全 文 ：·1326· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 9 期 2015 年 5 月

• 药理与临床 •
川芎、黄芪有效成分配伍对缺氧脑微血管内皮细胞的影响
杨 珍，周惠芬，周 鹏，杨洁红，万海同，管敏国，张宇燕*
浙江中医药大学，浙江 杭州 310053
摘 要：目的 观察黄芪、川芎中的有效成分黄芪甲苷、川芎嗪、阿魏酸、毛蕊异黄酮、藁本内酯的正交组合配伍对 SD 乳
鼠脑微血管内皮细胞（rBMVECs）缺氧损伤的保护作用，并找出较优组合。方法 rBMVECs 原代传代培养，并建立缺氧模
型，4 h 后观察细胞形态，MTT 法测定各成分的最大耐药质量浓度，以 L18(35) 正交表设计安排成分配伍给药，采用黄嘌呤
氧化酶显色法检测细胞超氧化物歧化酶（SOD）活性，流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期，RT-PCR 法测定 caspase-3
与 caspase-8 基因在细胞中的表达。采用极差分析法分析正交试验结果。结果 药物正交配伍组合可显著改善缺氧 rBMVECs
的形态，有效增强 SOD 活性，有效抑制缺氧诱导的 rBMVECs 发生 G1/S 期阻滞，明显减少了细胞的凋亡，减弱细胞中 caspase-3
和 caspase-8 基因表达。正交试验结果分析显示其较优组合为藁本内酯 5 μg/mL、川芎嗪 10 μg/mL、阿魏酸 20 μg/mL、毛蕊
异黄酮 10 μg/mL、黄芪甲苷 10 μg/mL。结论 黄芪、川芎有效成分组合配伍对内皮细胞缺氧损伤有明显的保护作用。
关键词：黄芪；川芎；脑微血管内皮细胞；缺氧；超氧化物歧化酶；细胞凋亡
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2015)09 - 1326 - 07
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.09.013
Effects of compatibility of main components from Chuanxiong Rhizoma and
Astragali Radix on hypoxia damaged brain microvascular endothelial cells
YANG Zhen, ZHOU Hui-fen, ZHOU Peng, YANG Jie-hong, WAN Hai-tong, GUAN Min-guo, ZHANG Yu-yan
Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China
Abstract: Objective To observe the protective effect of orthogonal compatibility of astragaloside IV (A), ligustrazine (B), ferulic acid (C),
calycosin (D), and ligustilide (E), the main components from Chuanxiong Rhizoma and Astragali Radix, on the brain micro vascular
endothelial cells (rBMVECs) of SD neonatal rat damaged by hypoxia, and find out an optimized combination. Methods To prepare the
normal primary rBMVECs from SD rats, to establish the hypoxia model, and to observe cellular morphology after 4 h; The maximum
concentration of drug resistance was determined by MTT method. The compatibility of components was arranged by L18 (35) orthogonal
design; The levels superoxide dismutase (SOD) was tested as kits instruction, the cells apoptosis rates and DNA stages were assayed with
flow cytometry, and the expressions of caspase-3 and caspase-8 in cells were tested by using the method of real-time polymerase chain
reaction (RT-PCR). Analyze the results of orthogonal test by using range analysis method. Results The orthogonal compatibility of
reagents could play an significant roles against the hypoxia damage of rBMVECs, improve the cellular morphology obviously, enhance the
activity of SOD, reduce the apoptosis of cells apparently, restrain the retardant of G1/S stage induced by hypoxia effectively, and decrease the
expression of caspase-3 and caspase-8 in cells. The analysis of test results shows that the combination with ligustilide 5 μg/mL, ligustrazine
10 μg/mL, ferulic acid 20 g/mL, calycosin 10 μg/mL, and astragaloside 10 μg/mL is the superior one. Conclusion The protective effect of
the compatibility with the main components from Chuanxiong Rhizoma and Astragali Radix on hypoxia-damaged rBMVECs is obvious.
Key words: Astragali Radix; Chuanxiong Rhizoma; brain microvascular endothelial cells; hypoxia; superoxide dismutase; cell apoptosis

近年来，随着人们生活水平的提高及饮食结构
的变化，缺血性脑卒中的发生率呈现逐年增加的趋
势，严重影响了患者的生活质量。脑微血管内皮细
胞（rBMVECs）是毛细血管微循环中的一种特殊细

