全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 14 期 2014 年 7 月 ·2051·

苦参素对肝星状细胞 HSC-T6 增殖及端粒酶的影响
周于禄 1，刘小云 2，刘世坤 1，袁 洪 1*
1. 中南大学湘雅三医院，湖南 长沙 410013
2. 赣南医学院第一附属医院，江西 赣州 341000
摘 要：目的 探讨苦参素在诱导肝星状细胞 HSC-T6 凋亡过程中的作用，以及对端粒酶及其亚单位端粒酶逆转录酶（rTERT）
mRNA 表达的影响。方法 将不同质量浓度的苦参素与 HSC-T6 细胞共培养不同时间后，MTT 法检测苦参素对 HSC-T6 细
胞的生长抑制作用；流式细胞术检测苦参素对 HSC-T6 细胞凋亡的影响；TRAP-PAGE-银染法检测苦参素作用后 HSC-T6 细
胞中端粒酶活性的改变；RT-PCR 检测苦参素对 HSC-T6 细胞 rTERT mRNA 表达的影响。结果 苦参素能显著抑制 HSC-T6
细胞生长、诱导细胞凋亡、降低端粒酶活性，并抑制 rTERT mRNA 表达。结论 苦参素对 HSC-T6 细胞增殖具有抑制作用，
可能与抑制细胞端粒酶及其亚单位 rTERT 的活性有关。
关键词：苦参素；肝星状细胞；HSC-T6；细胞凋亡；端粒酶；端粒酶逆转录酶
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)14 - 2051 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.14.018
Effects of oxymatrine on proliferation of hepatic stellate cells HSC-T6
and expression of telomerase
ZHOU Yu-lu1, LIU Xiao-yun2, LIU Shi-kun1, YUAN Hong1
1. The Third Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410013, China
2. The First Affiliated Hospital of Gannan Medical University, Ganzhou 341000, China
Abstract: Objective To investigate the induction effect of oxymatrine on the apoptosis process in rat hepatic stellate cell line HSC-T6
and to define its impact on telomerase activity and mRNA expression of subunit telomerase reverse transcriptase (rTERT). Methods
HSC-T6 cells were cultivated with different concentration of oxymatrine for different time periods. Effect of oxymatrine on the growth
inhibition of HSC-T6 cells was analyzed by MTT assay. Apoptosis of HSC-T6 cells was detected by flow cytometry. Telomerase
activity was determined by TRAP-PAGE-silver staining and the expression of rTERT mRNA was examined by RT-PCR assay. Results
Oxymatrine significantly suppressed the growth of HSC-T6 cells and induced apoptosis, and also reduced the activity of telomerase
and inhibited the rTERT-mRNA expression in HSC-T6 cells. Conclusion The function that oxymatrine inhibits the proliferation of
HSC-T6 cells may be associated with its action on the cellular telomerase and telomerase rTERT-mRNA activity.
