全 文 ：国际消化病杂志　2009年 6月　第 29卷　第 3期　Int J Dig Dis , June 25 , 2009 , Vol.29 , No.3
·论著·
扯根菜浸膏对 TGF-β1肝星状细胞胞内信号转导通路的影响
贺劲松　周大桥　童光东　杨从意　陈英杰　高　辉　陈　亮　张　来　占伯林　程　晶　李　群
摘要:目的　观察扯根菜浸膏对 TGF-β1肝星状细胞胞内信号转导通路的影响 。方法　HSC-T6常规
培养后分为正常组 、模型组和药物组 ,用含 0.5%FBS 的 DMEM 培养 ,模型组在相同培养条件下加入 TGF-
β1刺激 ,药物组分别用不同浓度药物培养液加 TGF-β1刺激 ,采用 A lamar Blue 法检测细胞活力 ,四甲基偶
氮唑蓝(MT T)法检测药物细胞毒性;根据 Alamar Blue 法及 MTT 的结果 ,选择药物组用含 2 mg/ml药物
的 0.5%FBS 培养液加上 TGF-β1刺激 ,24 h 后采用 Western blo tt ing 法检测细胞 I 型胶原 、α-肌动蛋白 、
ERK蛋白表达及磷酸化水平。结果　不同浓度扯根菜浸膏均能抑制细胞增殖 ,在 24 h 增殖抑制明显 ,以 2
mg/ml浓度最明显;MT T 结果示 2 mg/ml药物组对细胞无明显的毒性 ,而 10 mg/ml 、50 mg/ml药物组对
细胞有明显的毒性;扯根菜浸膏对 I 型胶原及α-肌动蛋白的表达均有明显抑制 ,与模型组比较 , P <0.01;对
ERK蛋白表达未见明显抑制 ,与模型组比较 , P>0.05;但扯根菜浸膏对磷酸化 ERK水平及表达均有明显
的抑制 ,与模型组比较 , P<0.01。结论　扯根菜浸膏能明显抑制肝星状细胞分泌 I型胶原及α-肌动蛋白 ,
减少细胞外基质沉积 ,其部分作用机制可能与抑制 TGF-β1的胞内 ERK信号转导有关。
关键词:扯根菜浸膏;肝纤维化;肝星状细胞;细胞外信号调节激酶
Ef fects of Penthorum chinense Pursh extractum on TGF-β1 activated signal transduction within hepatic stellate cells　HE J in-
song , Z HOUDa-qiao , TONGGuang-dong , et al.Department of L iver Diseases , S henzhen Hosp ital o f T raditional Chinese
Med icine , Shenzhen(518033), China
Abstract:Objective　To obser ve the effects of Pentho rum chinense Pur sh ex tractum on TGF-β1 activated signal transduc-
tion within hepatic stellate cells.Methods　HSC-T6 cells we re divided into 3 g roups:the cells of the normal gr oup incubated
with DMEM including 0.5%NBS , the cells of the model g roup treated w ith DMEM including 0.5% NBS and TGF-β1 , the
cells o f the drug g roup t reated with DM EM including 0.5%NBS and different concentr ation of drug Penthorum chinense Pursh
ext ractum and TGF-β1.The HSC-T6 viability was observ ed by A lama r Blue assay , while the to xicity o f Pentho rum chinense
Pursh ex tractum w as measured by M TT assay.According to the results o f the A lama r Blue assay and M TT assay , the drug
gr oup treated w ith 2mg/ ml o f drug was chosen a s the model o f the later experiment.After 24 h , The expression of Co l I , α-
SM A , ERK pro tein and phospho ry lation a re analyzed by Western blo tting assay.Results　Different concentra tions o f the drug
could a ll inhibit HSC-T6 prolifera tion , o f which w as the most significant at 24 h and in 2 mg/ml concentra tion of drug.MT T
assay indicated that 2mg/ ml concentra tion of drug had no obvious to xicity to H SC-T6 (P>0.01), while 10mg/ ml and 50mg/
ml concentrations o f drug had obvious to xicity to HSC-T6 , and the re w ere significant diffe rence (P <0.01 , respectively).
Compa red to the model g roup , the drug significantly dow n-regulated the protein expression o f Col I , α-SM A and ERK phos-
phory lation , the re were distinct difference(P<0.01 , respectively).While the pro tein expre ssion of ERK was obv iously no t
restrained by the drug , and the re was no significant diffe rence(P>0.05).Conclusions　Drug Pentho rum chinense Pur sh ex-
tractum can significantly decreaseα-SM A and Col I sec retion from activ ated hepatic stellate cells , inhibit the depo sitio n of ECM
in liv er , and its par t mechanism o f action may be re lated to the inhibition o f the ERK signa l tr ansduction o f TGF-β1.
