSQS1 2-pGEX-4T-
1-SiSQS2 未诱导-未加IPTG诱导剂 诱导-加IPTG诱导剂
M-Marker CK-pGEX-4T-1 control protein 1-pGEX-4T-1-SiSQS1
2-pGEX-4T-1-SiSQS2 non-induced: without IPTG
induction-with IPTG
图 3 pGEX-4T-1-SiSQS1 和 pGEX-4T-1-SiSQS2 的原核表达
Fig. 3 Prokaryotic expression of pGEX-4T-1-SiSQS1 and
pGEX-4T-1-SiSQS2
SiSQS1 142
SiSQS2 142
Consensus
SiSQS1 284
SiSQS2 284
Consensus
SiSQS1 417
SiSQS2 417
Consensus
SiSQS1 与 SiSQS1 的氨基酸序列对比
1 75 150 225 300 375 410
SiSQS1 与 SiSQS1 的结构功能域
丹参
光果甘草
雪莲 SiSQS1
雪莲 SiSQS2
铁皮石斛 植物
黄花蒿
水稻
玉米
拟南芥
布朗葡萄藻 藻类
斑马鱼
小家鼠
家牛 动物
人类
苏门答腊猩猩
灵芝 真菌
桦褐孔菌
嗜酸氧化亚铁硫杆菌 细菌
M CK CK 1 1 2 2
6.8×104
A
B
1×105
7×104
5×104
4×104
3×104
未诱导 诱导 未诱导 诱导 未诱导 诱导
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 17 期 2016 年 9 月
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M-Marker CK-空载 pGEX-4T-1 1～5-诱导温度为 16、20、25、
30、37 ℃
M-Markers CK-pGEX-4T-1 control protein 1—5-induced
temperature: 16、20、25、30、37 ℃
图 4 pGEX-4T-1-SiSQS1 与 pGEX-4T-1-SiSQS2 在不同诱
导温度处理下的原核表达
Fig. 4 Prokaryotic expression of pGEX-4T-1-SiSQS1 and
pGEX-4T-1-SiSQS2 under different temperature
3.5 IPTG 浓度对 pGEX-4T-1-SiSQS1 与 pGEX-
4T-1-SiSQS2 原核表达的影响
保持诱导温度 20 ℃，诱导时间 16 h，宿主菌
A600 值为 0.6 不变，考察 5 个 IPTG 浓度（0.2、0.4、
0.6、0.8、1.0 mmol/L）对 pGEX-4T-1-SiSQS1 与
pGEX-4T-1-SiSQS2 原核表达的影响（图 5）。结果
表明 IPTG浓度对pGEX-4T-1-SiSQS1表达量几乎没
有影响；对于 pGEX-4T-1-SiSQS2 来说，IPTG 浓度
为 0.6 mmol/L 时，表达量最大。
M-Marker CK-空载 pGEX-4T-1 1～5-IPTG 浓度为 0.2、0.4、0.6、
0.8、1.0 mmol/L
M-Marker CK-pGEX-4T-1 control protein 1—5-IPTG concentration
0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L
图 5 pGEX-4T-1-SiSQS1 和 pGEX-4T-1-SiSQS2 在不同
IPTG 浓度处理下的原核表达
Fig. 5 Prokaryotic expression of pGEX-4T-1-SiSQS1 and
pGEX-4T-1-SiSQS2 under different IPTG concentration
3.6 诱导时间对 pGEX-4T-1-SiSQS1 与 pGEX-4T-
1-SiSQS2 原核表达的影响
保持诱导温度 20 ℃，IPTG 浓度 0.6 mmol/L，诱
导时宿主菌 A600值 3 个因素不变，考察诱导时间（4、
8、16、24 h）对 pGEX-4T-1-SiSQS1 与 pGEX-4T-1-
SiSQS2 原核表达的影响（图 6）。实验结果表明
pGEX-4T-1-SiSQS1 在诱导 8 h 时表达量最大，
pGEX-4T-1-SiSQS2 在诱导 4 h 时表达量最大；同时说
明随着诱导时间的延长，并不利于目的蛋白的表达。
M-Marker CK-空载 pGEX-4T-1 1～4-诱导时间-4、8、16、24 h
M-Marker CK-pGEX-4T-1 control protein 1 — 4-induction
time-4、8、16、24 h
图 6 pGEX-4T-1-SiSQS1 和 pGEX-4T-1-SiSQS2 在不同诱
导时间处理下的原核表达
Fig. 6 Prokaryotic expression of pGEX-4T-1-SiSQS1 and
pGEX-4T-1-SiSQS2 under different induction time
3.7 宿主菌密度对 pGEX-4T-1-SiSQS1 与 pGEX-
4T-1-SiSQS2 原核表达的影响
保持诱导温度 20 ℃，诱导时间 16 h，IPTG 浓
度 0.6 mmol/L 不变，考察不同密度宿主菌（A600值
为 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0）对 pGEX-4T-1-SiSQS1
与 pGEX-4T-1-SiSQS2 原核表达的影响（图 7）。实
验 结 果 表 明 宿 主 菌 A600 值 在 0.2 ～ 0.4 ，
pGEX-4T-1-SiSQS1和 pGEX-4T-1-SiSQS2表达量在
