全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 3 期 2013 年 2 月

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• 药材与资源 •
滇重楼种子层积后脱落酸和赤霉素相关基因表达水平的研究
徐文娟，李先恩，孙 鹏，周丽莉，孙同玉，祁建军*
中国医学科学院 北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193
摘 要：目的 研究脱落酸（ABA）和赤霉素（GA）相关的 6 个基因（NCED、CYP707A、ABI2、PP2C、GA20ox2、GA20ox3）
在滇重楼种子休眠解除过程中的表达特点。方法 分别选取 20 ℃层积和 20 ℃转 4 ℃层积处理后处于不同休眠解除阶段的
滇重楼种子为材料，应用实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）方法分析不同层积处理后 6 个基因在胚和胚乳中的表达水平。结果
在滇重楼种子层积过程中 CYP707A、NCED、GA20ox2、GA20ox3 和 ABI2 基因在胚和胚乳中表达有差异，而 PP2C 表达水
平无明显变化规律；CYP707A 在低温层积后表达水平显著高于高温层积，尤其是在胚中，而 NCED、GA20ox2、GA20ox3
和 ABI2 在高温和低温层积后均有较高的表达水平，且在胚中的表达水平高于胚乳中。结论 所筛选出的 NCED、CYP707A、
ABI2、GA20ox2、GA20ox3 基因参与滇重楼种子休眠解除过程，可以作为研究滇重楼种子休眠过程的重要基因。
关键词：滇重楼；种子休眠；脱落酸；赤霉素；实时荧光定量 PCR；基因表达
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2013)03 - 0338 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.03.021
Studies on expression level of genes related to abscisic acid and gibberellic acid
in stratified Paris polyphylla var. yunnanensis seeds
XU Wen-juan, LI Xian-en, SUN Peng, ZHOU Li-li, SUN Tong-yu, QI Jian-jun
Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union medical College, Beijing
100193, China
Abstract: Objective To clarify the expression profile of six related genes (NCED, CYP707A, ABI2, PP2C, GA20ox2, and
GA20ox3) related to abscisic acid (ABA) and gibberellic acid (GA) during the dormancy of Paris polyphylla var. yunnanensis seeds.
Methods Using qRT-PCR method to clarify the six gene expression levels in seed embryo and endosperm, which were sampled in
different dormancy breaking stages after performing warm (20 ℃) and 20 ℃ turned to cold (4 ℃) seed stratification. Results The
CYP707A, NCED, GA20ox2, GA20ox3, and ABI2 genes had different expression profiles in embryo and endosperm while PP2C
showed no significant difference. The expression level of CYP707A was higher at cold stratification than that at warm stratification
especially in embryo, but the expression levels of NCED, GA20ox2, GA20ox3, and ABI2 were higher than those at two temperature
stratifications, and with higher expression in embryo than that in endosperm. Conclusion The selected ABA and GA related genes
(CYP707A, NCED, GA20ox2, GA20ox3, and ABI2) might participate in the seed dormancy breaking and could consider as an
important gene for the future research.
Key words: Paris polyphylla var. yunnanensis (Fr.) Hand. -Mazz.; seed dormancy; abscisic acid; gibberellic acid; qRT-PCR; gene expression

滇重楼 Paris polyphylla var. yunnanensis (Fr.)
Hand. -Mazz.为延龄草科（Trilliaceae）重楼属 Paris L.
植物，是重要的名贵稀缺药用植物。滇重楼种子为
生理形态休眠类型种子，即种子脱离母体植株后没
有完整的胚且存在萌发抑制物，即使外部条件最适
种子也不能萌发[1]。自然条件下，滇重楼种子从采
集当年到第 2 年冬季之前完成形态后熟，发育完全
的胚芽需经过第 2 年冬季低温打破胚轴的休眠到第
3 年春季才出苗，这说明，温度是影响滇重楼种子
萌发的重要因素。种子萌发主要受基因的表达调控，
大量突变体植株及同位素示踪技术的应用发现，脱
落酸（abscisic acid，ABA）和赤霉素（gibberellic acid，

