全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 22 期 2014 年 11 月

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大青属植物通用性 SSR 引物筛选及应用
邓绍勇，温 强，李康琴，叶金山，朱培林*
江西省林业科学院，江西 南昌 330032
摘 要：目的 获得在大青属 Clerodendrum L. 主要树种间具有较好通用性的 SSR 标记，并构建 DNA 指纹图谱用于该属重
要民族药用植物近缘种的分子甄别和遗传学研究。方法 选用 2 种大青属植物伊豆大青 C. izuinsulare 和海州常山 C.
trichotomum 的 19 对 SSR 引物，对大青属 9 个种共 9 个样本进行扩增检测。结果 17 对引物在广布种大青中有扩增产物，
通用率最高（89.5%），另有 7 对引物在所有样本中有扩增产物，通用率为 36.8%。采用多态性较好的 6 对 SSR 引物构建 9
个种的 DNA 指纹图谱，其中引物 CI140 可鉴定除白花灯笼和尖齿臭茉莉之外的 7 个种，该引物与 CI107、CI132、CI143 和
CT042 两两组合可鉴别所有 9 个种；利用遗传距离进行 UPGMA 聚类，结果显示腋序系白花灯笼单独成一组，海通和大青
成一组，其他聚类分组结果与其形态分类存在一定差别。结论 近缘种间共用 SSR 引物是开发大青属植物 SSR 标记行之有
效的方法，可为大青属植物分子标记资源的使用提供参考。
关键词：大青属；SSR；通用性；遗传距离；分子标记
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)22 - 3317 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.22.019
Screening and application of SSR primers in plants of Clerodendrum L.
DENG Shao-yong, WEN Qiang, LI Kang-qin, YE Jin-shan, ZHU Pei-lin
Forest Academy of Jiangxi Province, Nanchang 330032, China
Abstract: Objective In order to obtain SSR primers which has good universality among the main tree species of Clerodendrum L.,
and then molecular screening of DNA fingerprints was used in closely related species and genetic research of these ethnical medicinal
resources. Methods An experiment was conducted to study the transferability of 19 pairs of SSR primers developed from C.
izuinsulare and C. trichotomum and amplified in nine samples from nine species of Clerodendrum L. Results Seventeen pairs of 19
primers had the amplification products in C. cyrtophyllum, a cosmopolitan species, the transferability ratio was the highest (89.5%).
Seven pairs of primers were successfully amplified in all samples of Clerodendrum L. species, and the transferability ratio was 36.8%.
Six pairs of polymorphism SSR primers were used to construct the DNA fingerprints of nine Clerodendrum L. species. In the primers,
the CI140 identified seven Clerodendrum L. species except C. fortunatum and C. lindleyi. Coupled with CI132, CT042, CI107, or
CI143, they identified all of the nine Clerodendrum L. species. Then, the genetic distances were used to generate a UPGMA tree. The
results showed that C. fortunatum, belonging to Ser. Axilliflorae schauer, formed a cluster, and C. mandarinorum and C. cyrtophyllum
formed another cluster, while the clusters of the others were difference from the shape classifications. Conclusion The experiment
proves a good way to develop Clerodendrum L. SSR primers from other related species. This study provides the important reference for
the use of molecular markers of Clerodendrum L.
Key words: Clerodendrum L.; SSR; transferability; genetic distance; molecular markers

唇形科（Lamiaceae）大青属 Clerodendrum L. 植
物约 400 种，主要分布于热带和亚热带，少数分布
于温带地区[1-3]，中国产 33 种，大多分布于西南、华
南地区[4]。在中国，大青属植物多为民族药用植物，
具有清热解毒、祛风除湿、活血散瘀、降压、抗炎
镇痛等功效，常用于治疗感冒高热、风湿性关节炎、
跌打损伤、高血压、痈疽、疔疮等疾病[5-6]。在赣、
湘、鄂、浙、粤等省民间广泛使用的大青叶，原植
物为大青 C. cyrtophyllum Turcz.，具明显抗炎作用[7]。
此外该属植物很多种的花型奇特，作为观赏植物