Key words:Pentho rum chinense Pursh ex tractum;Fibrosis hepa tic;Stellate cell;Ex tracellular signal-regula ted kinase
　基金项目:国家中医药管理局立项课题(06-07JB05),深圳市科技
局重点资助课题(JH200505260246A)
　作者单位:518033　深圳市中医院肝病科(贺劲松 ,周大桥 , 童光
东 ,陈英杰 ,高辉 , 陈亮 ,张来, 占伯林);深圳市宝安区中医院(杨
从意);广州中医药大学(程晶 ,李群)
　通信作者:周大桥 , Email:zdqdocto r@sina.com
　　扯根菜又名赶黄草 ,具有清热解毒 、通络活血 的功效。临床资料显示[ 1-3] ,扯根菜有明显降低血清
HA 、LN 、Ⅳ-C 、PC-Ⅲ含量 ,减少细胞外基质的生成
与沉积 ,促进胶原降解 ,调解免疫功能 ,从而抑制和
逆转肝纤维化的作用。转化生长因子 β1(TGF-β1)
是重要的促肝纤维化细胞因子[ 4] ,可分别通过Smad
与细胞外信号调节激酶(ERK)等途径促进细胞外
基质(ECM)生成 ,促进肝星状细胞(HSC)的活化 ,
从而导致肝纤维化的发生 。扯根菜浸膏是扯根菜
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的有效提取物。本研究中 ,我们以活化的肝星状细
胞 HSC-T6 为细胞模型 , 观察用扯根菜浸膏对
TGF-β1促进 HSC活化 、增殖分泌Ⅰ型胶原和α-肌
动蛋白的影响 , 及对 TGF-β1 胞内信号转导通路
ERK蛋白的影响 。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　细胞模型　HSC-T6 ,表型为活化的 HSC ,
购自上海中医药大学附属曙光医院肝病研究所 ,以
DMEM 液培养 ,加 10%FBS(V/V), 100 KU/L 青
霉素 , 100 mg/ L 链霉素 , 以 0.25%胰蛋白酶
-0.02%EDTA 消化传代培养 。
1.1.2　实验药物　扯根菜浸膏 ,为扯根菜茎部植
物组织经乙醇 、石油醚 、乙酸乙酯 、正丁醇依次萃取
后所得 ,由中嘉国际四川古蔺肝苏药业有限公司提
取与鉴定 。
1.1.3　主要试剂　Alamar Blue购自 BioSource 公
司 ,DMEM 培养液购自 Gibco BRL 公司 ,四甲基偶
氮唑蓝(MT T)、胎牛血清(FBS)购自华美生物工程
公司 ,BCA蛋白浓度测定试剂盒 、ECL底物化学发光
剂购自 PIERCE公司 , TGF-β1抗体购自 Oncogene公
司 , I型胶原抗体购自 Ola Biochem 公司 ,α-肌动蛋白
(α-SMA)抗体购自 Sigma公司 , ERK2 抗体 、磷酸化
ERK抗体(p-ERK)购自 Santa Cruz公司。
1.2　方法
1.2.1　药物制备　将扯根菜浸膏用无血清 DMEM
溶解 ,经 0.45μm 滤膜过滤除菌后 ,用 0.5%FBS 稀
释成 2 mg/ml、10 mg/ml 、50 mg/ml终浓度的药物
培养液。
1.2.2 　TGF-β1 与药物温育液添加 　无血清
DMEM 洗涤细胞 2 次 , 而正常组和模型组换为
0.5%FBS/DMEM 培养液 , 药物组分别换成含
2mg/ml 药物的 0.5%FBS 培养液 , TGF-β1 以
5 mmol/L HCl溶解与激活 ,按 100 pmol/L 的终浓
度加入模型组和药物组 ,均温育 24 h。
1.2.3 　扯根菜浸膏抑制细胞增殖试验 采用
Alamar Blue法[ 5-6] ,参考说明书并略有改进。分正
常组 、模型组及 2mg/ml 、10mg/ml 、50 mg/ml 的药
物组 ,然后 5个组均分别设细胞组 、对照组 、背景组 ,
细胞组设 6个复孔 ,对照组 、背景组均设 3 个复孔 。
将 HSC-T6单细胞悬液 1×105/ml按每孔 100 μl