收稿日期：2012-10-27
基金项目：国家自然科学基金资助项目（31171632）
作者简介：徐文娟（1987—），女，在读硕士研究生，研究方向为药用植物生物技术。E-mail: xwjxuwenjuan@163.com
*通信作者 祁建军 Tel: (010)62810019 E-mail: jjqi@implad.ac.cn
网络出版时间：2013-01-08 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1108.R.20130108.0939.003.html
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GA）是种子休眠或解除过程中起关键作用的内源信
号分子[2]，研究发现，GA 能诱导种子萌发，而 ABA
则抑制种子萌发[3]。NCED（9-cis-epoxycarotendid
dioxygenase）是催化有生物活性 ABA 合成的关键
酶[4]，CYP707A（8′-hydroxylase）是 ABA 分解代谢
的关键基因[5-6]，GA20-oxidases 是 GA 生物合成限
速酶[7-9]，PP2C（Serine/Threonine Protein Phosphatase
Type-2C）是真核生物体内一类丝氨酸/苏氨酸残基
蛋白磷酸酶，ABI2（ABA Inseneitive 2）是 PP2C 家
族成员，它们参与了 ABA 信号转导途径的负调控
功能[10]。结合具体的实验条件和样品类型来选择合
适的内参基因，采用实时荧光定量 PCR（real-time
quantitative reverse transcription PCR，qRT-PCR）分
析这些基因在不同温度处理的种子中的转录水平，
是研究层积温度如何影响滇重楼种子萌发的分子机
制的重要部分。
本研究采用不同温度（20 ℃、20 ℃转 4 ℃）
处理滇重楼种子，初步探索在滇重楼种子中表达
稳定的参考基因，并检测不同温度层积处理对滇
重 楼 种 子 种 胚 和 胚 乳 NCED 、 CYP707A 、
GA20ox2、GA20ox3、ABI2、PP2C 的转录水平，
旨在揭示不同温度影响滇重楼种子萌发的分子机
制，为探索滇重楼种子休眠破除的分子生物学方
法提供理论依据。
1 材料
滇重楼种子采自云南文山，由中国医学科学院
药用植物研究所祁建军副研究员鉴定为滇重楼 Paris
polyphylla var. yunnanensis (Fr.) Hand. -Mazz. 的种
子；总 RNA 提取采用百泰克公司多糖多酚植物总
RNA 快速提取试剂盒；反转录酶 RrimeScript®RT
reagent Kit With gDNA Eraser（Prfect Real Time）和
荧光定量试剂盒购自 Takara 公司；荧光定量仪器为
伯乐（Bio-Rad）公司 CFX—96 实时荧光定量 PCR
仪；本研究所选目标基因来源于滇重楼胚转录组 454
测序获得，基本信息见表 1，全部引物由生工生物工
程（上海）有限公司合成。
表 1 ABA 和 GA 相关的基因
Table 1 Genes related to ABA and GA
基 因 基因编码 基因注释 登录号
CYP707A Contig 123 ABA 8-羟化酶 ABA55732.1
NCED GLRWUMC02HBZ42 9-cis-epoxycarotendid dioxygenase XP 002511629
ABI2 GLRWUMC02IPFK8 ABA Inseneitive 2 NP 200515.1
GA20ox2 Contig6246 Gibberllin 20-氧化酶 2 NP001149543.1
GA20ox3 GLRWUMC02IWIPH Gibberllin 20-氧化酶 3 ACJ76438.1
PP2C Contig1287 protein phosphatase type-2C XP 002520256.1

2 方法
2.1 滇重楼种子的层积处理
成熟种子去皮，阴干，浸泡 12 h，于 18～20 ℃
沙藏层积至第 70 天时，分为 2 份，一份转入 4 ℃层
积，其余仍在 18～20 ℃条件下层积，第 130 天时根
据胚根长度各取不同萌发阶段的种子，见图 1。冲洗
干净后，蒸馏水冲洗，75%乙醇冲洗，擦干，纵切种
子，分离胚与胚乳，锡箔纸包裹，置液氮中冷藏备用。
2.2 序列引物设计
所有候选内参基因和目的基因序列由本实验室
通过滇重楼胚转录组测序获得，通过 Primer 5.0 软
件设计引物，见表 2。
2.3 总 RNA 提取与质量检测
总 RNA 提取按照 Bioteke 公司多糖多酚植物总
RNA 快速提取试剂盒步骤进行，Nanodrop 核酸分
析仪检测总 RNA 的浓度和纯度，根据选择条件

S1-胚根突破种皮 S2-胚根突破种皮后胚膨大 S3-根形成，下图同
S1-stage of radicals breaking through seed coat S2-stage of embryo
enlarged after radicals breaking through seed coat S3-stage of root
formed, same as below
图 1 滇重楼种子高温层积后不同发育阶段
Fig. 1 Different developmental stages of P.
polyphylla var. yunnanensis seeds
stratified in high temperature

