全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 1 期 2013 年 1 月

• 76 •
• 药材与资源 •
怀地黄 3-酮酯酰 CoA-硫解酶基因的克隆、序列特征和时空表达分析
周延清 1, 2，张永华 1, 2，张 喻 1, 2，陈艳梅 1, 2，白妍妍 1, 2，魏海方 1, 2，段红英 1, 2，周春娥 1, 2
1. 河南师范大学生命科学学院，河南 新乡 453007
2. 河南省高校道地药材保育与利用研究工程技术中心，河南 新乡 453007
摘 要：目的 对怀地黄 3-酮酯酰 CoA-硫解酶（Rehmannia glutinosa f. hueichingensis 3-ketoacyl CoA-thiolase，RghKAT）cDNA
全长基因进行克隆及分析，为怀地黄分子育种提供候选基因和理论依据。方法 根据其他植物 ARGOS 基因序列的保守结构域
设计简并引物，采用 RT-PCR 和 RACE 技术，获得 RghKAT cDNA 全长序列；通过生物信息学技术对其核苷酸序列和氨基酸序
列进行比对；利用实时荧光定量 PCR 技术检测了其在 2 个时期、10 个组织的表达。结果 RghKAT 基因全长 1 713 bp，包含了
1 395 bp 的开放阅读框（ORF），编码 464 个氨基酸；同源比对和系统进化分析表明，RghKAT 的核苷酸序列与葡萄、番茄、毛
果杨、拟南芥和小麦的 KAT 核苷酸序列同源性分别达 84%、82%、82%、79%、73%；RghKAT 编码的氨基酸序列与矮牵牛、
葡萄、黄瓜、拟南芥和小麦的 KAT 氨基酸同源性分别为 88%、88%、86%、87%、78%；各物种 KAT 酶进化树符合物种进化
规律；理化性质表明该蛋白为略成碱性的稳定蛋白质，蛋白质二级结构主要由 α-螺旋、不规则卷曲、β-折叠和 β-转角构成；在
N 端存在一个由 70 个氨基酸残基组成的信号肽；RghKAT 蛋白三维结构具有硫解酶典型的特征序列；表达谱分析表明，RghKAT
mRNA 在各时期、各组织中均有表达，盛花期花瓣中表达最强，而在幼苗期叶中表达量最低。结论 成功克隆了 RghKAT cDNA
全长序列，具有 KAT 基因的结构特性及其产物硫解酶典型的特征序列，其在盛花期花瓣中表达量最高。
关键词：怀地黄；3-酮酯酰 CoA-硫解酶；生物信息学分析；时空表达分析；蛋白质二级结构；蛋白三维结构
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2013)01 - 0076 - 09
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.01.015
Gene cloning, features of sequence, and analysis on temporal and spatial expression
of Rehmannia glutinosa f. hueichingensis 3-ketoacyl CoA-thiolase
ZHOU Yan-qing1, 2, ZHANG Yong-hua1, 2, ZHANG Yu1, 2, CHEN Yan-mei1, 2, BAI Yan-yan1, 2,
WEI Hai-fang1, 2, DUAN Hong-ying1, 2, ZHOU Chun-e1, 2
1. College of Life Sciences, Henan Normal University, Xinxiang 453007, China
2. Engineering Technology Research Center of Nursing and Utilization of Genuine Chinese Medicinal Materials, University and
Colleges of Henan Province, Xinxiang 453007, China
Abstract: Objective To clone and analyze the full-length cDNA of Rehmannia glutinosa f. hueichingensis 3-ketoacyl CoA-thiolase
(RghKAT) gene and to provide the candidate genes and theoretical basis for the molecular breeding of R. glutinosa f. hueichingensis.
Methods The full-length cDNA sequence of RghKAT gene was amplified by quantitative RT-PCR and RACE techniques with
degenerated primers being designed based on the conserved domain of ARGOS base sequences from other plants. The nucleotide and
amino acid sequences were compared by bioinformatics technology. The temporal and spatial expression levels in 10 tissues of
regenerated plantlets at two stages were detected by quantitative RT-PCR. Results The full-length of RghKAT gene was 1 713 bp,
including an open reading frame (1 395 bp) encoding a 464-amino acid protein. Homology comparison and phylogenetic analysis revealed
that RghKAT shared the high nucleotide sequence identity to those of Vitis vinefera (84%), Solanum lycopersicum (82%), Populus
trichocarpa (82%), Arabidopsis thaliana (79%), and Triticum aestivum (73%), respectively. Meanwhile, the amino acid sequence coded
by RghKAT gene shared the high identity to those of Petunia x hybrida (88%), V. vinefera (88%), Cucumis satiuus (86%), A. thaliana

收稿日期：2012-09-28
基金项目：河南省基础与前沿技术研究计划项目（092300410009）；河南省教育厅自然科学研究计划项目（2011A180022）；河南省高校道地药材
保育与利用研究工程技术中心开放课题基金项目（20100911）；河南师范大学第三届学生创新创业论坛暨大学生创新性实验计划项目
*通信作者 周延清 Tel: (0373)3326340 E-mail: yqzhou@htu.cn
网络出版时间：2012-12-25 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1108.R.20121225.0911.002.html
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 1 期 2013 年 1 月