Key words: oxymatrine; hepatic stellate cells; HSC-T6; apoptosis; telomerase; telomerase reverse transcriptase

苦参素（oxymatrine）是豆科植物苦参 Sophora
flavescents Ait. 的生物碱提取物，是苦参的主要药
效成分，其中含氧化苦参碱高达 98%，以往研究证
实，苦参素具有调节免疫、抗炎、抑菌、抗心律失
常、抗病毒、抗纤维化和抗肿瘤等多重功效[1-4]。目
前关于苦参素治疗肝纤维化的研究较多，但是对于
其治疗肝纤维化的分子机制方面的研究还比较少。
本课题组在前期工作的基础上，选择肝星状细胞
HSC-T6 为研究模型，探讨不同质量浓度的苦参素
对肝星状细胞凋亡、端粒酶及其催化亚单位端粒酶
逆转录酶（rTERT）mRNA 表达的影响，以初步探
讨苦参素抑制肝星状细胞生长的作用机制，旨在为
苦参素治疗肝纤维化提供新的理论依据。
1 材料
1.1 药品及试剂
苦参素（含氧化苦参碱 98%）购自武汉圣天宇

收稿日期：2014-03-24
基金项目：湖南省卫生厅科研基金课题（132011-037）
作者简介：周于禄（1972—），男，博士在读。E-mail: yulu0027@126.com
*通信作者 袁 洪 E-mail: zyltougao@126.com
·2052· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 14 期 2014 年 7 月

科技有限公司，噻唑蓝（MTT）、硝酸银、焦碳酸二
乙酯（DEPC）均购自美国 Sigma 公司；丙烯酰胺、
N, N′-亚甲基丙烯酰胺、四甲基乙二胺（TEMED）购
自华美公司；RT-PCR 试剂盒购自 MBI Fermentas 公
司；Trizol 试剂购自 Invitrogen 公司；端粒酶活性检测
试剂盒购自 Roche 公司；Annexin V-FITC Kit 购自
Gene Tech 公司。
1.2 细胞株
HSC-T6为SV40转染SD大鼠肝星状细胞而成为
活化的肝星状细胞，购于中南大学湘雅中心实验室。
1.3 仪器
MCO—175 CO2 培养箱（日本 Sanyo 公司），
IX71 荧光倒置显微镜（日本 Olympus 公司），
ABI9700 型 PCR 扩增仪（美国 ABI 公司），XDS—
1B 型倒置生物显微镜（重庆光电仪器总公司），
FACSCalibur 流式细胞仪（美国 Bectondickinson 公
司），InGenius LHR 型凝胶成像分析系统（英国
Syngene 公司），酶标仪（美国 Bio-TEK 公司）。
2 方法
2.1 细胞培养
将 HSC-T6 细胞接种于含 100 U/mL 青霉素、
100 U/mL 链霉素、10%胎牛血清的 DMEM 高糖培
养液，在 37 ℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养，
隔天换液，待细胞生长至密度为 80%～90%时，开
始传代。所有实验均采用对数生长期的细胞。
2.2 MTT 比色法检测细胞生长抑制率
HSC-T6 细胞经胰酶消化，接种于 96 孔培养板，
每孔 100 μL 培养液含 2 000 个细胞，培养 24 h 后弃
培养液，每孔加入终质量浓度分别为2、4、6、8 mg/mL
的苦参素培养液 100 μL，对照组不加药，另设空白
组（只加培养液，无细胞），每组 8 个复孔，重复 4
个批次，分别于培养后的 24、48、72 h 加入 MTT（5
mg/L）10 μL，4 h 后加入 DMSO 150 μL/孔，避光振
荡摇匀，以空白孔调零，在酶标仪上检测 490 nm 处
的吸光度（A）值，计算细胞生长抑制率。
生长抑制率＝1－A 实验组 / A 对照组
2.3 细胞凋亡的检测
取 1×108/L 的细胞悬液接种于 6 孔培养板，每
孔加细胞悬液 2.0 mL，培养 24 h 后弃培养液，加入
终质量浓度分别为 2、4、8 mg/mL 的苦参素新鲜培
养液 2.0 mL，同时设不加药物的对照组，培养 24、
48 h 后收集细胞。采用 Annexin V-PI 双染色法检测
细胞凋亡。用冷 PBS 洗涤细胞（4 ℃，500 r/min
