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Effects of Xueshuantong injection on platelet aggregation in rabbits in vitro

注射用血栓通体外对家兔血小板聚集的影响



全 文 :中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 18 期 2014 年 9 月 ·2669·

注射用血栓通体外对家兔血小板聚集的影响
王炎炎,朱慧超,李来来,肖 扬,王 怡*
天津中医药大学,天津 300193
摘 要:目的 研究注射用血栓通(冻干,主要成分为三七总皂苷,质量分数为 95%)体外对二磷酸腺苷(ADP)、花生四
烯酸(AA)、血小板活化因子(PAF)诱导家兔血小板聚集的影响。方法 采用 Born 法,检测 ADP、AA、PAF 诱导的家兔
血小板聚集率。结果 与对照组比较,注射用血栓通 7.2、14.4 mg/mL 组能显著抑制 ADP、AA、PAF 诱导的兔血小板聚集
率(P<0.01),注射用血栓通 3.6 mg/mL 组能显著抑制 ADP 诱导的兔血小板聚集率(P<0.01)。结论 注射用血栓通具有
体外抑制家兔血小板聚集的作用。
关键词:注射用血栓通;血小板聚集;三七总皂苷;花生四烯酸;血小板活化因子
中图分类号:R285.5 文献标志码:A 文章编号:0253 - 2670(2014)18 - 2669 - 04
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.18.018
Effects of Xueshuantong injection on platelet aggregation in rabbits in vitro
WANG Yan-yan, ZHU Hui-chao, LI Lai-lai, XIAO Yang, WANG Yi
Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China
Abstract: Objective To study the effects of Xueshuantong injection (lyophilized, main component of Panax Notoginsenosidum, total
content of 95%) on platelet aggregation induced by adenosine diphosphate (ADP), arachidonic acid (AA), and platelet-activating factor
(PAF) in rabbits. Methods Using the Born method, the platelet aggregation induced by ADP, AA, and PAF was detected. Results
Compared with the control group, Xueshuantong injection (7.2 and 14.4 mg/mL) could significantly inhibit the platelet aggregation
rate induced by ADP, AA, and PAF (P < 0.01), Xueshuantong injection (3.6 mg/mL) could significantly inhibit the platelet aggregation
rate induced by ADP (P < 0.01). Conclusion Xueshuantong injection could inhibit the in vitro platelet aggregation of rabbits.
Key words: Xueshuantong injection; platelet aggregation; total saponins of Panax notoginseng; arachidonic acid; platelet-activating factor

心脑血管疾病包括缺血性冠状动脉粥样硬化性
心脏病(冠心病)、脑卒中和周围血管病,是导致人
类死亡的主要病因。血栓形成是心、脑血管疾病的
病理基础,而血小板激活和聚集在其形成过程中起
核心作用[1]。抗血小板聚集药物具有抑制血小板的黏
附、聚集和释放功能,因此抗血小板治疗有助于减
少心、脑血管不良事件的发生[2]。血小板活化主要有
二磷酸腺苷(ADP)、花生四烯酸(AA)和血小板
活化因子(PAF)3 条途径[3]。抗血小板聚集药物主
要包括血栓烷 A2(TXA2)抑制药(阿司匹林)、ADP
受体拮抗药(氯吡格雷)、磷酸二酯酶抑制药(双嘧
达莫)、糖蛋白 IIb/IIIa 受体抑制药和其他抗血小板药
物[4-5]。抗血小板药物种类繁多,但均存在着不同程
度的毒副作用(胃肠道刺激、联合用药出血风险等)
并且部分患者对于阿司匹林等药物存在着用药抵抗
等。三七是五加科三七 Panax notoginseng (Burk.) f.
H. Chen 的根[6],其性温味甘,微苦,主入肝、胃经,
具有化瘀止血、活血定痛的功能[7]。三七总皂苷(total
saponins of Panax notoginseng,PNS)为三七主要成
分,是决定三七药效的最重要的活性成分[8]。PNS
具有扩张血管、降低心肌耗氧量、抑制血小板凝集、
延长凝血时间、调血脂、清除自由基、抗炎、抗氧
化等药理作用[9-14]。因此,本实验旨在研究注射用血
栓通(冻干,主要成分为 PNS,质量分数为 95%)
对 ADP、AA 和 PAF 诱导家兔血小板聚集的影响,
为注射用血栓通临床应用提供理论依据。