• 77 •
(87%), and T. aestivum (78%). The phylogenetic tree of RghKAT was consistent with the evolutionary relationship among the species. The
physicochemical properties of RghKAT indicated that it was a slightly alkaline and stable protein, and the secondary structure was made
of α-helixes, random coil, β-sheets, and β-turns. There was a putative signal peptide composed of 70 amino acid residues in the
N-terminus, and the three-dimensional structure of RghKAT protein showed a typical characteristic sequence of thiolases. The
quantitative RT-PCR assay demonstrated that the RghKAT mRNA could be detected in all 10 tissues examined at seedling and
blooming stages with the highest expression level in the petals at blooming stage and the lowest one in the young leaves at seedling
stage. Conclusion The full-length cDNA of RghKAT is cloned successfully, with thestructral properties of KAT gene and the typical
characteristic sequence of product thiolases, which has the highest expression level in the petals of blooming stage.
Key words: Rehmannia glutinosa Libosch. f. hueichingensis (Chao et Schih) Hsiao; 3-ketoacyl CoA-thiolase; bioinformatics analysis;
temporal and spatial expression analysis; secondary structure of protein; three-dimensional structure of protein

地黄 Rehmannia glutinosa (Gaertn.) Libosch. ex
Fisch. et Mey. 属玄参科（Scrophulariaceae）地黄属，
是多年生的草本植物，广泛分布于中国、韩国和日
本等地[1]。地黄在中国的河南、山东、陕西和山西
等地广泛分布，但河南“怀庆府”的“怀地黄”最
为著名，质最优[2]。地黄块根入药，富含梓醇、糖
类、维生素、多种氨基酸、多种微量元素，具有防
癌、抗癌、增强免疫力、延缓衰老、增强造血能力、
降低血糖、防治糖尿病并发症的功能[1,3]和重要经济
价值[4]。因此，克隆地黄功能基因，研究其功能和
表达模式，对进一步了解地黄药理分子机制和改良
地黄品种具有重要意义。迄今，国内外有少量地黄
基因克隆、功能分析和表达模式研究的报道。用
RT-PCR 方法克隆地黄肌动蛋白基因片段，可用作
内参基因[5]；用 RT-qPCR 技术分析地黄中 7 个传统
内参基因 18S、EF-1、ACT11、UBQ10、UBQ5、
TUB5、GAPDH 和 4 个新报道的内参基因 PP2A、
RPII、HSP90、TIP41 的 mRNA 表达差异情况[6]；
用 SSH 方法克隆了地黄块根中 RgPR-10 基因，研
究其在地黄根和茎以及原核表达情况 [3,7]；利用
Solexa 测序技术、生物信息学和荧光定量 PCR 分析
从正茬地黄和重茬地黄中鉴定了 89 个 miRNAs，预
测了其中 7 个新型 miRNAs 的 15 个靶基因，在正
茬地黄和重茬地黄之间构建了 miRNAs 差异表达
谱[4,8]；用 PCR 技术克隆了怀地黄基因片段及其中
转座酶基因[9]；进行了地黄 ABA、GA 和部分寡糖
合成代谢关键酶基因以及扩展蛋白基因 RgExpA1
的克隆与表达分析[10-11]。由此可见，地黄基因研究
多限于内参基因，功能基因及其表达特性研究很
少。β-酮酯酰辅酶 A 硫解酶（3-ketoacyl CoA thiolase，
KAT）催化 β氧化循环中硫解反应，广泛存在于真、
原核生物细胞中。KAT 在真核细胞中有两类，分别位
于线粒体和过氧物酶体中[16]。迄今，已经从南瓜[17]、
拟南芥 [18-19] 、葡萄（ XM002285619.1 ）、番茄
（AK327019.1）、毛果杨（XM002299248.1）、小麦
（AB539589.1）和黄瓜（CAA47926.1）等植物中克
隆了 KAT 基因。虽然 KAT 基因已经从上述植物中
克隆，但是，地黄 KAT 基因及其表达模式研究尚未
见报道。本研究用 RT-PCR 和 RACE 技术克隆怀地
黄 KAT 基因，用实时荧光定量 PCR 分析其时空表
达规律，为进一步研究其分子作用机制和在地黄分
子育种中的应用奠定基础。
1 材料
怀 地 黄 Rehmannia glutinosa Libosch. f.
hueichingensis (Chao et Schih) Hsiao 85-5 品种 30 日
龄幼苗和开花 10 d 的植株由河南师范大学李敬敬、
徐守真提供并鉴定。分别取前者的叶、根、茎和后
者的根、茎、叶、雄蕊、雌蕊、花托、花瓣。
大肠杆菌 DH5α菌株为本实验室保存；RNA 提
取主要试剂、DNA 凝胶回收试剂盒、DNA Marker
购自上海莱枫生物科技有限公司，反转录试剂盒购
自 New Industrytech 公司，LA Taq DNA 聚合酶、克
隆载体 pMD19-T Vector、3’-Full RACE kit、5’-Full
RACE kit 购自 TaKaRa 公司，引物合成和基因测序
由北京华大基因有限公司完成。
2 方法
2.1 引物设计与合成
根据 GenBank 中玉米（HQ875338.1）、水稻
（DQ641272.1）、拟南芥（NM_115853.4）、大白菜
（FJ171724.1）和葡萄（FJ171725.1）的器官膨大基因
ARGOS的序列设计引物P1用于扩增KAT cDNA中间
片段；根据其中间序列，设计 P2 引物与 P3 引物进行
3’-RACE 和 5’-RACE；根据三者拼接成的 cDNA 全长
序列，设计引物 P4，扩增其开放阅读框（ORF）；根
据 ORF 序列，设计引物 P5 及地黄内参基因 TIP41 引
物 P6[6]用于该基因的时空表达分析。所有引物（表 1）
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 1 期 2013 年 1 月