收稿日期：2014-06-15
基金项目：江西省科技支撑项目（20142BBF60031）；江西省林业科学院青年培养项目（2011521201）
作者简介：邓绍勇（1982—），男，硕士，助理研究员，主要研究方向为植物资源学。Tel: (0791)83833803 E-mail: dsy1982cn@aliyun.com
*通信作者 朱培林（1964—），男，研究员。Tel: (0791)83833803 E-mail: yczpl@126.com
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驯化栽培的有灰毛大青 C. canescens Wall.、重瓣臭
茉莉 C. chinense (Osbeck) Mabb.、垂茉莉 C. wallichii
Merr.、海州常山 C. trichotomum Thunb.、臭牡丹 C.
bungei Steud. 等[8-10]，从国外引进栽培的有龙吐珠
C. thomsoniae Balf. f. 、红萼龙吐珠 C. speciosum W.
Bull、烟火树 C. quadriloculare (Blanco) Merr.、艳赪
桐 C. splendens G. Don 等[11-12]。可见该属植物作为
观赏及重要的中药材资源，具有巨大的开发潜力。
目前，中药资源开发利用普遍存在混淆品和伪
品影响药材品质的问题，而大青属很多植物种间外
观形态差异不显著，同样存在仅通过营养器官难以
区分的难点。随着现代分子生物学的发展，DNA 分
子标记技术在药用植物真伪鉴定、品种分类及优良
种质选育等方面有着很好的应用前景。一方面利用
该技术可揭示药用植物“道地性”可能存在的遗传
变异规律，从而指导道地性药材的科学栽培、繁育
与采集；另一方面，将分子标记技术所揭示的大分
子多态性与小分子药用成分的分布规律紧密结合起
来，也可指导药用成分的方便、快速、正确的寻找
与开发利用[13]。在众多分子标记中，SSR（simple
sequence repeat）标记由于其稳定性、共显性遗传、
多态性高、分析简单等优点，作为一种重要的分子
标记技术，已广泛应用于 DNA 指纹识别、遗传多
样性分析、遗传图谱的构建等遗传学研究。SSR 标
记的获取一般需要大量的 DNA 序列作为基础，然
而普遍认为 SSR 引物在近缘种间具有一定的通用
性[14-16]，因此，对遗传学研究基础较弱的物种，近
缘物种转移法已成为一种简便快速获得 SSR 标记
的有效方法。本研究旨在充分利用已经报道的伊豆
大青 C. izuinsulare 和海州常山 C. trichotomum 2 种
植物的 SSR 引物[17]，在国内大青属几个主要种中筛
选具有通用性的 SSR 标记，通过建立在 SSR 标记
基础上的 DNA 指纹识别技术，寻找稳定高效的大
青属近缘物种的分子鉴别手段。
1 材料及总 DNA 的获得
材料为大青属的 9 个本土树种，样品均为野生
异地保存于江西省林业科学院中药圃的植物资源，
经江西省林业科学院朱培林研究员鉴定确认，采集
幼嫩梢叶置于冰壶内带回实验室备用，树种产地信
息见表 1。总 DNA 提取采用 SDS 法[18-19]，各树种
随机选取 5 个单株相同浓度的 DNA 样品等量混合，
作为代表该树种的 DNA 样本[20-21]。
表 1 材料
Table 1 Experimental materials
编号 植物 产地 海拔 / m 地理位置
1 白花灯笼 C. fortunatum 江西省安远县 590 东经 115° 北纬 25°
2 赪桐 C. japonicum 江西省全南县 318 东经 114° 北纬 24°
3 臭牡丹 C. bungei 江西省明月山 499 东经 114° 北纬 27°
4 大青 C. cyrtophyllum 江西省南昌市 50 东经 115° 北纬 28°
5 海通 C. mandarinorum 江西省铜拔山 413 东经 118° 北纬 28°
6 海州常山 C. trichotomum 江西省武功山 747 东经 114° 北纬 27°
7 尖齿臭茉莉 C. lindleyi 江西省南昌市 322 东经 115° 北纬 28°
8 浙江大青 C. kaichianum 江西省武夷山 981 东经 117° 北纬 27°
9 灰毛大青 C. canescens 江西省信丰县 431 东经 115° 北纬 25°

