全 文 ：蛇葡萄根提取物的含药血清对肝星状细胞凋亡及
基因 Bax/Bcl-2表达的影响
程红球 1 ,黄彩华 1 ,邱杰文1 ,张赤志 2 ,程科力 2
(1汕头大学医学院第二附属医院 ,汕头 515041;2湖北中医学院 ,武汉 430061)
　　[摘要 ] 　目的:研究中药蛇葡萄根提取物的含药血清对 HSC/T6凋亡及凋亡基因 Bax/Bcl-2表达的影
响 ,从细胞学和分子生物学水平探讨中药蛇葡萄根抗纤维化的作用机制 。方法:用流式细胞仪测定各体积分
数(5%, 10%和 20%)的含药血清对 HSC/T6作用后的 DNA含量 ,计算细胞凋亡率;用 SABC染色检测凋亡
基因 Bax和 Bcl-2的蛋白表达 。结果:含药血清体积分数为 5%, 10%和 20%的蛇葡萄根提取物对 HSC/T6
的凋亡率分别为 8.50%, 14.30%和 22.65%,均显著大于含生理氯化钠溶液的血清对照组(P<0.01);且均
上调 HSC/T6的促凋亡基因 Bax的蛋白表达 ,同时下调抗凋亡基因 Bcl-2的基因表达。结论:蛇葡萄根提取
物含药血清能诱导 HSC/T6的凋亡 ,上调促凋亡基因 Bax的表达 ,下调抗凋亡基因 Bcl-2的表达 。
[关键词 ] 　蛇葡萄根提取物;血清药理学;肝星状细胞;细胞凋亡;Bax/Bcl-2
[中图分类号 ] R285.5;R286.91　 [文献标识码 ] A　 [文章编号 ] 1003-3734(2008)04-0300-03
EffectsofRadixAmpelopsisSincaeextract-containingratserumon
apoptosisandexpressionofBax/Bcl-2 geneinhepaticstelatecels
CHENGHong-qiu1 , HUANGCai-hua1 , QIUJie-wen1 , ZHANGChi-zhi2 , CHENGKe-li2
(1 TheSecondAfiliatedHospitalofMedicalColegeofShantouUniversity, Shantou515041, China;
2HubeiColegeofTraditionalChineseMedicine, Wuhan430061, China)
[ Abstract] 　Objective:ToinvestigatetheefectofRadixAmpelopsisSincaeextract-containingratserumon
theapoptosisandexpressionofBax/Bcl-2geneinculturedHSC/T6 cels, thehepaticstelatecelline, anditspos-
sibleantifibroticmechanismatcelularandmolecularlevels.Methods:Flowcytometrywasusedtodetectthecon-
tentsofDNAinHSC/T6 cels, andSABCwasusedtodetecttheexpresionofBax/Bcl-2gene.Results:Theap-
optoticrateswere8.50%, 14.30% and22.65%aftertreatmentwith5%, 10% and20%RadixAmpelopsisSin-
caeextract-containingratserum, whichweremorethanthosetreatedwithcontrolserum(P<0.01).Thegeneex-
pressionofBaxwasup-regulatedandthatofBcl-2wasdown-regulatedaftertreatmentwiththeextract-containingrat
serum.Conclusion:RadixAmpelopsisSincaeextract-containingratseruminducesapoptosis, up-regulatestheex-
pressionofBaxgeneanddown-regulatesthatofBcl-2 geneinHSC/T6 cels.