• 78 •
表 1 所用引物来源、名称及其序列
Table 1 Origions, names, and their sequences of primers used
基因 引物名称 引物序列
KAT P1 AATBGGRACYAAYARCARCATA
P2 OuterF:GCCAAGTGAGTGATGGTGCTGGAGCT
InnerF:CATGAAGAGAAGTGTTGCCATGC
P3 OuterR: GTAATACCCATTGGAAGGAGAC
InnerR: CACAGTTCTAACAGGTACAGTTTCAGGG
3’RACE kit P2’ OuterR:TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT
InnerR: CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG
5’RACE kit P3’ OuterF: CATGGCTACATGCTGACAGCCTA
InnerF: CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG
P4 F: CGCGGATCCATGGAGAAAGCAACTG
R: CCGCTCGAGCTTGCAAAGTGGACAT
P5 F: CATGAAGAGAAGTGTTGCCATGC
R: TCGATGTCCCCAAGTTCAAGACC
TIP41 P6 F: TGGCTCAGAGTTGATGGAGTGCT
R: CTCTCCAGCAGCTTTCTCGGAGA

均使用 DNAMAN 4.0 和引物 Premier 5.0 软件设计。
2.2 总 RNA 的提取
地黄不同发育时期、不同组织的总 RNA 的提
取参照上海莱枫生物科技有限公司的 RNA 提取试
剂盒说明书操作。琼脂糖凝胶电泳测定 RNA 的质
量，A260/A280变化值计算 RNA 的浓度和纯度。
2.3 cDNA 第一链合成和 RT-PCR 中间片段的克
隆、3’-RACE 和 5’-RACE
cDNA 反转录按照 New Ndustrytech 的第一链
合成说明书进行。总 RNA 5 μg，DEPC 水 6 μL，
Olig（dT）18 2 μL，70 ℃、5 min，冰上放置 2 min；
RNase inhibitor 0.5 μL，5×第一链缓冲液 4 μL，
0.1 mol/L DTT 1 μL，200 U M-MLV，42 ℃温浴 50
min，95 ℃变性 5 min，加 DEPC 水稀释到 50 μL
反应体系。
RT-PCR 中间片段的克隆 PCR 反应条件：94 ℃、
5 min；94 ℃、30 s，46 ℃、30 s，72 ℃、1 min，30
个循环；72 ℃、10 min；4 ℃备用。25 μL 反应体系
为：1 μL cDNA、1.25 U La Taq 聚合酶、1.25×10−8
mmol P1、200 μmol/L dNTP。
3’-RACE：按 TaKaRa 的 3’-Full RACE kit 进行。
3’-Full RACE Outer PCR 程序为 94 ℃、3 min；94
℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、1 min，20 个循环；
72 ℃，10 min。3’-Full RACE Inner PCR 程序为 94
℃、3 min；94 ℃、30 s，52 ℃、30 s，72 ℃、1 min，
30 个循环；72 ℃、10 min。
5’-RACE：按 TaKaRa 的 5’-Full RACE kit 进行。
5’-Full RACE Outer PCR 程序为 94 ℃、3 min；94
℃、30 s，50 ℃、30 s，72 ℃、1 min，20 个循环；
72 ℃、10 min。5’-Full RACE Inner PCR 程序为 94
℃、3 min；94 ℃、30 s，57.6 ℃、30 s，72 ℃、1
min，25 个循环；72 ℃、10 min。
PCR 产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测，回收特
异条带，连接、转化，阳性克隆在北京华大基因有
限公司测序。
2.4 RghKAT 全长 cDNA 编码区的克隆
应用 DNAMAN 4.0 软件对基因的 3’端、中间
序列和 5’端序列进行拼接，并在 NCBI 网站上预测
其 ORF。根据 ORF 序列设计特异引物 P4 进行 ORF
扩增验证。PCR 反应条件：94 ℃、5 min；94 ℃、
30 s，58 ℃、30 s，72 ℃、2 min，35 个循环；72 ℃、
10 min。25 μL 反应体系为：1 μL cDNA、1.2 5 U La
Taq 聚合酶、1.25×10−8 mmol P4、200 μmol/L
dNTP。PCR 产物经 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，切
下目的条带，经回收后与 pMD19-T Vector 连接，转
化大肠杆菌 DH5α，鉴定并测序。
2.5 基因序列的生物信息学分析
基于克隆 cDNA 序列，用 NCBI 网站（http://
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 1 期 2013 年 1 月