收稿日期:2014-04-14
基金项目:“重大新药创制”科技重大专项项目(2012ZX 09102201-007);广西科学研究与技术开发计划(14125008-2-5)
作者简介:王炎炎(1983—),女,博士,研究方向为中药心血管药理。Tel: (022)59596163
*通信作者 王 怡,女,博士,研究员,博士生导师,主要从事中药心血管药理研究。Tel: (022)59596572 E-mail: vip_wangyi@126.com
·2670· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 18 期 2014 年 9 月

1 材料与方法
1.1 药物及配制
注射用血栓通(冻干,以下简称血栓通),其
含 PNS 95%,规格 150 mg/瓶,广西梧州制药(集
团)股份有限公司,批号 11010911,使用前氯化钠
注射液稀释。阳性对照药阿司匹林,规格 100 g,
Sigma 公司,批号 A5376,使用前用氯化钠注射液
溶解,配成 0.65 mg/mL,4 ℃保存备用。
1.2 血小板聚集诱导剂
二磷酸腺苷二钠盐,美国CHRONO-LOG公司,
批号 3407,规格 2.5 mg,−20 ℃保存备用。花生四
烯酸钠盐,美国 CHRONO-LOG 公司,批号 4193,
规格 10 mg,−20 ℃保存。牛白蛋白 100 mg,美国
Sigma 公司,4 ℃保存。PAF,RBI 公司,批号 P-260,
−20 ℃冰箱保存。
1.3 试剂
枸橼酸钠购于天津市北方化玻采购销售中心;
盐酸利多卡因注射液购于湖北天药药业股份有限
公司,批号 H12021000;氯化钠注射液购于山东齐
都药业有限公司。
1.4 主要仪器
570—VS 血小板聚集仪,美国 CHRONO-LOG
公司;MIKRO 220R 低温高速自动离心机,德国海
蒂诗(Hettich)。
1.5 实验动物
健康大耳白家兔,雌雄各半,体质量 2.0~2.6
kg,许可证号 SCXK(京)2007-0003,普通级别,
饲养于天津中医药大学实验动物中心,温度 19~
25 ℃,相对湿度 40%~60%。
1.6 方法
1.6.1 样本采集 取血前 1 d 晚上 8 点开始禁食不
禁水,取血前用 3.8%枸橼酸钠润洗注射器,于家兔
清醒状态下,采用利多卡因颈部局部麻醉,颈总动
脉取血。血液以 3.8%枸橼酸钠溶液抗凝(9∶1),
缓慢颠倒试管混匀。
1.6.2 血浆处理 血液 1 000 r/min 离心 12 min,取
上清部分得富血小板血浆(PRP),剩余部分 3 000
r/min 离心 10 min,取上清部分得贫血小板血浆
(PPP)。用全自动血细胞分析仪计数血小板,用 PPP
调 PRP,使血小板计数为 3.0×109~5.0×109 个/L。
1.6.3 血小板聚集曲线的描记 用 570—VS 血小
板聚集仪测定血小板聚集率。按照 Born 氏比浊法,
将加入 250 μL检测标本的 PPP 反应杯放于 PPP 孔,
加入 250 μL 检测标本的 PRP 反应杯放于 PRP 孔,
温育 5 min,对照组加入生理盐水 20 μL,阳性对照
组加入阿司匹林 20 μL(终质量浓度 0.4 mg/mL),
实验组加入血栓通(终质量浓度 1.8、3.6、7.2、14.4
mg/mL),温育 5 min,荧光基线稳定在 100/0 的位
置。每个比色杯分别加入 ADP、AA、PAF 3 μL,
测定开始,6 min 后停止。根据仪器描记出来的聚
集曲线计算聚集率、斜率、聚集延迟时间,分析药
物对血小板聚集的影响,并计算聚集抑制率。
聚集抑制率= (对照组聚集率-给药组聚集率) / 对照
组聚集率
1.7 统计方法
数据以 ±x s 表示,采用 SPSS 11.0 软件包进行
统计学处理,组间比较采用单因素方差分析
(One-way ANOVA)。
2 结果
2.1 体外对 ADP 诱导的正常家兔血小板聚集的影响
2.1.1 对 ADP 诱导的正常家兔血小板聚集率的影
响 血栓通对 ADP 诱导的正常家兔血小板聚集均
有抑制作用,其中血栓通 1.8 mg/mL 抑制作用显著
(P<0.05),血栓通 3.6~14.4 mg/mL 抑制作用非常
显著(P<0.01),见表 1。
2.1.2 对 ADP 诱导的正常家兔血小板聚集曲线斜
率的影响 血栓通对 ADP 诱导的正常家兔血小板
聚集曲线斜率均有降低作用,其中血栓通 1.8
mg/mL 降低作用明显(P<0.05),血栓通 3.6~14.4
mg/mL 降低作用非常显著(P<0.01),见表 1。
2.1.3 对 ADP 诱导的正常家兔血小板聚集延迟时
间的影响 血栓通对 ADP 诱导的正常家兔血小板
聚集有延迟作用,其中血栓通 1.8 mg/mL 能明显延
迟血小板聚集(P<0.05),血栓通 3.6~14.4 mg/mL
能非常显著延迟血小板聚集(P<0.01),见表 1。
2.2 体外对 AA 诱导的正常家兔血小板聚集的影响
2.2.1 对 AA 诱导的正常家兔血小板聚集率的影响
血栓通对 AA 诱导的正常家兔血小板聚集均有抑制
作用,其中血栓通 3.6 mg/mL 抑制作用明显(P<
0.05),血栓通 7.2~14.4 mg/mL 抑制作用非常显著
(P<0.01),见表 2。
2.2.2 对 AA 诱导的正常家兔血小板聚集曲线斜
率的影响 血栓通对 AA 诱导的正常家兔血小板
聚集曲线斜率有降低作用,其中血栓通 3.6~14.4
mg/mL 能显著降低血小板聚集曲线斜率(P<
0.01),见表 2。
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 18 期 2014 年 9 月 ·2671·