S1 S2 S3
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表 2 引物序列信息
Table 2 Primer sequences
基因名称 引物序列 (5’-3’) 长度 / bp
ACT-2 正向 CTCTCTCAGCACCTTCCAGCAG 反向 TAACAACCCAAACAAACAATCC 160
ACT-7 正向 CTCGTCGGTGGAGAAGAGCT 反向 TCCAGGGAACGATGGTTGAT 227
HSPL 正向 TTACGGTTCGTCGAGGGAACATC 反向 GCCTCAGGCGTCTCCTTCCAGT 152
HSP90-1 正向 GTAGTCCTTGAGGCTCGTCATC 反向 AAGTGCATCGACTCTTCTTTGA 188
CAPDH-1 正向 GCCTTCCGAGTTCCAACAGCAA 反向 CACTCAAACCCCATACCAGCCT 218
CAPDH-3 正向 TTGTAGGTCGGTTAATCGTGG 反向 TTTGATTTGGCACAGGGTCT 216
CYP707A 正向 GGGGAAACTCTTCAGCTCTACTCCA 反向 TCCGGGCTCGACACCATCACA 126
NCED 正向 CGCGATATGCAATGGATGACC 反向 AGGCGACAAGTGACTAGAACAAC 122
ABI2 正向 ACCCAAACTGCTCCTTTCC 反向 ATGACCAATCAAGAGGTGTGT 235
GA20ox2 正向 TAACCACTACCCACCATGCCCTTCC 反向 TCTCCGAGTTCACCGCCACCCT 251
GA20ox3 正向 TACTACCCTCCGTGCCAGAAGC 反向 CTGAAGGCCGCCAACATCGTC 105
PP2C 正向 AATGGTAACAGAGCGGCA 反向 TGTGTCCCAAATAGCAAGC 268

（A260/280≈2.0～2.1，A260/230≈2.0）选择合格的总 RNA，
1.2%琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA 的完整性。
2.4 cDNA 第 1 链合成
按照 RrimeScript® RT reagent Kit With gDNA
Eraser（Perfect Real Time）试剂盒（TAKARA）步
骤进行，0.2 mL Eppendorf 管中配制 20 μL 的反应体
系：总 RNA 1.0 μg，5×PrimeScript® 缓冲液 2（for
Real Time）4 μL，Primescript® RT Enzyme Mix 1 μL，
RT Primer Mix 1 μL，加 RNase Free dH2O 补足至 20
μL，反应条件：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s，−20 ℃
保存备用。
2.5 qRT-PCR
反应在CFX—96型荧光定量PCR仪上（Bio-Rad）
运行，按照 SYBR premix Ex TaqTM II 试剂盒说明步
骤冰上配制反应体系：SYBR Premix EX TaqTM（2×）
12.5 μL，PCR 正向引物（10 μmol/L）0.5 μL，PCR 反
向引物（10 μmol/L）0.5 μL，DNA 模板 2 μL，灭菌
蒸馏水补足至 25 μL，设置温度梯度对基因进行 PCR，
最终确定反应条件为 95 ℃预变性 30 s，95 ℃变性 10
s，60 ℃退火延伸 40 s，40 个循环，延伸阶段收集信
号，从 60 ℃到 95 ℃，每个循环增加 0.5 ℃，持续
0.05 s 获得解链温度，采集融解曲线荧光信号。
3 结果与分析
3.1 总 RNA 质量检测及 cDNA 第 1 链合成
取总 RNA 样品 1 μL 在 Nanodrop 核酸分析仪
上对总 RNA 的浓度和纯度检测，记录结果，挑选
A260/280≈2.0～2.1，A260/230≈2.0 的样品，取 3 μL 于
1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示所有样品均有
完整的 5 S、18 S、28 S 条带，且 28 S 和 18 S 的条
带亮度之比约为 2，见图 2。电泳和定量分析结果说
明样品没有发生降解，质量良好，能满足后续实验
操作的要求。样品 cDNA 第 1 链合成后均能扩增出
参照基因，证明反转录成功。