• 79 •
blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）上 BLAST、BLASTP
软件进行同源基因的 cDNA、氨基酸序列搜索；用
NCBI 的 ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
gorf/gorf.html）分析基因的 ORF；利用生物软件
MEGA5.1 将同源序列根据它们的序列一致性高低
构建系统发育树[14]；通过 ExPASy Proteomics Server
网站（http://www.expasy.ch/tools/protparam. html）
分析蛋白的理化性质包括相对分子质量、等电点、
消光系数、氨基酸组成等；SignalP 4.0 预测氨基酸
残基组成的信号肽；SOPMA 在线预测氨基酸的二
级结构以及功能基序；通过 NCBI 网站（http://www.-
ncbi. nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml）预测氨基酸
的保守域和预测氨基酸的三维结构（http://www. ncbi.
nlm.nih.gov/Structure/MMDB/mmdb.shtml）。
2.6 实时荧光定量 PCR
选用 2×UltraSYBR 混合物（含 ROX）试剂盒
在 ABI7500 分析仪对 2 个时期、10 个组织 RghKAT
转录的 mRNA 丰度进行定量监测。不同组织
RghKAT 转录的 mRNA 拷贝数使用地黄内参基因
TIP41进行校正，目的基因荧光定量PCR引物用P5，
内参基因的引物为 P6。采用 20 μL 反应体系，其中
包括 1 μL cDNA 模板、10 μL 2×UltraSYBR 混合物
（含 ROX）、5 μmol/L 引物，其余用水补齐。扩增
条件为 95 ℃、10 min；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min
共 40 个循环。溶解曲线分析 95 ℃、15 s，60 ℃、
1 min，95 ℃、15 s，60 ℃、15 s。每个样本设 3
个重复，分别使用 P5 和 P6 进行扩增。使用溶解曲
线判定产物特异性，根据定量扩增曲线达到平台期
时的 Ct 值，以 TIP41 为参比计算各时期、各组织
RghKAT 转录的 mRNA 相对表达量。
3 结果与分析
3.1 RghKAT 全长 cDNA 和 ORF 的克隆
3.1.1 RghKAT 全长 cDNA 的克隆 以怀地黄 85-5
幼苗幼叶 RNA 逆转录的 cDNA 为模板，以简并引
物 P1 为引物，进行中间片段的 PCR 扩增，经测序
其核苷酸序列为 885 bp（图 1-A）。在 NCBI 上进行
BLAST 分析表明，该片段与多种植物的 KAT 具有
较高的同源性。根据该中间片段，设计特异引物 P2
和 P3，结合 TaKaRa 3’-Full RACE kit、5’-Full RACE
kit 自带的特异引物 P2’和 P3’，采用 3’RACE 和
5’RACE 巢式扩增法分别扩增中间片段的 3’与 5’端
（图 1-B、1-C），均进行克隆测序，结果显示 3’与 5’
端分别为 250/177 bp 和 68 bp。经与其他物种的 KAT
比对，确认这两条序列为地黄 KAT 基因的 3’和 5’
端序列。
3.1.2 RghKAT 基因全长 cDNA 编码区的克隆 根
据 RghKAT 的中间片段、3’端和 5’端序列，利用
DNAStar 软件进行基因全长序列的拼接，然后在
cDNA 序列的 5’和 3’非编码区设计引物对 P4，扩增
其 ORF。结果得到与预期片段大小一致的产物（图
1-D）。测序确认该片段为地黄 RghKAT 的 ORF 序
列。将克隆的 1 713 bp 全长 cDNA 序列提交 NCBI

A-RghKAT 中间片段的电泳 B-3’-RACE 扩增片段的电泳 C-5’-RACE 扩增片段的电泳 D-RghKAT ORF 的电泳 M-DNA marker 1-扩增片段
A-electrophoresis of RghKAT middle fragments B-electrophoresis of 3’-RACE amplification fragments C-electrophoresis of 5’-RACE amplification
fragments D-electrophoresis of RghKAT ORF M-DNA marker 1-amplification fragments
图 1 RghKAT 基因中间片段 (A)、3’端片段 (B)、5’端片段 (C) 和 ORF (D) 的扩增片段电泳
Fig. 1 Electrophoreses of RghKAT middle fragments (A), 3’-end fragmemts (B), 5’-end fragmemts (C),
and ORF (D) amplification fragments

2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
M 1 M 1 M 1 M 1
A B C D
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 1 期 2013 年 1 月

• 80 •
公布，GenBank 登录号为 JX290369。
3.2 RghKAT 基因的生物信息学分析
3.2.1 RghKAT 基因的核苷酸序列及氨基酸序列分析
RghKAT 基因的 cDNA 全长序列为 1 640/1 713 bp，包
含 1 个 68 bp 的 5’UTR，1 个 1 395 bp 的 ORF 和 1 个
250/177 bp的3’UTR。利用ORFFinder推导其编码464
个氨基酸，包含 20 种常见的氨基酸，其氨基酸中色
氨酸量最低，为 0.2%；丙氨酸量最高 11.9%，其他
氨基酸的量在 1.3%～10.6%。碱性氨基酸量略高于酸
性氨基酸，分别为 12.9%和 10.9%（图 2）。
3.2.2 多序列比对与系统进化树分析 利用基因
RghKAT（GenBank 登录号：JX290369）cDNA 全