不断增加，超过 0.4 后，表达量都下降。说明 2 条
基因在宿主菌 A600 值为 0.4 时表达量最大，高密度
的宿主菌反而不利于蛋白表达。
3.8 雪莲三色系细胞中 β-谷甾醇的化学定量分析
GC-MS 分析雪莲三色系细胞中 β-谷甾醇量，
结果表明绿色系细胞中 β-谷甾醇量最高，粉色系细
胞中 β-谷甾醇量最低。绿色系、红色系与粉色系细
胞样品中 β-谷甾醇量分别为（374.54±2.20）、
（279.71±3.74）、（155.19±0.06）μg/g（n=3）。
3.9 SiSQS1 与 SiSQS2 基因表达分析
RT-PCR 分析 SiSQS1 与 SiSQS2 基因在雪莲红
M CK 1 2 3 4 5
1.2×105
1.0×105
7.0×104
6.8×104
5.0×104
1.2×105
1.0×105
7.0×104
6.8×104
5.0×104
4.0×104
pGEX-4T-1-SiSQS1 pGEX-4T-1-SiSQS2
7×104
5×104
4×104
3×104
M 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 CK
pGEX-4T-1-SiSQS1 pGEX-4T-1-SiSQS2
1×105
7×104
5×104
4×104
3×104
6.8×104
M CK 1 2 3 4 5
6.8×104
M CK 1 2 3 4 1 2 3 4
pGEX-4T-1-SiSQS1 pGEX-4T-1-SiSQS2
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 17 期 2016 年 9 月
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M-Marker CK-空载 pGEX-4T-1 1～5-宿主菌 A600 值为 0.2、0.4、
0.6、0.8、1.0
M-Marker CK-pGEX-4T-1 control protein 1—5-host bacteria A600 :
0.2、0.4、0.6、0.8、1.0
图 7 pGEX-4T-1-SiSQS1 和 pGEX-4T-1-SiSQS2 在不同密
度宿主菌的原核表达
Fig. 7 Prokaryotic expression of pGEX-4T-1-SiSQS1 and
pGEX-4T-1-SiSQS2 in different densities of host bacteria
色系、绿色系和粉色系细胞中的表达水平，结果表
明 SiSQS1 在雪莲绿色系、红色系与粉色系细胞中
表达水平依次是 0.88±0.05、0.37±0.06、0.28±0.02
（n=3）；SiSQS2 在雪莲绿色系、红色系与粉色系细
胞中表达水平依次是 1.15±0.03、0.64±0.04、0.50±
0.03（n=3）。可以看出 SiSQS1 与 SiSQS2 在雪莲绿
色系细胞中的表达水平都是最高的，其次是红色系
细胞，再次是粉色系细胞。并对细胞中 β-谷甾醇量
与 SiSQS1、SiSQS2 基因的表达水平做相关性分析，
发现β-谷甾醇量与SiSQS1基因表达水平相关性系数
为 0.92，与 SiSQS2 相关性系数为 0.89。
4 讨论
一般认为活性成分量差异与其生物合成途径上
关键酶基因的表达是有直接关系的。本研究通过比
较天山雪莲细胞中 2 条鲨烯合酶 SiSQS1 和 SiSQS2
的位点变异、蛋白原核表达特性与表达水平差异来
推测SiSQS1和SiSQS2的表达可能会影响 β-谷甾醇
前体物质的合成，进而影响 β-谷甾醇的积累。因此，
本实验对天山雪莲三色系细胞中 β-谷甾醇进行定量
分析比较，发现 β-谷甾醇量由高到低依次是绿色系、
红色系与粉色系细胞；同时对 β-谷甾醇生物合成途
径上关键酶SiSQS1和SiSQS2在天山雪莲三色系细
胞中的转录水平进行了比较，结果表明 SiSQS1 与
SiSQS2 在天山雪莲绿色系细胞中表达水平最高，其
次是红色系细胞，最后是粉色系细胞，这与天山雪
莲细胞中 β-谷甾醇量呈正相关，相关性系数分别为
0.92 和 0.89。从 β-谷甾醇量与基因表达水平相关性
分析结果可推测SiSQS1和SiSQS2调控 β-谷甾醇积
累可能存在功能差异。
对 SiSQS1 和 SiSQS2 蛋白特性进行了初步比
较，发现二者存在一个氨基酸位点突变，且位于结
构功能域中。进一步蛋白原核表达实验结果表明，
在温度 25 ℃、IPTG 浓度为 0.6 mmol/L、宿主菌
A600 值为 0.6、诱导时间为 16 h 时 SiSQS1 和 SiSQS2
都有表达，但诱导温度、诱导时间、IPTG 浓度和诱
导时宿主菌密度对上述两个蛋白表达特性的影响存
在差异，暗示 242E/D 残基变异可能影响 SiSQS 蛋
白的表达，且二者在催化活性以及对 β-谷甾醇积累
调控作用上也可能存在着一定的差异，都有待于进
一步深入研究。因此，SiSQS1 和 SiSQS2 可用来研
究调控 β-谷甾醇积累的机制，为以 β-谷甾醇为目的
成分，以 SQS 为核心，以二者之间相关性分析为桥
梁的天山雪莲细胞研究体系提供技术支撑，同时利
用天山雪莲细胞生产活性成分也是缓解野生天山雪
莲资源短缺的有效途径之一。
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M CK 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
7×104
5×104
4×104
3×104
6.8×104
pGEX-4T-1-SiSQS1 pGEX-4T-1-SiSQS2
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