2 方法
2.1 SSR-PCR 扩增及产物检测
10 μL PCR 反应体系包含：1×缓冲液，Mg2+ 2.5
mmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，引物 2.5 pmol，Taq 酶
1 U，DNA 10～20 ng。筛选引物的 PCR 扩增反应程
序采用 Touch-down PCR：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，
60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，20 个循环；再进入 94 ℃ 30
s，50 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，20 个循环；最后 72 ℃
延伸 10 min。种间 PCR 扩增程序：94 ℃ 2 min；94
℃ 30 s，退火 30 s（不同引物退火温度不同），72 ℃
60 s，30 循环；72 ℃ 10 min。SSR-PCR 产物采用
8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
2.2 数据统计和处理
采用在相同迁移率位置上有带记为“1”，无
带记为“0”的读带方法，建立原始数据库，并
用 Popgene 3.2 分析软件对统计数据进行遗传分
析[22]，从而获得各物种间遗传距离和相似性系数矩
阵。选用遗传距离数据矩阵利用 NTSYS-pc 2.1 软件
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按不加权成组配对法（UPGMA）进行聚类分析[23]，
建立亲缘关系树状图。
3 结果与分析
3.1 SSR 引物的通用性比较
本研究所用SSR引物中由伊豆大青C. izuinsulare
开发的有 10 对，由海州常山开发的为 9 对，共 19
对[17]。经 PCR 扩增检测，不同树种和这些引物的扩
增成功率存在一定差异（表 2），其中 17 对引物均可
在广布种大青中扩增出清晰稳定的带型，比率最大为
89.5%，而臭牡丹能扩增比率最小，为 57.9%，其他
大部分种能扩增比率为 75%左右。有 7 对引物能够
在所有供试大青属植物中扩增出清晰稳定的带型，
占所用引物的36.8%，扩增等位基因数为3～5个（表
3）。7 对引物中，引物 CT040、CT042 具通用性，
海州常山的引物通用比率为 22.2%，其他 5 对引物
来自伊豆大青 C. izuinsulare，其引物通用比率为
50%。7 对引物中引物 CT040 表现为单态性，其他
6 对引物多态性较好，部分引物的电泳图见图 1。
表 2 9 种大青属植物的扩增结果
Table 2 Results of cross-species amplification of nine species from Clerodendrum L.
引物 白花灯笼 赪桐 臭牡丹 大青 海通 海州常山 尖齿臭茉莉 浙江大青 灰毛大青
CI107 + + + + + + + + +
CI111 − − − + − + − − −
CI124 + − − + − − − − −
CI127 − + − + − − − − +
CI132 + + + + + + + + +
CI140 + + + + + + + + +
CI141 + + + + + + − + +
CI142 + + + + + + + + +
CI143 + + + + + + + + +
CI144 + − − − − − − − +
CT021 + + + + + − + + +
CT024 − + − + + + + + +
CT026 + + − + + + + + +
CT028 + + − + + + + − −
CT031 + + − + + + + + +
CT040 + + + + + + + + +
CT041 + + + − + − + + +
CT042 + + + + + + + + +
CT043 + − + + + + + + +
“+”表示有扩增结果，“−”表示没有扩增结果
“+” indicates successful amplification of PCR product, “−”indicates non-successful amplification of PCR product
表 3 通用性的引物
Table 3 Transferability microsatellite primers
引物 重复序列 序列 (5’-3’) 退火温度 / ℃ 大小 / bp 等位基因数
CT040 (TC)6(AG)6 反向ACACACACACACAGAGAGAGAG 56 130～145 3
正向 GTCCTACTTCTGCAGGTTTG
CT042 (TC)6(AC)4 反向 TCTCTCTCTCTCACACACACAC 56 95～105 4
正向 ATTGGGCTGCCTGTCAAACTGG
CI107 (TC)6(AC)5 正向 TCTCTCTCTCTCACACACACAC 55 135～150 3
正向 CATACGCAGTCAGTTCTTC
CI132 (TC)6(AC)5 反向 TCTCTCTCTCTCACACACACAC 56 110～120 4
正向 CCTCAACAACCAATCAAGA
CI140 (TC)6(AG)8 正向ACACACACACACAGAGAGAGAG 60 175～195 5
反向 CAGTATACCGAGGAGGGTTT
CI142 (TC)6(AC)5 正向 TCTCTCTCTCTCACACACACAC 58 100～115 4
反向 TGTTCTTGTGCAAACATACC
CI143 (TC)6(AC)10 正向 TCTCTCTCTCTCACACACACAC 52 105～115 5
反向 ACAACTGTTATGGAACTCACG
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图 1 引物 CI107 (A)、CI132 (B)、CI142 (C) 在 9 种大青
属植物 DNA 样品中的扩增结果
Fig. 1 Banding patterns of SSR marker CI107 (A),
CI132 (B), and CI142 (C) amplified on DNA
sample of nine Clerodendrum L. species
3.2 大青属种间遗传关系分析
由表 3 中 6 对有多态性的引物对 9 个大青属树
种供试样品 PCR 扩增结果（图 1）建立原始数据
库，采用 Popgene 3.2 软件统计数据，9 个种的
Shannon’s 多样性指数为 1.152 3，Nei’s 基因多样度
为 0.266 9，9 种大青属植物的遗传距离在 0.239 8～
1.892 6，相似系数在 0.150 7～0.786 8（表 4），白
花灯笼和赪桐间遗传距离最大，为 1.892 6；大青
和海通之间的遗传距离最小，为 0.239 8。
以遗传距离矩阵为分析对象，利用 NTSYS-pc 2.1
软件按不加权成组配对法（UPGMA）进行聚类分析，
建立大青属 9 个树种间的亲缘关系树状图（图 2）。
表 4 根据 SSR 分析的大青属 9 个种间的遗传距离 (下) 和相似系数 (上)
Table 4 Genetic distance (down) and genetic similarity (up) of nine speeies of Clerodendrum L. based on SSR analysis
植物 白花灯笼 赪桐 臭牡丹 大青 海通 海州常山 尖齿臭茉莉 浙江大青 灰毛大青
白花灯笼 — 0.150 7 0.352 8 0.280 0 0.368 9 0.220 7 0.223 3 0.357 1 0.325 9
赪桐 1.892 6 — 0.649 3 0.580 2 0.321 6 0.372 7 0.556 2 0.738 0 0.536 7
臭牡丹 1.041 9 0.431 9 — 0.358 9 0.235 3 0.429 1 0.452 1 0.590 5 0.554 4
大青 1.273 0 0.544 4 1.024 7 — 0.786 8 0.599 7 0.609 1 0.409 9 0.344 4
海通 0.997 1 1.134 3 1.446 8 0.239 8 — 0.373 9 0.425 5 0.379 4 0.241 6
海州常山 1.510 8 0.987 1 0.846 1 0.511 3 0.983 7 — 0.679 0 0.470 6 0.578 1
尖齿臭茉莉 1.499 3 0.586 7 0.793 8 0.495 8 0.854 4 0.387 2 — 0.610 3 0.701 8
浙江大青 1.029 7 0.303 8 0.526 7 0.891 8 0.969 2 0.753 8 0.493 9 — 0.530 0
灰毛大青 1.121 1 0.622 2 0.589 9 1.066 1 1.420 6 0.548 0 0.354 1 0.634 8 —
矩阵右上角为相似系数，左下角为遗传距离
Nei’s genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal)