1 gaaaatagagtgttaatttttcggtataatatacaaatttgtaatttagagagagaaagaaatagagg
69 ATGGAGAAAGCAACTGAGAGGCAGAGAGTTTTGCTGCAGCATCTCCGTCCGTCCTTCACTTCGTCGTCTCTA
1 M E K A T E R Q R V L L Q H L R P S F T S S S L
141 GAAGATATTGAATCTTCCGTTTCCGCATCTATATGTTCAGCAGGGGACAGTGCAGCATACCATCGTTCTTCT
25 E D I E S S V S A S I C S A G D S A A Y H R S S
213 GTCTTTGGTGACGATGTGGTTATAGTGGCTGCCTATCGAACTGCACTGTGCAAGTCTAAGAGAGGTGGCTTC
49 V F G D D V V I V A A Y R T A L C K S K R G G F
285 AAAGATACCTATCCTGATGATTTACTAGCACCTGTTTTGAGGGCAGTGGTAGAAAAAACAAATGTAAATCCA
73 K D T Y P D D L L A P V L R A V V E K T N V N P
357 AATGAAGTTGGGGACATTGTTGTGGGCACGGTGTTGGCACCGGGCTCCCAAAGAGCAAGTGAATGCAGGATG
97 N E V G D I V V G T V L A P G S Q R A S E C R M
429 GCTGCATTTTATGCTGGTTTCCCTGAAACTGTACCTGTTAGAACTGTGAACAGGCAATGTTCATCTGGCCTT
121 A A F Y A G F P E T V P V R T V N R Q C S S G L
501 CAAGCTGTAGCTGATGTAGCTGCAGCTATCAAAGCTGGATTTTATGACATTGGGATTGGTGCTGGGTTGGA G
145 Q A V A D V A A A I K A G F Y D I G I G A G L E
573 TCGATGACCGTTAATCCTATGGCTTGGGAAGGATCAGTCAATCCAAGAGTAAAATCGATGGCACAAGCACAA
169 S M T V N P M A W E G SV N P R V K S M A Q A Q
645 GATTGTCTCCTTCCAATGGGTATTACTTCAGAAAATGTCGCCCATCGTTTTGGAGTGACAAGGCAGGAGCA A
193 D C L L P M G I T S E N V A H R F G V T R Q E Q
717 GATCAGGCTGCAGTTGATTCGCACAGAAAGGCTGCTGCTGCCACTGCATCAGGCAAATTTAAAGATGAGATA
217 D Q A A V D S H R K A A A A T A S G K F K D E I
789 ATACCAGTGAAAACCAAGATTGTGGACCCTAAATCTGGGGATGAGAAACCGGTTACGATATCTGTTGATGAT
241 I P V K T K I V D P K S G D E K P V T I S V D D
861 GGCATACGACCAAATACCTCAGTGGCAGACCTGGGCAAGCTGAAACCTGTTTTCAAGAAAGATGGCTCAACC
265 G I R P N T S V A D L G K L K P V F K K D G S T
933 ACTGCTGGGAATTCTAGCCAAGTGAGTGATGGTGCTGGAGCTGTGCTCCTCATGAAGAGAAGTGTTGCCATG
289 T A G N S S Q V S D G A G A V L L M K R S V A M
1005 CAGAAAGGGCTTCCCATCCTTGGTGTATTCAGGAGCTTTGCTGCAGTTGGTGTAGATCCTGCGATCATGGGT
313 Q K G L P I L G V F R S F A A V G V D P A I M G
1077 GTTGGTCCAGCC GTTGCAATTCCTGCAGCAGTCAAATCTGCTGGTCTTGAACTTGGGGACATCGATCTTTTC
337 V G P A V A I P A A V K S A G L E L G D I D L F
1149 GAGATAAATGAGGCATTTGCTTCGCAATTCGTGTACTGCCGTAAGAAGCTTGAACTTGATCCTGAGAAGATC
361 E I N E A F A S Q F V Y C R K K L E L D P E K I
1221 AATGTGAATGGAGGTGCCATGGCAATTGGGCATCCTTTGGGTGTTACAGGAGCTCGCTGTGTTGTTACCTTA
385 N V N G G A M A I G H P L G V T G A R C V V T L
1293 TTGCATGAAATGAAGCGTCGTGGCAAAGATTGCCGCTTTGGCGTGGTGTCAATGTGTATAGGCACTGGGATG
409 L H E M K R R G K D C R F G V V S M C I G T G M
1365 GGCGCTGCTGCTGTTTTTGAAAGGGGTGACTCCTGTGACGAGCTTTCCAATACACGAACAGTCGGAACACAC
433 G A A A V F E R G D S C D E L S N T R T V G T H
1437 AATTTTCTGTCCAAGGATGCTCGATAAactccaatgtccactttgcaagttccaataaattttaaatctgca
457 N F L S K D A R *
1509 ttcagaagtcaataatatactgcaataaattacttactgatttatcacaacagctgtggtgcagtttaatga
1581 tctctgtatttttctgtactgatgtattattgtctgtactttggaatcattttggccttttgttttcctata
1653 atctataatgataaagcatggtggagtgaatatctaccaatttttatcaaaaaaaaaaaaa
小写字母为 5’端非编码区和 3’端非编码区，大写字母为编码区；上面为核苷酸序列，下面为氨基酸序列；*表示终止子；起始密码子和终止密
码子用方框标出；多聚腺苷酸尾用粗斜体表示；下划线标出 1 640/1 713 bp 全长 cDNA 不同部分
lowercase letters show 3’, 5’-untranslated regions, capital letters show coding region sequence; upper sequences indicate nucleotide and lower show
amino acid; * referes to stop codon; start codon and the stop codon are in box; Poly adenine nucleotides tail are in bold italic; different regions
of 1 640/1 713 bp full-cDNA are underlined
图 2 RghKAT 基因的核苷酸及其编码蛋白质的氨基酸序列
Fig. 2 Nucleotide sequences of RghKAT gene and amino acid sequences of their encoding proteins
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 1 期 2013 年 1 月