1-S3−20 ℃胚乳 2-S2−20 ℃胚乳 3-S1−20 ℃胚乳 4-S3−20 ℃胚
5-S2−20 ℃胚 6-S1−20 ℃胚 7-S3−4 ℃胚乳 8-S2−4 ℃胚乳
9-S1−4 ℃胚乳 10-S3−4 ℃胚 11-S2−4 ℃胚 12-S1−4℃ 胚
1-S3−20 endosperm℃ 2-S2−20 endosperm℃ 3-S1−20 endosperm℃
4-S3−20 embryo℃ 5-S2−20 embryo℃ 6-S1−20 ℃ embryo 7-S3−4
endosperm℃ 8-S2−4 ℃ endosperm 9-S1−4 ℃ endosperm 10-S3−4
℃ embryo 11-S2−4 embryo℃ 12-S1−4 embryo℃
图 2 滇重楼种胚与胚乳总 RNA 电泳图
Fig. 2 Electrophoresis of total RNA from embryo and
endosperm of P. pllyphylla var. yunnanensis seeds
3.2 内参基因筛选
总 RNA 反转录后 4 倍浓度稀释 cDNA，即 1、
1/4、1/16、1/64、1/256，对 6 个候选内参基因做扩
增效率曲线，通过对候选内参基因的扩增，6 个候
选内参基因扩增效率均不同。其中 90%～110%为参
考基因的最适扩增效率，见表 3。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
28 S
18 S
5 S
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表 3 内参基因扩增效率
Table 3 Amplification efficiencies of reference genes
基因 扩增效率 / % r 斜率
ACT-2 107.5 0.995 3.154
GAPDH-3 109.5 0.996 3.113
HSPL 89.5 0.999 3.601
HSP90-1 94.9 0.998 3.451
ACT-7 100.4 0.996 3.312
CAPDH-1 99.7 0.970 3.328
不同层积后不同萌发阶段的滇重楼胚和胚乳共
12 份 cDNA，各取相同的量分别扩增 5 个扩增效率
合适的候选内参基因，得出的 Ct 值在 genorm 软件
中进行分析，M 值越小，表明此基因在不同温度处
理后的滇重楼胚和胚乳中表达越稳定，选取表达稳
定的参照基因，GAPDH-3 是本实验验证的比较合
适的参照基因。
3.3 ABA 和 GA 相关基因的转录水平分析
以 GAPDH-3 为参考基因，以 20 ℃处理的滇
重楼种子萌发初期胚为对照，采用定量 PCR 仪内置
的 BioRad CFX Manager 软件进行数据的处理分析，
每个样品做 2 次生物学重复和 3 次技术重复，基因
表达分析采用 2−△△Ct 计算方法，分别检测 NCED、
CYP707A、GA20ox2、GA20ox3、ABI2、PP2C 在
不同温度层积处理后不同萌发阶段滇重楼胚和胚乳
中的表达差异，结果见图 3。


图 3 NCED、CYP707A、GA20ox2、GA20oX3、PP2C、ABI2 转录水平
Fig. 3 Transcription levels of NCED, CYP707A, GA20ox2, GA20oX3, PP2C, and ABI2
由图 3 可知在不同层积温度和不同发育阶段，
NCED 在胚中的表达水平显著高于胚乳中，同时可
以看出种子层积 S1 阶段，NCED 表达水平最高，
而种子萌发后（S2、S3），NCED 表达降低。CYP707A
表达水平在低温（4 ℃）层积时均显著增加，且在
胚中的表达显著高于胚乳中。这说明，低温层积有
利于胚中 ABA 的降解。而 ABA 合成关键酶基因
NCED 在 S2、S3 期的表达量显著低于 S1 期，说明
ABA 的合成在层积后降低。
PP2C（包括 ABI2）是 ABA 信号分子，参与种
子萌发的负调控。基因表达分析证明，滇重楼种子
在休眠解除初期（S1），PP2C 和 ABI2 在胚乳中表
达量较高，而随着休眠解除和胚根生长（S2、S3 期），
ABI2 在胚中表达显著强于胚乳中表达。
在不同温度层积中，种子在发育的不同阶段
（S1、S2、S3），GA20ox2 在胚和胚乳中表达水平呈
现相反的阶段依赖，在胚中表达水平高低表现为
S1＜S2＜S3，而在胚乳中表现为 S1＞S2＞S3。同
时可以看到，GA20ox2 表达水平由 S1 期胚中低于
胚乳，至 S3 期时胚中的表达水平已经明显高于胚
乳中。GA20ox3 在胚中的表达水平为 S1 最高，S2
次之，S3 最低，而在高温（20 ℃）层积的胚乳中
的表达刚好相反，低温（4 ℃）层积几乎抑制其表
达。GA20ox2 和 GA20ox3 是 GA 合成关键酶，其
在高温层积时在胚中均有较高的表达量，但在胚乳
中表达差异较大，说明这两种 GA 合成关键酶对滇



20 ℃胚 20 ℃胚乳
20 ℃转 4 ℃胚
20 ℃转 4 ℃胚乳
1.5
1.0
0.5
0
16
12
8
4
0
2.0
1.5
1.0
0.5
0
1.5
1.0
0.5
0
1.5
1.0
0.5
0
3
2
1
0
S1 S2 S3 S1 S2 S3 S1 S2 S3
S1 S2 S3 S1 S2 S3 S1 S2 S3
相
对
表
达
量