图 2 基于 SSR 标记的 9 个大青属树种 UPGMA 系统树
Fig. 2 UPGMA dendrogram of nine wild species of
Clerodendrum L. based on SSR markers
从聚类结果来看，遗传距离等于 0.50 时可将 9
个树种分为 4 个组，海通和大青显示最近的亲缘关
系组成一组，臭牡丹、赪桐和浙江大青聚成一组，
海州常山、尖齿臭茉莉和灰毛大青聚成另一组，而
白花灯笼自成一组。
3.3 DNA 指纹识别分析
SSR 标记构建的指纹图谱可作为大青属种间
区别的参考。根据多态引物扩增的电泳结果，以
6 个 SSR 标记构建大青属 9 个树种的指纹图谱，
由表 5 可见，引物 CI140 多态性最为丰富，可一
次性鉴定除白花灯笼与尖齿臭茉莉之外的 7 个树
种，此外引物 CI132 与 CT042 可分别一次性将白
花灯笼与其他树种区分开，而引物 CI107 和 CI143
可各自将尖齿臭茉莉和其他树种区别开，故可用
以上 5 对引物进行两两组合将所有供试的 9 个树
种区分开。
白花灯笼
赪桐
浙江大青
臭牡丹
海州常山
尖齿臭茉莉
灰毛大青
大青
海通
0.24 0.50 0.77 1.03 1.30