• 81 •
长序列与来自葡萄（ XM002285619.1 ）、番茄
（AK327019.1）、毛果杨（XM002299248.1）、拟南
芥（NM 100351.4）和小麦（AB539589.1）等植物
的 KAT 的碱基序列进行比对分析，序列的相似性分
别高达 84%、82%、82%、79%和 73%。利用基因
RghKAT 预 测 的 氨 基 酸 序 列 与 来 自 矮 牵 牛
（ACV70033.1）、葡萄（XP002285653.1）、黄瓜
（CAA47926.1）、拟南芥（NP180873.1）、小麦
（BAI66423.1）的 KAT 的氨基酸序列进行比对分析，
同源性分别为 88%、88%、86%、87%和 78%（表 2）。
可见，基因 RghKAT 碱基序列及其编码蛋白质的氨
基酸序列与双子叶植物矮牵牛、葡萄的同源性最高。
利用 MEGA5.1 软件 Neighbor-Joining 法构建
RghKAT和其他物种KAT的氨基酸同源序列的系统
进化树（图 3），进行系统分析。其氨基酸序列与
BLAST 检索到的真菌、动植物的 KAT 的氨基酸序
列的同源性大于 53%，说明其在生物进化上的保守
性很大。但是，它与双子叶植物的亲缘关系最近，
与单子叶植物的亲缘关系次之，与绿藻、真菌和动
物由近到远的亲缘关系依次为绿藻、真菌和动物。
表 2 地黄与其他物种 KAT 的同源性比较
Table 2 Homologous comparison of KAT between R. glutinosa f. hueichingensis and other species
物 种 GenBank 登录号 氨基酸同源性 / %
矮牵牛 Petunia x hybrida ACV70033.1 88
葡萄 Vitis vinifera XP002285653.1 88
芒果 Mangifera indica CAA53078.1 88
拟南芥 Arabidopsis thaliana NP180873.1 87
黄瓜 Cucumis sativus CAA47926.1 86
南瓜 Precursor-cucurbit S72532 86
大白菜 Brassica napus CAA63598.1 86
向日葵 Helianthus annuus AAQ77242.1 86
蓖麻 Ricinus communis XP002518136.1 85
大豆 Glycine max XP003555712.1 83
油棕 Elaeis guineensis AEQ94132.1 81
短柄草 Brachypodium distachyon XP003570403.1 79
玉米 Zea mays NP001241698.1 79
小麦 Triticum aestivum BAI66423.1 78
蒺藜苜蓿 Medicago truncatula XP003604976.1 78
衣藻 Chlamydomonas reinhardtii XP001697225.1 66
微单胞菌属 Micromonas sp. RCC299 XP002500295.1 64
胶球藻 Coccomyxa subellipsoidea C-169 EIE21619.1 63
马 Equus caballus XP001488609.1 60
天竺鼠 Cavia porcellus XP003464147.1 60
原鸡 Gallus gallus NP001184217.1 59
网柄菌 Dictyostelium discoideum AX4 XP643924.1 59
变色龙 Anolis carolinensis XP003221941.1 57
小鼠 Mus musculus NP666342.1 57
大鼠 Rattus norvegicus BAA14107.1 56
罗非鱼 Oreochromis niloticus XP003456538.1 56
猕猴 Macaca mulatta XP001088834.2 56
人 Homo sapiens NP001598.1 56
猩猩 Pongo abelii XP002813979.1 56
熊猫 Ailuropoda melanoleuca XP002914680.1 56
野猪 Sus scrofa XP003132151.1 56
普通狨 Callithrix jacchus XP002755029.2 55
紫海胆 Strongylocentrotus purpuratus XP003724378.1 53
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 1 期 2013 年 1 月