接种到 96 孔板 , 模型组细胞加入 TGF-β1 及
Alamar Blue液 10 μl/孔 ,药物组细胞添加不同浓度
的扯根菜浸膏及 A lamar Blue 液 10 μl/孔;对照组
无细胞 ,添加与细胞组相同体积的 DMEM 和血清 ,
同时加入 Alamar Blue 液 10 μl/孔;背景组添加与
细胞组相同体积的 DMEM 和血清 , 不加 Alamar
Blue液。用多功能酶标仪检测波长 570 nm 、595 nm
处第 2 h 、4 h 、8 h 、16 h 、24 h 、48 h时的各孔吸光度
(A570/595), 实验重复 3次 。通过计算各孔的吸光
度来确定实验所需的 AB值 。
1.2.4　药物细胞毒性测定　采用四甲基偶氮唑蓝
(MT T)法检测[ 7] 。将 HSC-T6单细胞悬液分为正
常组 、模型组及药物组 ,温育 20 h ,加 MT T ,振荡后
继续培养 4 h ,去上清液 ,加酸性异丙醇 ,置培养箱
温育 5 min ,多功能酶标仪波长 570 nm 、690 nm 处
测各孔吸光度(A570/690), 实验重复 3 次 。以
A690作为背景值进行计算 。
1.2.5　Western-blot ting 法分析细胞 Ⅰ型胶原蛋
白 、α-肌动蛋白 、ERK 蛋白表达及磷酸化水平 、
Smad蛋白及磷酸化水平的表达 TGF-β1与 2 mg/
ml药物培养液培养 HSC-T6 24 h ,收集细胞 ,经细
胞裂解液裂解 ,离心后取上清液 , BCA 法测定上清
液总蛋白含量 ,取含 30 μg 总蛋白的上清液进行
10%SDS-PAGE电泳 ,经硝酸纤维素膜转移 、封闭
后 , 分别与 Ⅰ型胶原抗体 、α-SMA 抗体 、ERK2/
p-ERK(均为 1∶200)抗体 ,孵育 ,洗涤 ,再与 HRP
偶联的第二抗体作用 ,反应信号经 ECL 底物化学发
光检测。
1.2.6　统计学处理　计量资料用 x ±s表示 ,应用
单因素方差分析 , 两两比较用 q 检验 , 检验水准
为α=0.01 。
2　结果
2.1　扯根菜浸膏对抑制 HSC-T6增殖的影响
2 mg/ml 、10 mg/ml 、50 mg/ml的药物组用含
有 DMEM 药物培养液温育细胞 ,有相似曲线 ,均可
促进 HSC-T6 的增殖抑制率增长 ,尤其在 24 h 时增
殖抑制明显 ,与模型组相比较 ,在 2 h 、4 h 、8 h 、16 h
均无统计学意义(P >0.01),而在 24 h 、32 h 、48 h
均有统计学意义(P <0.01);但与正常组相比 ,在
32 h 、48 h均无统计学意义(P>0.01),故选择 24 h
为实验时间。同时在显微镜下观察 , 2mg/ml 药物
组细胞活力良好 ,因此后续实验均采用 2mg/ml的
药物进行实验 。上述结果表明 ,适当浓度的血清可
促进 HSC-T6增殖 ,但与模型组比较 , 2 mg/ml的
药物组在 24 h时对该细胞的增殖抑制率有明显抑
制 ,亦即扯根菜浸膏可抑制 HSC-T6增殖 。
2.2　扯根菜浸膏药物血清对 HSC-T6的毒性影响
在 24 h及 48 h 处 ,模型组的 A570/690值均明
显升高(与正常组相比 ,有统计学意义 P<0.01),表
明 TGF-β1可活化 、刺激 HSC-T6 增殖 ,造模成功。
2mg/ml药物组在 24 h 及 48 h 处均无明显的细胞
毒性作用(与模型组比较 ,均 P>0.01)。 10 mg/ml
药物组在 24 h处未呈现明显的细胞毒性(与模型组
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比较 P>0.01),但在 48 h 处却显示明显的细胞毒
性(与模型组比较 , P<0.01)。50 mg/ml药物组在
24 h及 48 h处均呈现明显的细胞毒性(与模型组比
较 , P<0.01)。据此结果 ,后续实验选用 2 mg/ml
的药物进行实验 。
2.3　扯根菜药物对 HSC-T6 细胞 Ⅰ型胶原蛋白表
