全 文 ：文章编号:1007 － 8738(2013)03 － 0282 － 02
双氢杨梅树皮素抑制人肝星状细胞增殖和减少胶原蛋白、TGF-β1 和
PDGF生成
王小琴，郑作文* (广西中医药大学药学院，广西 南宁 53000
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收稿日期:2012 － 10 － 09; 接受日期:2012 － 10 － 23
基金项目:广西科技基础条件平台《中药药效研究重点实验室建设》(1004604)
作者简介:王小琴(1986 －) ，女，四川成都人，在读硕士
Tel:18775397685;E-mail:zengxianfeng10@ 126． com
* Corresponding author，郑作文，E-mail:zzw_nn@ 163． com
［关键词］ 双氢杨梅树皮素;人肝星状细胞;胶原蛋白;细胞因子 ［中图分类号］ R392-33，R965． 1 ［文献标志码］ B
双氢杨梅树皮素为藤茶所富含的黄酮类化合物，
其含量高达 27% ～28%［1 － 2］，又名蛇葡萄素、二氢杨
梅素、福建茶素、白蔹素等。藤茶系葡萄科蛇葡萄属
植物显齿蛇葡萄的嫩茎叶［3］，为广西瑶族民间药用
的草药之一［4］。有文献报道，双氢杨梅树皮素对实
验性肝纤维化具有抗肝纤维化的作用［5 － 6］。肝星状
细胞(hepatic stellate cell，HSC)是细胞外基质(extra-
cellular matrix，ECM)的主要来源，HSC 的活化是肝
纤维化形成的中心环节和必要条件，其中胶原蛋白
是 ECM的主要成分，转化生长因子 β1(transforming
growth factor-β1，TGF-β1)、血小板衍生因子(platelet
derived growth factor，PDGF)是刺激 HSC 活化的关键
因子。本实验采用 MTT法及 ELISA 法分析双氢杨梅
树皮素对 Lx-2 细胞增殖和胶原蛋白、细胞因子
(TGF-β1、PDGF)生成的影响。
1 材料和方法
1． 1 材料 双氢杨梅树皮素来源于藤茶 Ampelosis grossedent-
ata (Hand． -Mazz． )W． T． Wang的嫩茎叶，由广西中医药大
学中药化学教研室提供，纯度为 98%。DMEM 干粉培养基和
胎牛血清为美国 Gibco公司产品;胰酶为 HyClone 公司产品;
人Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原 ELISA试剂盒为 R＆D公司产品;Lx-2 人
肝星形细胞购于上海复祥有限公司;EPOCH-全波长酶标仪为
美国 Bio-Tek产品。
1． 2 方法
1． 2． 1 MTT法检测 Lx-2 细胞增殖 取对数生长期 Lx-2 细胞
以 2． 5 g /L胰酶消化，用含 100 mL /L 胎牛血清的高糖 DMEM
培养液制备成 1 × 105 个 /mL 细胞悬液，接种至无菌的 96 孔
板内，每孔 100 μL。置 37℃、50 mL /L CO2 的培养箱中培养
24 h，观察到细胞贴壁良好后，吸出旧培养液。以孔为单位分
成 5 组(药物组加入用含 100 mL /L 胎牛血清的 DMEM 完全
培养液稀释的药液，药液终浓度分别为 200． 0、100． 0、75． 0、
50． 0、33． 0、22． 0 μg /mL。阳性组秋水仙碱的浓度6． 25 μg /
mL。空白对照组只加含 100 mL /L胎牛血清的 DMEM 完全培
养液) ，每组设 4 个平行孔，100 μL /孔。置 37℃、50 mL /L
CO2 培养 48 h。每孔加 MTT溶液 10 μL，37℃继续培养 4 h;
小心吸去上清液，每孔加 DMSO 150 μL，室温下用微型超声
振荡器 2 min。用酶标仪于 450 nm 处测吸光度(A)值。抑制
率 =(1 － A药物 /A对照)× 100%。
1． 2． 2 ELISA法检测 Lx-2 细胞生成的Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白
及细胞因子含量 取对数生长期 Lx-2 细胞以 2． 5 g /L胰酶消
化，用含 100 mL /L 胎牛血清的高糖 DMEM 培养液制备成
1 × 105 /mL细胞悬液，接种至无菌的 96 孔板内。每孔内加
100 μL。置 37℃、50 mL /L CO2 的培养箱中培养 24 h，观察
到细胞贴壁良好后，吸出旧培养液。以孔为单位分成 5 组
(药物组加入用含 100 mL /L 胎牛血清的 DMEM 完全培养液
稀释的药液，药液终浓度分别为 50． 0、33． 0、22． 0 μg /mL(选
择无毒浓度下的药液浓度)。阳性组秋水仙碱的浓度 6． 25
μg /mL。空白对照组只加含 100 mL /L 胎牛血清的 DMEM 完
全培养液) ，每组设 3 个平行孔，100 μL /孔。置 37℃、
50 mL /L CO2 培养 48 h。小心收集细胞上清液 3 000 r /min离
心 10 min，取上清液，按 ELISA 试剂盒操作说明书检测Ⅰ、
Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白及 TGF-β1、PDGF含量。
1． 2． 3 统计学分析 采用 SPSS12． 0 进行数据的统计分析。