• 82 •

图 3 基于 Neighbor-Joining 法构建地黄和其他物种全长
KAT 氨基酸序列的系统进化树
Fig. 3 Phylogenetic tree of full-length KAT amino acid
sequences between R. glutinosahu f. hueichingensis
and other species using Neighbor-Joining method
3.2.3 RghKAT 编码蛋白质结构预测 RghKAT 编
码蛋白质特征 ProtParam 分析显示，相对分子质量
为 4.9×104，等电点为 7.98，摩尔消光系数为 15 065，
不稳定系数为 31.58，为略碱性的稳定蛋白质。
SignalP4.0 显示地黄 KAT 的 N 端存在一个由 70 个
氨基酸残基组成的信号肽（图 4-A），信号肽序列为
“MEKATERQRVLLQHLRPSFTSSSLEDIESSVSASIC”
和“SAGDSAAYHRSSVFGDDVVIVAAYRTALCKSK-
RG”，分界位点在 70 和 71 号氨基酸残基之间。用
SOPMA 预测地黄KAT 的二级结构（图 4-D），结果为
α-螺旋为 38.58%，不规则卷曲 35.78%，β-折叠为
15.30%，β-转角为 10.34%，这 4 个二级结构构成地黄
KAT 的基本结构。氨基酸的保守域见图 4-C；氨基酸
的三维结构见图 4-B，RghKAT 蛋白具有硫解酶典型
的特征序列。
3.3 RghKAT 时空表达差异分析
为了明确 RghKAT 在地黄不同组织中的表达模
式，分别提取怀地黄组培幼苗期的根、茎、叶和盛
花期的花瓣、花托、雄蕊、雌蕊、根、茎与叶的总
RNA，反转录合成 cDNA 后进行 qRT-PCR 分析（图
5）。结果发现，RghKAT 在被检测的各个组织中均
有表达 mRNA，但是其在不同组织中表达量存在显
著差异。其中，盛花期花瓣的表达量最高，其次是
花托、雄蕊、根、茎、叶，雌蕊中的表达量较弱；
组培幼苗茎的表达量较高，根次之，叶的表达量最
低；比较其在幼苗期和盛花期的根、茎、叶中的表
达，发现其在幼苗期茎中的表达高于盛花期茎的表
达，而其在幼苗期根和叶中的表达低于盛花期根和
叶的表达。
4 讨论
KAT（EC 2.3.1.16）是在真菌、动植物细胞中
广泛存在的、具有催化脂肪酸 β-氧化反应中硫解断
裂作用的一些酶[12,16]。在 CoASH 存在下，β-酮脂酰
CoA 在该酶催化下生成一分子乙酰 CoA 和少了两
个碳原子的脂酰 CoA。迄今，已经从南瓜[13]、拟南
芥 [14-15] 、 葡 萄 （ XM002285619.1 ）、 番 茄
（AK327019.1）、毛果杨（XM002299248.1）、小麦
（AB539589.1）和黄瓜（CAA47926.1）等植物中克
隆了 KAT 基因。但是，尚未见克隆地黄 KAT 基因
的报道。
在植物中已经发现一些与植物器官膨大有关的
功能基因 ARGOS（auxin-regulated gene involved in
organ size）[18-19]。本研究根据 NCBI GenBank 核酸
数据库中 5 种已知植物 ARGOS 基因碱基序列的保
守区，设计几对对简并引物，采用 RT-PCR 和 RACE
技术克隆了几个新的地黄功能基因。其中之一是 β-
酮脂酰辅酶 A 硫解酶基因 RghKAT。
该基因编码的蛋白质具有硫解酶典型的特征序
列，N 端含一个信号肽，可以推测克隆的 RghKAT
是完整的 KAT 基因。序列同源性分析表明，RghKAT
与已知的葡萄、黄瓜、拟南芥、小麦等植物 KAT
具有高度同源性，在核苷酸水平上序列同源性高达
73%～84%，其编码的氨基酸同源性高达 78%～
88%，进一步说明 RghKAT 蛋白具有相当高的结构
保守性，可归于 KAT 酶类。另外，葡萄、黄瓜和拟
南芥依次分属于双子叶植物葡萄科、葫芦科和十字
花科，其间的亲缘关系远；小麦属于单子叶植物，其
间的亲缘关系更远。然而，它们的 KAT 同源性之高
表明 KAT 可能是进化上很保守的蛋白。该结果与彭
丹等[19]的结果相似。

黄瓜 C. sativus
南瓜 P. cucurbit
葡萄 V. vinifera
短柄草 B. distachyon
玉米 Z. mays
大豆 G. max
芒果 M. indica
拟南芥 A. thaliana
大白菜 B. napus
地黄 R. gluitinosa
矮牵牛 P. x hybrida
蓖麻 R. communis
向日葵 H. annuus
蒺藜苜蓿 M. truncatula
小麦 T. aestivum
紫海胆 S. purpuratus
衣藻 C. reinhardtii
变色龙 A. carolinensis
网柄菌 D. discoideum AX4
胶球藻 C. subellipsoidea C-169
油棕 E. guineensis
猕猴 M. mulatta
罗非鱼 O. nilotieus
马 E. caballus
熊猫 A. melanoleuca
野猪 S. scrofa
微单胞菌属 Micromonas sp. RCC299
大鼠 R. norvegicus
小鼠 M. musculus
天竺鼠 C. porcellus
普通狨 C. jacchus
人 H. sapliens
猩猩 P. abelii 95
98
88
99
89 86
99 32
95
74
96
99
93
99
82
99
54
98
43
66
99
99
45
99
99
99
99
99
0.2
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 1 期 2013 年 1 月

• 83 •

A-信号肽预测 B-蛋白二级结构预测（蓝色表示 α-螺旋，绿色表示 β-转角，红色表示 β-折叠，紫色表示不规则卷曲） C-保守区预测
D-三维结构预测
A-prediction of signal peptide B-prediction of secondary structure (blue bars show α-helix, green bars show β-extended strand, red bars show β-turn,
purple bars show random coil) C-prediction of consened domain D-prediction of three-dimensional structure
图 4 RghKAT 蛋白二级结构、保守区和三维结构预测
Fig. 4 Prediction of secondary structure, conserved domain, and three-dimensional structure of RghKAT proteins

a-花瓣 b-花托 c-雄蕊 d～f-盛花期根、茎、叶 g-雌蕊
h～j-幼苗期茎、根、叶
a-petals b-torus c-stamens d—f-roots, stems, and leaves of
blooming stage g-pistils h— j-stems, roots, and leaves of
seedling stage
图 5 地黄组培幼苗期、盛花期各组织 KAT 表达的
qRT-PCR 监测
Fig. 5 Expression of KAT transcript in rarious tissues
of R. glutinosahu f. hueichingensis at seedling
and blooming stages by qRT-PCR monitering
实时荧光定量 PCR 技术分析 RghKAT 的时空
表达模式，发现其在怀地黄幼苗期和盛花期的 10
个不同组织中均差异表达，但在花瓣中表达量最高，
在幼苗叶中表达量最低。这与小麦 Ta14S 基因的时
空表达模式[20]相似。比较其在幼苗期和盛花期的
根、茎、叶中的表达，发现其在幼苗期茎中的表达
高于盛花期茎的表达，而其在幼苗期根和叶中的表
达低于盛花期根和叶的表达。这是首次报道 KAT
基因在植物中时空表达模式。
本研究怀地黄 RghKAT 的克隆和时空表达分析
结果为进一步探讨其功能以及分子作用机制提供了
重要基础。
参考文献
[1] Young S K, Jin A R, Byoung S K. Discrimination of Korean
Rehmannia glutinosa from Chinese Rehmannia glutinosa
using sequence-characterized amplified region marker [J].
Korean Soc Appl Biol Chem, 2012, 55: 1-6.
[2] Zhou Y Q, Gu F P, Zhou C N, et al. Genetic diversity of
Rehmannia glutinosa cultivars based on sequence-related
amplified polymorphism markers [J]. Sci Hortic, 2010,