[ Keywords] 　RadixAmpelopsisSincaeextract;serumpharmacology;hepaticstelatecel;apoptosis;
Bax/Bcl-2
　　肝纤维化实质上是细胞外间质 (ECM)的过度
沉积 ,激活的肝星状细胞(hepaticstelatecel, HSC)
是肝纤维化时 ECM的主要细胞来源;肝纤维化恢复
期时激活状态的 HSC减少 ,主要受凋亡机制 ,而不
是表型转化的影响 [ 1] 。大量实验已证明 HSC凋亡
的细胞环节包括一些关键因子 , 例如死亡受体 ,
Fas/FasL, P53 , Caspases和 Bax/Bcl-2家族 ,在体情况
下 ,凋亡可以代表调节肝纤维化发生的中心环节。
对肝纤维化的防治 ,目前还缺乏理想的西药 ,中
药蛇葡萄根提取物具有清热解毒 ,活血化淤 ,祛风除
湿的功效 ,是我国民间广泛应用于抗炎抗菌的中草
药 ,我们的前期研究表明蛇葡萄根提取物有肯定的
抗 DHBV或清除 DHBV的作用[ 2] ,对 D-氨基半乳糖
(D-GalN)所致大鼠急性肝损伤有防护作用 [ 3] ,对刀
豆蛋白 A(ConA)诱导小鼠肝细胞的凋亡和坏死有
明显的防护作用[ 4] ,对 HSC的增殖有明显的抑制作
用[ 5] 。本实验利用血清药理学 ,从 HSC/T6的凋亡
及凋亡基因角度来研究蛇葡萄根提取物抗肝纤维化
—300—
　ChineseJournalofNewDrugs2008, Vol.17No.4 中国新药杂志 2008年第 17卷第 4期　
的作用机制 。
材料与方法
　材料 、实验动物 、细胞和药物
DMEM(高糖与低糖比例为 1∶1)及小牛血清
(Lot.NO.106124)为 GIBCO公司产品 ,碘化丙啶购
自美国 Sigma公司 , Tritonx-100为上海化学试剂公
司分装产品 , Bax、Bcl-2单抗 、免疫组织化学试剂盒
(SABC)、DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物
工程公司。
正常 Sprague-Dauley(SD)大鼠 18只 ,清洁级 ,
雌雄各半 ,体重 350 ～ 450g,购自湖北医药工业研究
院 ,动物合格证号:20010322。 HSC/T6 为 SV40转
染的 SD大鼠的肝星状细胞 , 其表现为活化的
HSC[ 6] ,由 Friedman教授惠赠上海中医药大学肝病
研究所徐列明教授 ,上海中医药大学肝病研究所培
养 、惠赠汕头大学医学院第二附院 (我院),我院自
行培养 、传代 。
蛇葡萄根流浸膏 ,由湖北中医学院中药系教研
室程科力教授惠赠 , 1g浸膏相当于 6.66g生药 。秋
水仙碱 , 由上海化学试剂站进口分装 , 批号为
950516,使用时用蒸馏水溶解 。
　方法
2.1　药物血清的制备　给正常 SD大鼠分别灌服
中药蛇葡萄根流浸膏 15 g、生理氯化钠溶液(NS)、
秋水仙碱 10mg, bid,连续 3d,末次给药后 1h采血 ,
并离心后取血清 ,于 56℃灭活 30 min,灭菌血清用
DMEM配制成体积分数分别为 5%, 10%, 20%的含
药血清(即 100mLDMEM中含有灭菌血清 5, 10和
20mL),分装 、冻存。
2.2　HSC/T6的培养和传代 　HSC/T6在含 10%
小牛血清的 DMEM, 5%CO2 , 95%的潮湿空气 , 37℃
的培养箱中培养 ,在倒置显微镜下视细胞长到亚单
层或细胞密度约 80% ～ 90%时是 HSC/T6传代的标
志 ,用胰蛋白酶(Trysin)消化细胞 ,调整细胞浓度为
(1 ～ 2)×105个·mL-1进行传代 。
2.3　流式细胞仪检测细胞凋亡　取对数生长期细
胞 ,用胰蛋白酶消化 ,制备细胞悬液 ,调整浓度为1×
10
5个·mL-1 ,接种于培养瓶中 ,培养 24h后 ,分别加
入各组不同体积分数的药物血清 , 继续培养 48h
后 ,用胰蛋白酶消化 ,收集细胞 ,用 4℃和 70%的冷
乙醇固定 , 放入 -4 ℃冰箱中保存。固定细胞经
PBS洗涤 2次 ,加入碘化丙啶染液(30 mg·L-1碘化
丙啶 , 0.1%Tritonx-100, 37 mg·L-1 EDTA, 0.1%
RnaseA)室温下进行 DNA染色 (20 min), 样品于
4℃避光保存 , 24h上流式细胞仪(华中科技大学附
属同济医院医学分子实验中心)测定 ,经流式细胞
仪对各组各浓度药物血清对 HSC/T6凋亡进行定量
检测 ,亚 G1期为凋亡细胞 ,计算细胞凋亡率。
2.4　SABC染色检测 Bax/Bcl-2的蛋白表达 　取
长满培养瓶的细胞 ,用胰蛋白酶消化 ,经过离心后 ,