离心 5 min），去除上清后用冷的结合缓冲液调整细
胞数为 1×108～1×109/L。取此细胞悬液 100 μL，
加入 5 μL Annexin V-FITC 溶液和 2.5 μL 碘化丙啶
（PI）溶液。于冰上避光孵育 10 min，加入 150 μL
冷的结合缓冲液。1 h 内用流式细胞仪检测暴露在
细胞表面的磷脂酰丝氨酸（PS），所有数据经
WinMDI 软件收集分析。
2.4 TRAP-PAGE 银染法检测端粒酶活性
细胞处理同“2.3”项，收集细胞（1×108/L）
4 ℃，6 500 r/min 离心 5 min 以形成细胞团。去除
上清液，用 PBS 重悬细胞并重复离心步骤。加入
200 μL 裂解液重悬细胞小团，冰上预冷并充分混
匀，于冰上孵育 30 min。4 ℃，15 000 r/min 离心
20 min，将上清（约 170 μL）移至另一洁净的
Eppendorf 管中，−80 ℃保存备用或即用。取上述
提取液 3 μL 加入 25 μL 扩增液，用无菌三蒸水补足
体积至 50 μL，加 40 μL 灭菌石蜡油覆盖，在 PCR
扩增仪上运行，25 ℃、30 min 引物延伸；94 ℃、
5 min 端粒酶灭活；扩增反应，94 ℃、30 s，50 ℃、
30 s，72 ℃、90 s，30 个循环，72 ℃平衡 10 min。
取 PCR 反应产物 10 μL，进行 12%非变性聚丙
烯酰胺凝胶电泳，电压 180 V，1 h 左右，银染。当
出现相隔 6 bp 的梯形条带即为端粒酶活性阳性。
InGenius LHR 型凝胶成像分析系统分析，用各泳道
灰度减阴性对照的灰度后与对照组灰度的比值作
为端粒酶活性的相对值。
2.5 RT-PCR 法检测端粒酶 rTERT mRNA 的表达
细胞处理同“2.3”项，收集细胞，抽提总 RNA：
用不含小牛血清的 DMEM 高糖培养液洗涤收集的
HSC-T6 细胞 2 次，计数 1×106 个细胞，Eppendorf
管离心沉淀后加 Trizol 试剂 1 μL，抽提总 RNA。
cDNA 链合成：按逆转录试剂盒说明书操作。终体
积 20 μL，其中总 RNA 4 μL，随机引物 1 μL，5×
缓冲液 4 μL，核糖核酸酶抑制剂（RNasin）1 μL，
10 mmol/L dNTP 2 μL，逆转录酶（ReverTra Ace）1
μL，ddH2O 7 μL。PCR 扩增仪上运行，30 ℃、10 min，
42 ℃、20 min，99 ℃、5 min；−20 ℃保存。扩增引
物 rTERT（5’-GCTAAATCCCTCATTCCTACT-3’，
5’-TTCACCCTCCACATCAGTT-3’）和 GAPDH（5’-
TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3’，5’-GGATGT-
CAACGTCACACTTCATG-3’），引物由上海生工生
物工程技术服务有限公司合成。
PCR 反应体系终体积为 50 μL，含 10×缓冲液
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 14 期 2014 年 7 月 ·2053·

5 μL，Mg2+ 3 μL，dNTPs 1 μL，cDNA 2 μL，上下
游引物各 1.5 μL（20 μmo1/L），Taq 酶 2 μL，取 10
μL 扩增产物 2%琼脂糖凝胶电泳（电压 8 V/cm，电
流 20 mA，时间 30 min），用 InGenius LHR 型凝胶
成像分析系统分析，将各泳道灰度减去阴性对照后
与GAPDH条带灰度的比值作为 rTERT mRNA的相
对活性值。
2.6 统计学分析
数据均以 ±x s 表示，用 SPSS 18.0 软件对数据进
行统计分析，先进行方差齐性检验，如果方差齐性，
进行单因素方差分析（ANVOA），认为双侧 P＜0.05
为差异有统计学意义，其中两两比较选用最小显著
差异法（LSD）。
3 结果
3.1 对 HSC-T6 细胞生长的抑制作用
不同质量浓度苦参素分别作用 HSC-T6 细胞
24、48、72 h，以生长抑制率为纵坐标，时间为横坐
标绘制生长曲线，结果作用 24、48、72 h 的直线回
归方程分别为 Y＝0.565 6－0.021 7 X（r2＝0.985 9）、