达的影响
从表 1可以看出 , Ⅰ型胶原与内参照的灰度密
度积分比显示 ,模型组与正常组相比 , Ⅰ型胶原的表
达量有增加 ,差异有统计学意义(P<0.01);而药物组
的Ⅰ型胶原的表达量明显减少 ,与模型组比较 ,差异
有统计学意义(P<0.01)。结果显示 2 mg/ml药物
组明显抑制 HSC-T6Ⅰ型胶原蛋白表达。
表 1　扯根菜浸膏对Ⅰ型胶原蛋白表达的影响
Western-blotting法(n=3 , x±s)
组别 C ol Ⅰ/GAPDH 密度积分
210(相对分子质量) 90(相对分子质量)
正常组 1.141±0.020 0.968±0.021
模型组 1.365±0.023﹟ 1.171±0.012﹟
药物组 0.676±0.012﹟﹟ 1.074±0.015﹟﹟
　　注:﹟ P<0.01 ,与正常组比较;﹟﹟ P<0.01 ,与模型组比较
2.4　扯根菜药物对 HSC-T6 细胞α-SMA 蛋白表
达的影响
从表 2可以看出 ,α-SMA 蛋白与内参照的灰度
密度积分比显示 ,模型组与正常组相比 , α-SMA 蛋
白的表达量有所增加 , 差异有统计学意义(P <
0.05);而药物组的 α-SMA 蛋白的表达量明显减
少 ,与模型组比较 ,差异有统计学意义(P<0.01)。
结果表明 2 mg/ml药物组明显抑制 HSC-T6 细胞
α-SMA蛋白的表达 。
表 2　扯根菜浸膏对α-SMA表达的影响
Western-blotting法(n=3 , x ±s)
组别 α-SMA/GAPDH 密度积分
正常组 1.061±0.029
模型组 1.488±0.012﹟
药物组 0.444±0.018##
　　注:﹟ P<0.05 ,与正常组比较;##P<0.01 ,与模型组比较
2.5　扯根菜浸膏对 HSC-T6 细胞 ERK 蛋白及磷
酸化 ERK(p-ERK)表达的影响
从表 3 可以看出 , ERK2蛋白与内参照的灰度
密度积分比显示 ,模型组与正常组比较 , ERK2蛋白
的表达量无明显变化 , 差异无统计学意义(P >
0.01);而药物组的α-SMA 蛋白的表达量无明显变
化 ,与模型组比较 ,差异无统计学意义(P>0.01)。
结果显示 2 mg/ml药物组对 TGF-β1刺激对 HSC-
T6细胞内 ERK2总蛋白水平表达无明显作用 。由
于 ERK2 蛋白的表达量不因 TGF-β1 的刺激而变
化 ,较为恒定 ,故可选用 ERK2 的灰度密度积分作
为参照物 。
ERK1/2蛋白与 ERK2蛋白的灰度密度积分比
显示 ,模型组与正常组比较 , ERK1/2蛋白的表达量
有所增加 ,差异有统计学意义(P<0.01);而药物组
的 ERK1/2蛋白的表达量明显减少 ,与模型组比较 ,
差异有统计学意义(P<0.01)。结果显示 2 mg/ml
药物组对细胞内 ERK2总蛋白水平表达无明显作
用 ,但明显抑制 TGF-β1刺激的细胞 ERK1/2磷酸
化水平。
表 3　扯根菜浸膏对 ERK蛋白及磷酸化 ERK(p-ERK)
表达的影响 Western-blotting 法(n=3 , x±s)
组别 p-ERK/ ERK2密度积分比
44(相对分子质量) 42(相对分子质量)
正常组 0.744±0.022 0.875±0.012
模型组 1.396±0.012＊ 1.376±0.009＊
2 m g/ml药物组 0.851±0.001## 0.819±0.010##
　　注:﹟ P<0.01 ,与正常组比较;##P<0.01,与模型组比较
3　讨论
肝纤维化的发生是由于 ECM 在肝内过度沉积
所致 ,尤其是胶原异常增生和沉积为特征[ 8] ,其中心
环节是 HSC的活化和向成纤维细胞转化合成大量
的细胞外基质 ,细胞外基质环境及多种细胞因子相
互作用促进了肝纤维化的形成和发展 ,而 Ⅰ型胶原
是 ECM 的主要成分 , α-SMA 蛋白的过度表达是
HSC活化的标志 。而 TGF-β 是一类能够调节细胞
生长和分化的多肽 ,具备多种生物学作用 ,在肝纤
维化发生发展过程中具有活化 HSC ,促进胶原基因