计量资料以 x ± s 表示，组间比较用 t 检验(方差不齐时采用
t检验校正公式) ，P ＜ 0． 05 为差异有统计学意义。
2 结果
2． 1 MTT比色法检测 Lx-2 细胞增殖 双氢杨梅树
皮素作用于 Lx-2 细胞 48 h 后，可抑制细胞增殖，且
呈剂量依赖关系(表 1)。
282 细胞与分子免疫学杂志(Chin J Cell Mol Immunol)2013，29(3)
表 1 双氢杨梅树皮素对 Lx-2 细胞增殖的影响
(x ± s，n = 4)
组别 A值 抑制率(%)
空白对照组 0． 51 ± 0． 01 —
6． 25 μg /mL秋水仙碱组 0． 36 ± 0． 03a 29． 97
200． 00 μg /mL双氢杨梅树皮素 0． 37 ± 0． 02b 28． 07
100． 00 μg /mL双氢杨梅树皮素 0． 45 ± 0． 05 12． 67
75． 00 μg /mL双氢杨梅树皮素 0． 48 ± 0． 03 6． 59
50． 00 μg /mL双氢杨梅树皮素 0． 48 ± 0． 03 5． 90
33． 00 μg /mL双氢杨梅树皮素 0． 49 ± 0． 02 4． 29
22． 00 μg /mL双氢杨梅树皮素 0． 50 ± 0． 02 2． 92
aP ＜ 0． 05，bP ＜ 0． 01 vs空白对照组．
2． 2 ELISA 法检测 Lx-2 细胞生成的Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型
胶原蛋白及细胞因子含量 双氢杨梅树皮素作用于
Lx-2 48 h后能减少Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白含量(表
2) ，其中50． 0、33． 0 μg /mL 使细胞生成的Ⅰ、Ⅲ型
胶原蛋白浓度明显低于空白对照组(P ＜ 0． 05，P ＜
0． 01) ，50． 0 μg /mL 作用下 Lx-2 细胞生成的Ⅳ型胶
原蛋白及 TGF-β1、PDGF 浓度明显低于空白对照组
(P ＜ 0． 05)。
表 2 双氢杨梅树皮素对 Lx-2 细胞生成的Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白含量的影响 (ng /mL，x ± s，n = 3)
组别 I型胶原蛋白 III型胶原蛋白 IV型胶原蛋白 TGF-β1 PDGF
空白对照 30． 07 ± 1． 42 49． 50 ± 1． 16 34． 31 ± 1． 96 12． 79 ± 1． 24 92． 54 ± 6． 12
6． 25 μg /mL秋水仙碱组 21． 37 ± 0． 99b 42． 61 ± 2． 38a 29． 04 ± 2． 34a 9． 78 ± 0． 79a 83． 57 ± 3． 83a
50． 00 μg /mL双氢杨梅树皮素 18． 93 ± 1． 22b 44． 63 ± 0． 72b 29． 73 ± 1． 49a 10． 13 ± 0． 58a 76． 66 ± 1． 99a
33． 00 μg /mL双氢杨梅树皮素 21． 50 ± 0． 73b 45． 85 ± 1． 41a 30． 29 ± 0． 83 10． 34 ± 0． 94 80． 69 ± 6． 08
22． 00 μg /mL双氢杨梅树皮素 26． 84 ± 2． 18 47． 37 ± 1． 64 30． 87 ± 0． 67 10． 91 ± 0． 29 81． 64 ± 6． 85
aP ＜ 0． 05，bP ＜ 0． 01 vs空白对照组．
3 讨论
不同病因导致肝纤维化的共同途径是 HSC 的活
化为肌纤维母细胞，并合成大量的 ECM在肝内大量
沉积［7 － 8］，其中胶原蛋白是 ECM 的主要成分，而肝
脏中尤以Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原含量较多［9］。而细胞因
子在 HSC的活化和肝纤维化的发生发展中起重要作
用。在诸多细胞因子中，TGF-β1 是最强的促 HSC纤
维生成细胞因子，它不但参与 HSC 活化表型的维
持，而且刺激活化的 HSC合成、分泌大量的 ECM及
ECM降解蛋白酶抑制剂，抑制 ECM降解蛋白酶的表
达，增加 ECM的沉积［10］。PDGF是 HSC最强的丝裂
原［11］，肝损伤引起 HSC 的 PDGF 自分泌增加和
PDGF受体上调，加快了 HSC 的增殖。目前的许多
关于蛇葡萄素抗肝纤维化的研究都是在大鼠及其
HSC上进行的，人与鼠具有不同的种属特异性，Lx-2
细胞株保留了人 HSC 的主要特征，是很好的研究模
型［12］。本实验结果显示，双氢杨梅树皮素在一定浓
度范围内可抑制 Lx-2 细胞增殖，33． 0，50． 0 μg /mL
可显著降低细胞生成的Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白浓度，而
50． 0 μg /mL可显著降低细胞生成的Ⅳ型胶原蛋白及
TGF-β1、PDGF浓度，并存在剂量依赖关系。目前抗
肝纤维化的药物和效果非常有限［13］，双氢杨梅树皮
素可能参与影响 HSC生成胶原蛋白及细胞因子而产
生抗肝纤维化作用，这为探索双氢杨梅树皮素抗肝
纤维化的应用提供了初步的实验支持。
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