Y＝0.857 2－0.040 9 X（r2＝0.989 8）、Y＝0.953 2－
0.055 8 X（r2＝0.989 7）。随着苦参素质量浓度的增
加，细胞生长抑制率逐渐升高，表明苦参素对
HSC-T6 细胞生长的抑制作用有显著的浓度依赖
性。作用 24、48、72 h 的 IC50 分别为 12.95、10.41、
8.36 mg/mL，结果见表 1。
3.2 对 HSC-T6 细胞凋亡的影响
终质量浓度为 2、4、8 mg/mL 的苦参素与
HSC-T6 细胞共培养 24 h 后，Annexin V-PI 双染色，
流式细胞术检测细胞凋亡。结果显示，随着质量浓
度的增加，苦参素诱导 HSC-T6 细胞凋亡的作用呈
上升趋势，表明苦参素诱导 HSC-T6 细胞凋亡具有
浓度依赖性，结果见表 2。
表 1 苦参素对 HSC-T6 细胞生长的抑制作用 ( ± = 4x s , n )
Table 1 Inhibition of oxymatrine on growth of HSC-T6 cells ( ± = 4x s , n )
24 h 48 h 72 h
组别 ρ / (mg·mL−1)
A 值 抑制率 / % A 值 抑制率 / % A 值 抑制率 / %
对照 — 0.569±0.090 — 0.863±0.129 — 0.973±0.114 —
苦参素 2 0.514±0.019 9.67 0.757±0.057* 12.28 0.813±0.069* 16.44
4 0.489±0.018* 14.06 0.711±0.055* 17.61 0.735±0.057* 24.46
6 0.427±0.034* 24.96 0.609±0.044* 29.43 0.616±0.037* 36.69
8 0.396±0.072* 30.40 0.548±0.056* 38.82 0.584±0.085* 47.17
与对照组比较：*P＜0.05，表 2 同
*P < 0.05 vs control group, Table 2 is same
表 2 苦参素对 HSC-T6 细胞凋亡的影响 ( ± = 4x s , n )
Table 2 Effect of oxymatrine on apoptosis of HSC-T6 cells
( ± = 4x s , n )
组别 ρ /
(mg·mL−1)
存活细胞 /
%
凋亡细胞（早
期＋晚期）/ %
死亡细胞
/ %
对照 — 96.24±6.24 1.87±1.05 1.89±1.12
苦参素 2 90.12±5.36 7.31±1.84* 2.57±1.04
4 82.34±6.33 12.54±2.01* 5.12±1.22
8 69.45±4.68 22.48±3.35* 8.07±1.37

3.3 对 HSC-T6 细胞端粒酶活性的影响
不同质量浓度苦参素作用不同时间后，随着苦
参素质量浓度的增加和共培养时间的延长，端粒酶
活性的银染条带逐渐减弱。表明苦参素对 HSC-T6
细胞端粒酶活性的抑制作用与其作用质量浓度和
时间有依赖关系，结果见表 3。
表3 苦参素对HSC-T6细胞端粒酶活性的影响 ( ± = 4x s , n )
Table 3 Effect of oxymatrine on activity of telomerase
in HSC-T6 cells ( ± = 4x s , n )
端粒酶相对活性 / % 组别 ρ /
(mg·mL−1) 24 h 48 h
对照 — 96.24±3.37 90.51±5.31
苦参素 2 90.31±6.82 81.34±5.62*#
4 86.34±3.51* 62.38±4.39*#
8 66.84±6.13* 50.37±4.42*#
与对照组比较：*P＜0.05；与 24 h 比较：#P＜0.05，表 4 同
*P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs 24 h, Table 4 is same
3.4 对 HSC-T6 细胞 rTERT mRNA 表达的影响
凝胶成像可见HSC-T6细胞 rTERT mRNA表达
随苦参素质量浓度的升高及作用时间的延长而减
弱（图 1）。结果显示，相同的作用时间，4、6 mg/mL
·2054· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 14 期 2014 年 7 月