表 1 血栓通体外对 ADP 诱导的正常家兔血小板聚集的影响 ( ± = 14x s , n )
Table 1 Effect of Xueshuantong injection on ADP induced-platelet aggregation of rabbits in vitro ( ± = 14x s , n )
组别 ρ / (mg·mL−1) 聚集率 / % 聚集抑制率 / % 聚集曲线斜率 / % 延迟时间 / s
对照 — 49.36±6.26 — 88.70±10.94 18.60±2.88
血栓通 1.8 43.86±7.32* 11.14 80.40± 5.38* 21.90±3.73*
3.6 41.64±5.87** 15.63 77.00± 4.67** 22.70±3.47**
7.2 37.25±7.81** 24.53 69.90±13.76** 25.20±4.26**
14.4 25.93±7.01** 47.47 50.60± 9.22** 31.30±5.76**
阿司匹林 0.4 44.29±6.32* 10.27 80.20± 6.23* 24.80±4.21*
与对照组比较:*P<0.05 **P<0.01,下同
*P < 0.05 **P < 0.01 vs control group, same as below
表 2 血栓通体外对 AA 诱导的正常家兔血小板聚集的影响 ( ± = 14x s , n )
Table 2 Effect of Xueshuantong injection on AA induced-platelet aggregation of rabbits in vitro ( ± = 14x s , n )
组别 ρ / (mg·mL−1) 聚集率 / % 聚集抑制率 / % 聚集曲线斜率 / % 延迟时间 / s
对照 — 56.37±5.41 — 85.70± 5.74 22.00±3.59
血栓通 1.8 52.93±9.17 6.10 81.60± 9.07 26.40±4.60*
3.6 51.07±6.44* 9.40 74.30± 8.92** 28.90±4.18**
7.2 49.86±5.24** 11.54 67.10± 9.18** 32.30±4.32**
14.4 43.35±6.86** 23.10 53.40±12.76** 40.50±5.83**
阿司匹林 0.4 42.86±8.50** 23.97 60.50± 8.98** 27.10±3.00**