表达 、促进细胞外基质合成与沉积等作用 ,是重要
的促肝纤维化细胞因子之一[ 9] 。研究发现 ,肝纤维
化形成过程中 , 局部损伤组织及循环血中的活性
TGF-β1水平上升 。本实验发现 ,扯根菜浸膏能明
显抑制 HSC-T6的 I 型胶原及α-SMA 的蛋白表达 ,
表明扯根菜浸膏能显著减少细胞外基质的合成与
沉积 ,进而可起到治疗肝纤维化的作用 。
TGF-β1的促 ECM 生成作用须通过其胞内外
信号转导途径完成[ 10] 。TGF-β1在胞外激活 ,与胞
膜上特异性 TGFβ Ⅰ/ Ⅱ型受体(TβR-Ⅰ/ Ⅱ)结合
完成信号跨膜 ,同时可激活胞内有丝裂原的蛋白激
酶(MAPK)这条信号通路。TGF-β1能活化多条丝
裂活化的蛋白质激酶(MAPK)通路 , TGF-β1/ERK
通路在 TGF-β1的促 ECM 生成中也起着重要作用 ,
Davis 等[ 11] 给 HSC 转染显性失活 ERK , 结果引
起胶原基因表达的抑制;而转染相应的野生型ERK
(下转第 231页)
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腹腔多发血管瘤多见于儿童 ,成人罕见 。临床
表现为腹水 、贫血 、腹痛 、黑便等 ,在外伤 、车祸等刺
激下血管瘤发生破裂可致腹腔内出血 ,需要紧急手
术治疗。手术往往不能完整切除血管瘤 ,但对诊断
和治疗有积极意义 。本例患者腹腔镜术后出现血
压下降 、脉搏细速等征象 ,考虑为术后腹腔内压力
改变引起血管瘤破裂致大量出血 ,进展为低血容量
性休克;切除两处血管瘤后 ,腹水基本消失 ,此病例
提示在腹水原因未明时 ,及时的外科干预既可以明
确诊断也可以治疗 ,从而避免病情恶化。术后 10 d
B超检查仍有少量腹水 ,可能是手术未能根治血管
瘤 ,也可能是血管瘤本身合并血小板减少(Ka-
sabach-Merrit t综合征)所致腹腔内渗血 ,但患者家
属拒绝再次行剖腹检查 ,选择支持治疗;国外有腹
腔内注射链球菌制剂(OK-432)治疗腹腔内血管瘤
合并难治性腹水[ 5] 的报道 。
患者血清及腹水 CA 125明显升高可能与腹水
刺激腹膜导致腹膜间皮细胞合成 、释放 CA 125 增
加有关 ,如果腹水消失 , CA 125水平即可以降至正
常;临床上需注意排除卵巢癌 、睾丸肿瘤等生殖系
统肿瘤[ 6] 。
参　考　文　献
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(收稿日期:2008-04-28)
(本文编辑:周骏)
(上接第 226页)
质粒却引起胶原基因的表达增加。 Hayashida
等[ 12]研究表明 ,在异源性的 DNA结合转录分析中 ,
显性失活的 ERK减少了 TGF-β1诱导的 Smad3 的
活性 ,证实 ERK依赖的 R-Smad接头域的磷酸化作
用增强了Ⅰ型胶原合成 ,提示 ERK 和 Smad信号之
间在胶原产生上存在着协同作用。
通过本研究发现 ,不同浓度扯根菜浸膏药物浓
度均能抑制 HSC-T6增殖 ,以 2mg/ml药物组最显
著;细胞毒性试验显示高浓度扯根草浸膏有一定细
胞毒性 ,而低浓度扯根草浸膏无明显细胞毒性;扯
根菜药物血清对 HSC-T6 的 Ⅰ型胶原 、α-SMA 及
ERK1/2磷酸化的蛋白水平均有明显抑制作用 ,与
正常组比较 ,差异有统计学意义(P<0.01)。上述
结果表明 ,扯根菜浸膏能显著减少细胞外基质的合
成与沉积 ,进而可起到治疗肝纤维化的作用 ,同时
提示扯根菜浸膏影响 TGF-β1刺激 HSC-T6细胞活
化与抗肝纤维化的可能机制之一在于下调 HSC-T6
细胞内 TGF-β1信号转导通路 ,即抑制 TβR-Ⅰ蛋白
表达与 ERK1/2的磷酸化。
参　考　文　献
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(本文编辑:王立明)
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