苦参素作用细胞后，rTERT mRNA 的表达较对照组
减弱（P＜0.05）；在相同质量浓度的苦参素作用下，
48 h 组的 rTERT mRNA 表达较 24 h 组减弱（P＜
0.05）；表明苦参素对 HSC-T6 细胞 rTERT mRNA 表
达的抑制作用呈浓度和时间依赖关系，结果见表 4。






图 1 苦参素对 HSC-T6 细胞 rTERT mRNA 表达的影响
Fig.1 Effect of oxymatrine on rTERT mRNA expression
of HSC-T6 cells
表 4 苦参素对 HSC-T6 细胞 rTERT mRNA 相对表达量的
影响 ( ± = 4x s , n )
Table 4 Effect of oxymatrine on relative expression of
rTERT mRNA in HSC-T6 cells ( ± = 4x s , n )
rTERT mRNA 相对表达量 组别
ρ /
(mg·mL−1) 24 h 48 h
对照 — 84.21±12.33 71.65±10.68
苦参素 2 82.45±15.24 70.36± 9.67#
4 70.62±10.49* 59.87± 5.71*#
8 52.69± 8.34* 42.36± 3.68*#

4 讨论
肝星状细胞（HSCs）数量占肝脏细胞总数的
15%，是肝脏纤维化过程中合成细胞外基质（ECM）
的主要细胞类型。在肝脏受到损伤后肝细胞通过产
生过氧化脂质以及释放一系列细胞因子，包括转化
生长因子-β（TGF-β）、血小板衍生因子（PDGF）
等，导致 HSC 被激活，活化的 HSC（此时称为肌
成纤维样细胞）合成 ECM 增加，并且成分也发生
变化，从以合成 I 型胶原为主变为以合成致密的、
不易降解的 IV 型胶原为主，从而导致 ECM 合成增
加，降解减少，沉积在肝组织中，形成纤维化，甚
至发展为肝硬化[5-9]。本研究显示，苦参素具有抑制
HSC-T6 细胞生长、诱导其凋亡的作用，该作用与
苦参素抗肝纤维化药理作用相符[10]。有研究表明苦
参素可以通过激活肝星状细胞的 NGF/p75 通路，下
调核因子-κB（NF-κB）蛋白表达，上调 Caspase-3
蛋白表达，从而启动肝星状细胞的凋亡。
端粒的长度和端粒酶活性的调节对器官和组
织的衰老、慢性疾病以及肿瘤的发生和进展起了关
键作用。对肝脏而言，端粒的缩短限制了慢性肝病
中肝细胞的再生，最终导致肝再生能力的耗竭和肝
硬化及肝癌的形成。肝纤维化病变过程中，肝细胞
端粒缩短，HSCs 中的端粒却与之相反[11-12]。提示
在肝纤维时 HSCs 端粒酶的活性较强。Schnabl 等[13]
发现激活的 HSCs 转染 hTERT 后，激活的 HSCs 会
永生化，并且持续保持激活的表型。这就表明抑制
HSCs 内端粒酶的活性就很可能抑制 HSCs 的激活
或生长，从而治疗肝纤维化。有研究发现，苦参素
可抑制 TGF-β1刺激的 HSC-T6 细胞内 p38MAPK途
径的激活，明显降低 p38 磷酸化水平；抑制 TGF-β1
刺激的 HSC-T6 细胞内 TβRI、Smad2、Smad3 蛋白
的表达，上调 Smad7 的表达。苦参素可以通过抑制
JAK/STAT 途径的激活，降低炎症因子 TNF-α 和
IL-6 的表达，对抗败血症模型小鼠的肺损伤。在
CCl4 诱导的纤维化大鼠中，苦参素可以抑制 Smad4
的表达，抑制 Kuffer 细胞活化，并抑制旁分泌对肝
星状细胞的刺激[3,14]。本研究发现 HSC-T6 与苦参
素随着培养的浓度的增加，共培养时间的延长，端
粒酶活性的银染条带也逐渐减弱直至消失，HSC-T6
细胞端粒酶活性的抑制与苦参素的作用浓度和时
间有依赖关系，且苦参素对 HSC-T6 细胞 rTERT
mRNA 表达的抑制作用呈浓度和时间依赖关系，提
示苦参素可作为一种有效的 HSC-T6 细胞端粒酶活
性抑制剂，提示苦参素可能通过抑制端粒酶活性及
其亚单位 rTERT mRNA表达并最终诱导HSC-T6细
胞凋亡。
参考文献
[1] 张鸣号, 王秀玉, 何沿虹. 氧化苦参碱对感染性休克大
鼠心肌组织细胞因子的影响 [J]. 中草药, 2012, 43(11):
2242-2246.