2.2.3 对 AA 诱导的正常家兔血小板聚集延迟时间
的影响 血栓通对 AA 诱导的正常家兔血小板聚集
有延迟作用,其中血栓通 1.8 mg/mL 能明显延迟血
小板聚集(P<0.05),血栓通 3.6~14.4 mg/mL 能
显著延迟血小板聚集(P<0.01),见表 2。
2.3 体外对 PAF 诱导的正常家兔血小板聚集的
影响
2.3.1 对 PAF 诱导的正常家兔血小板聚集率的影
响 血栓通对 PAF 诱导的正常家兔血小板聚集都
有抑制作用,其中血栓通 7.2~14.4 mg/mL 抑制作
用非常显著(P<0.01),见表 3。
2.3.2 对 PAF 诱导的正常家兔血小板聚集曲线斜
率的影响 血栓通对 PAF 诱导的正常家兔血小板
聚集曲线斜率均有降低作用,其中血栓通 7.2
mg/mL能明显降低血小板聚集曲线斜率(P<0.05);
血栓通 14.4 mg/mL 能显著降低血小板聚集率曲线
斜率(P<0.01),见表 3。
2.3.3 对 PAF 诱导的正常家兔血小板聚集延迟时
间的影响 血栓通对 PAF 诱导的正常家兔血小板
聚集有延迟作用,其中血栓通 1.8 mg/mL 能明显延
迟血小板聚集(P<0.05),血栓通 3.6~14.4 mg/mL
能显著延迟血小板聚集(P<0.01),见表 3。
表 3 血栓通对 PAF 诱导的正常家兔血小板聚集的影响 ( ± = 14x s , n )
Table 3 Effect of Xueshuantong injection on PAF induced-platelet aggregation of rabbits in vitro ( ± = 14x s , n )
组别 ρ / (mg·mL−1) 聚集率 / % 聚集抑制率 / % 聚集曲线斜率 / % 延迟时间 / s
对照 — 63.54±6.69 — 112.80±17.96 13.90±4.77
血栓通 1.8 62.93±9.13 0.96 109.60±14.13 16.40±3.62*
3.6 60.79±8.53 4.33 103.80±15.05 19.80±3.85**
7.2 54.92±6.87** 13.56 93.50±18.57* 21.40±6.59**
14.4 48.29±6.64** 24.00 85.40±15.16** 26.70±5.85**
阿司匹林 0.4 57.24±7.71* 9.91 95.20±15.48** 20.90±3.75**
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3 讨论
冠状动脉综合征等血栓栓塞性疾病的发病率
逐年增加。由于血小板聚集在血栓形成中发挥着关
键作用[15],因此抗血小板聚集治疗在防治血栓栓塞
性疾病中具有重要的意义。血小板活化主要有
ADP、AA 和 PAF 3 条途径。其中 ADP 途径降低血
小板中 CAMP 的水平[16],并能刺激血小板颗粒释
放分泌 TXA2[17],激活纤维蛋白原受体,诱发血小
板的聚集。AA 则是一种中等强度的血小板聚集诱
导剂,主要是通过环加氧酶的作用,经血小板中
TXA2 合成酶的催化转变为 TXA2,促进颗粒释放
ADP、5-羟色胺(5-HT)等,进一步增强血小板聚
集[18]。PAF 是迄今所知作用最强的血小板活化剂,
PAF诱导血小板聚集和释放的作用不依赖于环加氧
酶催化的 AA 代谢途径和 ADP 释放。本实验针对
血小板聚集时的不同通路,分别选择了 ADP、AA、
PAF 为诱导剂。
活血化瘀中药在临床应用广泛,研究表明中药
有效成分对抗血小板功能异常,在抑制或延缓血栓
形成过程中发挥重要作用。随着中药现代化进程的
加快,中药有效成分防治缺血性心脑血管疾病日益
受到关注,对中药的抗血小板聚集作用的研究是现
代中药研究的一个重要趋势。三七为五加科人参属
植物三七的干燥根,具有止血不留瘀、活血不出血
的功效。PNS 为三七主要成分,具有扩张血管、降
低心肌耗氧量、抑制血小板凝集、延长凝血时间、
降血脂、清除自由基、抗炎、抗氧化等药理作用[9-14]。
本实验对以 PNS 为主要成分的血栓通进行体
外抗血小板聚集活性考察,实验结果表明,血栓通
对 3 种诱导剂诱导的血小板聚集均有抑制作用,其
中对 AA、PAF 引起的血小板聚集抑制作用相当,
而对ADP诱导的血小板聚集的抑制作用强于其他2
个模型。本实验结果表明注射用血栓通(冻干)体
外可以不同程度抑制 ADP、AA、PAF 诱导的家兔
血小板聚集。
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