加含 10%小牛血清的 DMEM培养液 ,制备成细胞悬
液 ,调整细胞浓度为(1 ～ 2)×105个·mL-1 ,接种于
24孔板 ,每孔 1mL,于 37℃和 5%CO2培养箱内培
养 24h后 ,吸出培养基 ,加入药物血清(受试物组分
别加入体积分数为 5%, 10%, 20%的给予蛇葡萄根提
取物的大鼠血清 、阳性对照组分别加入体积分数为
5%, 10%, 20%的给予秋水仙碱的大鼠血清 ,正常对
照组分别加入体积分数为 5%, 10%, 20%的给予 NS
的大鼠血清),以上各组均平行 12孔 ,继续培养 48h
后 ,取出爬满细胞的玻片 ,用 PBS漂洗 2遍 ,经 4%多
聚甲醛固定 30min, PBS洗涤后自然风干 , -20℃保
存备用。检测方法严格按照试剂盒说明书进行操
作 ,胞浆和或胞膜被染成棕褐色为 Bax/Bcl-2表达
阳性细胞 。
2.5　统计学方法　采用 SPSS11.5软件进行分析。
结　　果
1　蛇葡萄根提取物药物血清对 HSC/T6凋亡的
影响
与 NS组比较 , 蛇葡萄根提取物含药血清组
(5%, 10%, 20%)和秋水仙碱含药血清组(10%)
的 HSC/T6凋亡率均显著增加 ,差异均有统计学意
义(P<0.01),而且蛇葡萄根提取物含药血清呈现
浓度依赖性的促凋亡作用。体积分数为 10%的蛇
葡萄根提取物含药血清组的凋亡率与同体积分数
的秋水仙碱含药血清组相近(P>0.05)。结果见
表 1。
表 1　蛇葡萄根提取物含药血清对 HSC/T6
凋亡的影响
组　别 含药血清体积分数 /% n HSC/T6凋亡率 /%
NS 10 3 5.13±1.78
秋水仙碱 10 3 16.18±1.68a
蛇葡萄根 5 3 8.50±0.98a
蛇葡萄根 10 3 14.30±0.66ab
蛇葡萄根 20 3 22.65±2.20abc
　　与NS组比较 , a:P<0.01;与蛇葡萄根 5%组比较 , b:P<0.01;与蛇葡萄
根 10%组比较 , c:P<0.01
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2　蛇葡萄根提取物含药血清对凋亡基因 Bax/Bcl-2
表达(阳性率)的影响
蛇葡萄根提取物含药血清组(5%, 10%, 20%)
明显能上调 HSC/T6促凋亡基因 Bax的表达 ,下调
HSC/T6抗凋亡基因 Bcl-2的表达 ,与 NS组相比 ,差
异均有统计学意义(P<0.05),但与同体积分数的
秋水仙碱含药血清组相比 ,差异无统计学意义(P>
0.05)。结果见表 2。
表 2　蛇葡萄根提取物含药血清对凋亡基因 Bax/Bcl-2表达(阳性率)的影响
组　别 n Bax表达(阳性率) Bcl-2表达(阳性率)
5% 10% 20% 5% 10% 20%
NS 4 0.134±0.005 0.135±0.006 0.136±0.006 0.145±0.010 0.147±0.007 0.148±0.007
秋水仙碱 4 0.145±0.007 0.148±0.008 0.152±0.010 0.138±0.013 0.122±0.008 0.124±0.009
蛇葡萄根 4 0.150±0.007a 0.154±0.008a 0.154±0.010a 0.143±0.013 0.131±0.011a 0.122±0.010a
　　与 NS组比较 , a:P<0.05
讨　　论
本实验结果发现 , 体积分数为 5%, 10%和
20%的蛇葡萄根提取物含药血清均有明显的促进
HSC/T6的凋亡的作用(P<0.05),并且存在量效关
系 ,说明中药蛇葡萄根提取物可通过促进活化的
HSC的凋亡来达到抗纤维化的目的 。 Gong等[ 7]实
验表明 , HSC与 MFB对 Fas诱导的凋亡的不同表达
是由于二者 Bcl基因家族的表达不同 ,静止的 HSC强
烈表达抗凋亡基因 Bcl-2和 Bcl-xL,而活化的 HSC的
Bcl-2和 Bcl-xL表达明显下降 ,且促凋亡基因 Bax的
表达增加 , (Bcl-2+Bcl-xL)/Bax比值下降 ,从而引起
Fas诱导的凋亡发生。本实验结果发现蛇葡萄根提取
物的药物血清使 Bcl-2/Bax比值明显下降 ,说明了中
药蛇葡萄根提取物可通过下调抗凋亡基因 Bcl-2和上
调促凋亡基因 Bax的表达来促进 HSC的凋亡。
[作者简介 ] 　程红球(1976-),男 ,主治医师, 硕士研究生 ,主
要从事肝炎与肝纤维化的临床研究。联系电话:13556340602,
E-mail:chenghongqiu@sohu.com。
[ 　参　考　文　献　]
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