200 bp
150 bp
100 bp
200 bp
150 bp
100 bp

200 bp
150 bp
100 bp

A

B

C
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M
相似系数
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表 5 大青属部分种 6 个 SSR 标记的指纹图谱
Table 5 Six SSR fingerprints of some wild species in Clerodendrum L.
相同迁移带迹标识
种名
CI107 CI132 CT042 CI140 CI142 CI143
白花灯笼 001 1000 1000 00001 0010 00100
赪桐 010 0100 0100 00100 0001 00001
臭牡丹 010 0010 0100 01001 0010 10001
大青 001 0100 0010 10100 0101 00001
海通 001 0001 0010 11000 0001 00101
海州常山 010 0010 0010 00101 0100 01100
尖齿臭茉莉 100 0100 0100 00001 0001 10010
浙江大青 001 0010 0100 01010 0001 00100
灰毛大青 010 0010 1010 00001 0001 01000

4 讨论
SSR 引物的通用性在一定程度上依赖于近缘物
种之间 SSR 侧翼序列的保守性和进化过程中 SSR
的稳定性。SSR 两端的侧翼序列在生物的基因组中
特别是在亲缘关系比较近的种间具有不同程度的保
守性，许多研究表明微卫星侧翼序列在属内种间和
亲缘关系较近的属间是相当保守的，且表现出亲缘
关系越近其通用性越高[24]。本研究使用的 19 对引
物都是通过磁珠富集法开发的 gSSR 标记[17]，共有
7 对有通用性，属内不同种间通用性比率为 36.8%，
通用性比率相对较高，从另一个侧面也能反映供试
树种亲缘关系较近。另外，分子标记 SSR 普遍存在
侧翼序列保守的现象，在属内不同种间引物通用性
仍有较大差别[25]。总之，来至日本伊豆群岛的特有
种 C. izuinsulare 开发的引物中虽然有 5 对能在 9 个
树种中得到很好的扩增，而海州常山所开发引物仅
有 2 对具有很好的通用性，但对两者不具通用性的
引物进行比较，相比由海州常山所开发引物能在 9
个树种的大部分种得到扩增，由 C. izuinsulare 开发
的 5 对不具通用性引物，只在极个别供试树种间得
以扩增，仅通过本实验还不足以判断上述 2 树种引
物的通用性高低。此外，由海州常山开发的标记
CT021和CT041在本实验用本种个体尚未能扩增出
条带，有待今后通过更多的本种个体来验证以上 2
对引物是否可用。
供试 9 种大青属植物在属下等级分属于腋序系
Ser. Axilliflorae schauer（白花灯笼）、密序系 Ser.
Densiflora schauer（灰毛大青、尖齿臭茉莉、臭牡
丹）、疏序系 Ser. Paniculata schauer（海州常山、浙
江大青、海通）、鳞叶系 Ser. Squamata schauer（赪
桐）和垂序系 Ser. Penduliflorae schauer（大青）[4]。
Yuan 等[26]使用 4 个进化速率较快的叶绿体 DNA 区
域 trnT-L、trnL-F、trnD-T、trnS-fM 研究了大青属
产自亚洲的 16 个种和 1 个亚种的系统发育关系，密
序系形态很接近的臭牡丹和尖齿臭茉莉 2 个种聚类
在一起，但也将密序系灰毛大青和垂序系大青聚类
在一起，将腋序系白花灯笼和疏序系海州常山聚类
在一起。可见，大青属属下等级的分子系统研究和
其形态学分类存在一定差距。本研究中，利用 Nei’s
遗传距离进行 UPGMA 聚类，分析结果能很好地把
属于腋序系的白花灯笼和其他种区分开，显示该种
与其他系树种有较远的亲缘关系，而垂序系的大青
属于灌木，它和疏序系属于高大乔木的海通聚到了
一起，遗传距离为 0.239 5，表现出最为接近的亲
缘关系；同时，属于密序系的灰毛大青和尖齿臭茉
莉也聚集在一起，但属于疏序系的海州常山和它们
显示关系较近，这与海州常山和灰毛大青都有宿萼
宽大且变成鲜红色的表型特点一致；此外，属于疏
序系的浙江大青和鳞叶系的赪桐（其花序也是属于
疏序）聚到了一起。总之，采用 CI107、CI132、
CI140、CI143 和 CT042 标记进行两两组合均可将
所有供试的 9 个树种区分开，研究结果为今后森林
药材的甄别奠定了技术基础，而由于受供试样品个
体数、物种数及引物数量等的限制，本研究基于
SSR 的大青属属内种间亲缘关系分析仅能反应部
分物种的种间关系，其中分子数据与形态分类差别
最大的是疏序系，初步分析作为属下等级它很可能
不是个自然类群。
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