[2] 缪永杰, 王君芬. 复方苦参注射液在晚期肿瘤患者联
合化疗中的临床观察 [J]. 中草药 , 2010, 41(3):
449-451.
GAPDH
rTERT
GAPDH
rTERT
24 h
48 h
Marker 对照 2 4 6
苦参素 / (mg·mL−1)
Marker 对照 2 4 6
苦参素 / (mg·mL−1)
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 14 期 2014 年 7 月 ·2055·

[3] 邓子煜. 苦参素抗大鼠肝纤维化作用及其分子机制
[D]. 合肥: 安徽医科大学, 2009.
[4] 冯国梁. 苦参素的治疗作用研究进展 [J]. 疾病监测与
控制, 2010, 4(4): 210-211.
[5] Gressner A M. Transdifferentiation of hepatic stellate
cells (Ito cells) to myofibroblasts: a key event in hepatic
fibrogenesis [J]. Kidney Int Suppl, 1996, 54: S39-S45.
[6] Faouzi S, Burckhardt B E, Hanson J C, et al. Anti-fas
induces hepatic chemokines and promotes inflammation
by an NF kappa-β-independence caspase-3-dependent
pathway [J]. Biol Chem, 2001, 276(52): 49077-49082.
[7] Begriche K, Igoudjil A, Pessayre D, et al. Mitochondrial
dysfunction in NASH: causes, consequences and possible
means to prevent it [J]. Mitochondrial, 2006, 6(1): 1-28.
[8] Zhao G, Zhang Z Q, Zhang B, et al. Down-regulation of
tTG expression by RNAi inhibits HSC proliferation and
attenuates liver fibrosis [J]. Int J Clin Exp Pathol, 2011,
112(1): 233-243.
[9] Brunati A M, Tibaldi E, Carraro A, et al. Cross-talk
between PDGF and S1P signalling elucidates the
inhibitory effect and potential antifibrotic action of the
immunomodulator FTY720 in activated HSC-cultures [J].
Biochim Biophys Acta, 2008, 1783(3): 347-359.
[10] 翁山耕, 胡雨云, 田雄英, 等. 苦参碱诱导大鼠肝星状
细胞凋亡的体外研究 [J]. 福建医科大学学报, 2009,
43(6): 443-446.
[11] Wiemann S U, Satyanarayana A, Tsahuridu M, et al.
Hepatocyte telomere shortening and senescence are
general markers of human liver cirrhosis [J]. Faseb J,
2002, 16(9): 935-942.
[12] Autexier C, Lue N F. The structure and function of
telomerase reverse transcriptase [J]. Annu Rev Biochem,
2006, 75: 493-517.
[13] Schnabl B, Choi Y H, Olsen J C, et al. Immortal activated
human hepatic stellate cells generated by ectopic
telomerase expression [J]. Lab Invest, 2002, 82(3):
323-333.
[14] Hu Y Y. Pay attention to the study on active antiliver
fibrosis components of Chinese herbal medicine [J]. Chin
J Integr Med, 2012, 18(3): 1-5.