0 10 20 30 40 50 60 70
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
C-信号肽断裂位点得分值
S-信号肽区域得分值
Y-综合信号肽断裂位点得分值
得
分
值

氨基酸位置
1 75 150 225 300 375 465
活性位点 二聚体界面
硫解酶
缩合酶超家族
PLN02287
提交序列
高度相似区域
超家族
多结构域
50 100 150 200 250 300 350
A B
C
D

6
5
4
3
2
1
0
a b c d e f g h i j
相
对
表
达
量

中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 1 期 2013 年 1 月

• 84 •
125: 789-794.
[3] Peng S, Guo Y H, Qi J J, et al. Isolation and expression
analysis of tuberous root development related genes in
Rehmannia glutinosa [J]. Mol Biol Rep, 2010, 37(2):
1069-1079.
[4] Yang Y H, Chen X J, Chen J Y, et al. Differential miRNA
expression in Rehmannia glutinosa plants subjected to
continuous cropping [J]. BMC Plant Biol, 2011, 11: 53-56.
[5] 孙 鹏, 郭玉海, 祁建军, 等. 地黄肌动蛋白基因片段
的克隆与序列分析 [J]. 安徽农业科学, 2008, 36(20):
8470-847l.
[6] 侯维海, 孙 鹏, 陈全家, 等. 地黄实时定量 PCR 内参
基因的筛选 [J]. 中国农学通报, 2011, 27(17): 76-82.
[7] 孙 鹏, 郭玉海, 祁建军, 等. 地黄 RgPR-10 基因的克
隆与表达 [J]. 西北农业学报, 2009, 18(1): 300-304.
[8] Yang Y H, Chen X J, Chen, J Y, et al. Identification of
Novel and Conserved microRNAs in Rehmannia
glutinosa L. by Solexa sequencing [J]. Plant Mol Biol
Rep, 2011, 29: 986-996.
[9] 周延清, 姚焕灵, 段红英, 等. 怀地黄基因片段及其中
转座酶基因的克隆与序列分析 [J]. 河南农业科学 ,
2012, 41(1): 106-109.
[10] 侯维海. 地黄 ABA、GA 和部分寡糖合成代谢关键酶基
因克隆与表达分析 [D]. 乌鲁木齐: 新疆农业大学 ,
2011.
[11] 臧亚超 , 孙 鹏 , 杨太新 , 等 . 地黄扩展蛋白基因
RgExpA1 的克隆与表达分析 [J]. 生物技术通报, 2012,
4: 420-25.
[12] Ramasubramanian S, Elena M, Magnus S, et al. The
crystal structure of a plant 3-ketoacyl-CoA thiolase
reveals the potential for redox control of peroxisomal
fatty acid β-oxidation [J]. Mol Biol, 2006, 359: 347-357.
[13] Akira K, Makoto H, Yuka T, et al. cDNA cloning and
expression of a gene for 3-ketoacyl-CoA thiolase in
pumpkin cotyledons [J]. Plant Mol Biol, 1996, 31:
843-852.
[14] Germain V, Rylott E L, Larson T R, et al. Requirement
for 3-ketoacyl-CoA thiolase-2 in peroxisome develop-
ment, fatty acid β-oxidation and breakdown of triacyl-
glycerol in lipid bodies of Arabidopsis seedlings [J].
Plant J, 2001, 28(1): 1-12.
[15] Chris C, Murcha M W, Millar A H, et al. Nine
3-ketoacyl-CoA thiolases (KATs) and acetoacetyl-CoA
thiolases (ACATs) encoded by five genes in Arabidopsis
thaliana are targeted either to peroxisomes or cytosol but
not to mitochondria [J]. Plant Mol Biol, 2007, 63: 97-108.
[16] Marco F, Ségolène A, Marie C C, et al. A role for the
peroxisomal 3-ketoacyl-CoA thiolase B enzyme in the
control of PPARa-mediated upregulation of SREBP-2
target genes in the liver [J]. Biochimie, 2011, 93: 876-891.
[17] Gonzalez N, Gerrit T S B, DirkInze, et al. What can the
tiny weed Arabidopsis teach us to improve biomass
production in crops [J]. Curr Opin Plant Biol, 2009, 12:
157-164.
[18] Krizek B A. Making bigger plants: Key regulators of final
organ size [J]. Curr Opin Plant Biol, 2009, 12: 17-22.
[19] 彭 丹, 周 波, 赵小英, 等. 甘蓝型油菜 BnCOP1 基
因编码区全长 cDNA 的克隆与功能研究 [J]. 中国生物
化学与分子生物学报, 2011, 27(1): 69-77.
[20] 任江萍, 刘海伦, 王新国, 等. 小麦逆境胁迫相关基因
Ta14S 的克隆及表达分析 [J]. 中国农业科学, 2012,
45(6): 1226-1234.