相
对
表
达
量

相
对
表
达
量

相
对
表
达
量

相
对
表
达
量

相
对
表
达
量

NCED CYP707A GA20ox2
GA20ox3 PP2C ABI2
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重楼种子打破形态休眠有比较重要的作用。
4 讨论
ABA 和 GA 是影响种子休眠与萌发的主要因
素。ABA 与种子休眠相关，在成熟种子中 ABA 突
变体与种子休眠缺失相关，且当与 ABA 合成相关
的基因表达上调时能提高种子中 ABA 量，从而加
剧种子休眠深度，延缓种子萌发[11-16]。突变体技术
证明，CYP707A 的缺失导致了种子中大量合成
ABA。Okamoto 等[17]采用 RNA 原位杂交技术证实
了 CYP707A 在种子后熟过程中在胚和胚乳中均有
表达，并验证了 CYP707A 是影响种子从休眠转向
萌发的重要基因。CYP707A 在滇重楼种胚和胚乳中
均有表达，这与 Okamoto 等的研究结果相符。陈翠
等[18]比较了变温和恒温对滇重楼种子出苗率的影
响，结果为 18 ℃层积后再进行 0～10 ℃低温处理
显著提高了出苗率，本实验中 NCED 在种胚中的表
达水平高于胚乳中，低温层积对滇重楼种子中
NCED 表达无显著影响，但诱导了 CYP707A 在胚
中表达水平的大幅上调，进而促进胚中 ABA 的分
解代谢，这进一步证实了低温是提高滇重楼出苗率
的重要因素，而主要原因是 CYP707A 大量分解代
谢 ABA，而且在此过程中，胚是关键部位。Kuhn
等[19]的种子发芽试验证明了 AtPP2CA 基因过量表
达导致拟南芥的种子发芽以及气孔关闭对 ABA 不
敏感，相反，该基因的缺失则表现出对 ABA 的超
敏感特性，表明 PP2C 对 ABA 信号转导途径具有负
调控功能。而本实验中滇重楼种胚和胚乳 PP2C 不
受种子发育阶段、温度处理的影响，说明 PP2C 不
是滇重楼种子发育的主要影响因子。突变体的研究
证明了ABI2基因表达产物对ABA介导的信号转导
途径具有负调节[20,21]，滇重楼种子在胚膨大阶段和
根形成阶段均为 ABI2 在胚中表达高于胚乳中，表
明ABI2对ABA信号传导的负调控作用主要发生在
胚中。
研究证明，GA2ox、GA3ox、GA20ox 在 GA
参与的种子萌发中具有重要作用 [22]。GA3ox 和
GA20ox 参与 GA 的生物合成，而 GA2ox 则参与
GA 分解。本研究根据测序得到的引物未能成功扩
增 GA3ox 和 GA2ox 基因，但分析了两种 GA20ox
基因。孟凡蕴等[23]研究了滇重楼种子发育过程中内
源激素的变化得出 GA3 量与胚的变化正相关。本项
研究中，GA20ox2 呈现发育阶段依赖，随着胚根的
伸长，胚中转录水平升高，这与上述研究结果相符，
而 GA20ox3 表达呈下降趋势，与上述结果相反，这
证实了 GA20ox2 是影响种子发育的重要基因，其表
达上调促进胚的生长。Pipinis 等[24]比较了鹅耳枥属
植物种子在恒温和变温处理下种子萌发情况的差
异，得出低温处理前进行常温处理有利于种子萌发，
而本研究中低温处理降低了 GA20ox2 和 GA20ox3
催化合成 GA，这与上述结论相悖。本研究比较了
胚和胚乳中 GA20ox2 和 GA20ox3 的转录水平，且
胚乳中转录水平表现一定的阶段依赖，这说明胚乳
中 GA20ox2 的变化是影响种子发育的因素，需做深
入研究。
本实验筛选了滇重楼胚和胚乳中表达稳定的参
考基因，并应用其对 ABA 的合成相关基因 NCED，
ABA 失活代谢相关基因 CYP707A，GA 合成相关基
因 GA20ox2、GA20oX3，转录因子 ABI2 和 PP2C
的转录水平做了分析，分析了温度对这些基因的表
达影响，首次比较这些基因在胚和胚乳中转录水平，
以期探索除胚外胚乳对种子发育的影响机制，然而
种子萌发是一个复杂的过程，全面探索休眠相关基
因需进一步研究。
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