收稿日期：2014-09-29
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81202636，81274176，81374053）；浙江省自然科学基金资助项目（LR12H27001）；浙江省中医药（中
西医结合）重点学科（2012-XK-A06）
作者简介：杨 珍（1988—），女，研究方向为方剂学配伍规律研究。E-mail: holly8808@163.com
*通信作者 张宇燕 Tel: (0571)86613716 E-mail: yannoo7376@sina.com
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胞，在脑内分布广泛，地位特殊，功能复杂，在刺
激因素作用下参与多种神经系统疾病特别是脑血
管疾病的病理生理过程[1-2]。黄芪、川芎单味药对脑
缺血保护作用的研究多有报道[3-5]，但对于二者配伍
后的研究报道甚少。黄芪甲苷、毛蕊异黄酮为黄芪
的主要活性成分，川芎嗪、阿魏酸、藁本内酯为川
芎的主要活性成分，因此本实验采用原代培养的乳
鼠 rBMVECs，建立缺氧损伤模型，从细胞水平上
探讨黄芪、川芎主要活性成分配伍对缺氧所致
rBMVECs 损伤的保护作用及其机制。
1 材料
1.1 药品与试剂
黄芪甲苷（批号 20120420）、毛蕊异黄酮（批
号 20130219）、川芎嗪（批号 20100611）、阿魏酸
（批号 20061103）、藁本内酯（批号 20130420），质
量分数均≥98%，天津马克生物技术有限公司；
M199 培养基、胎牛血清，Gibco 公司；D-Hank’s
液、II 型胶原酶、磷酸盐缓冲液（PBS）、胰蛋白酶，
北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；超氧化物歧
化酶（SOD）试剂盒，南京建成生物工程研究所；
FITC Annexin V 细胞凋亡检测试剂盒、PI/RNase
Staining 缓冲液试剂盒，BD 公司；SYBR Green I
试剂盒，RNA 提取试剂盒，Bio-Rad 公司。
1.2 动物
清洁级 SD 乳鼠 10 只，1～3 日龄，由浙江中
医药大学动物实验研究中心提供，许可证号 SCXK
（沪）2008-0016。
1.3 仪器
3111 型 CO2培养箱，Thermo Scientific 公司；
DMI4000B 荧光倒置显微镜，德国徕卡公司；
LDZ5-2 型低速自动平衡离心机，北京京立离心机
有限公司；TU-1900 双光束紫外可见分光光度计，
北京普析通用仪器有限责任公司；Thermo Scientific
VarioskanFlash 酶标仪、BD FACSCulibur 流式细胞
仪，美国 BD 公司；CFX 96 实时定量 PCR 仪，
Bio-Rad 公司；自制缺氧罐。
2 方法
2.1 rBMVECs 的原代、传代培养
取 10 只 SD 乳鼠，颈椎脱臼处死，消毒后在无
菌条件下取出大脑，置于含有冷的 D-Hank’s 液的培
养皿中，分离出较纯的大脑皮质，用 D-Hank’s 液漂
洗 3 次后将组织剪碎至 1 mm3并移入无菌 15 mL 离
心管中，加入适量的含乙二胺四乙酸（EDTA）的
0.25%的胰蛋白酶，于 37 ℃培养箱中消化 20 min；
加入完全培养基终止消化，吹打均匀后依次通过
80、200 目不锈钢筛滤过，收集 200 目的滤液，1 000
r/min 离心 10 min；去除上清液，沉淀加入适量的
0.1% II 型胶原酶并置于培养箱中消化，25 min 后
1 000 r/min 离心 10 min；沉淀加入适量 M199，漂
洗离心后将最终沉淀用 M199 完全培养基悬浮接种
到细胞培养瓶中，于 37 ℃、5% CO2培养箱中培养，
3 d 后换液，每 2 天换液 1 次，细胞长成“铺路石”
样的致密单层后，用 0.125%的胰蛋白酶消化传代培
养，并进行兔抗鼠 VIII 因子鉴定。将第 3 代的细胞
接种到 6 孔板中培养，细胞长成“铺路石”样的致
密单层后用于实验。
2.2 川芎、黄芪各活性成分的细胞毒性剂量测定
用 M199 完全培养基配制各单体药物，将第 3
代细胞接种到 96 孔板中长成致密单层后，依次加
入不同质量浓度的药物，采用 MTT 法[6]确定各单体
药物给药的高、中、低质量浓度。
2.3 分组、给药、造模
将 6 孔板中长成致密单层的细胞分成 20 组，对
照组、模型组、18 个给药组。弃去 6 孔板中的培养
基，用 PBS 洗 2 次后按组合浓度给药，对照组加入
完全培养基 1 mL，模型组加入无血清的 M199 1 mL，
给药组分别加入不同浓度组合的药物 1 mL。对照组
置于 37 ℃、5% CO2培养箱中培养 4 h，其他各组于
37 ℃自制密闭缺氧罐中持续通入 95% N2＋5% CO2
混合气体，5 min 后封口膜密封缺氧罐口，于 37 ℃
恒温箱中培养 4 h。倒置显微镜下观察各组细胞形态。
2.4 SOD 活性检测
按“2.3”项方法分组、给药及造模，培养 4 h
后取各组样品细胞，每组 6 个复孔，去除细胞培养
基，PBS 洗 2 次，用 0.125%胰蛋白酶消化后用超声
法破碎细胞，收集裂解液，按试剂盒说明书操作，
测定 SOD 活性。
2.5 流式细胞仪检测rBMVECs早期凋亡率及细胞周期
按“2.3”项方法分组、给药及造模，培养 4 h
后取各组样品，每组 3 个复孔，按试剂盒说明书加
缓冲液，用 FITC Annexin/PI 双染后，流式细胞仪
检测细胞早期凋亡率。
按“2.3”项方法分组、给药及造模，培养 4 h
后取样品，每组 3 个复孔，用冷的酒精培养 2 h，
缓冲液洗后离心，沉淀加入 PI 和染色缓冲液混匀，
置于 25 ℃避光处 15 min 后用流式细胞仪检测细
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胞周期。
2.6 caspase-3 和 caspase-8 基因表达测定
按“2.3”项方法分组、给药及造模，培养 4 h
后取各组样品，每组 3 个复孔，分别加入 1 mL
trizol，按说明书操作总 RNA 提取和逆转录，保存
于−70 ℃备用。实时荧光定量 PCR 检测：扩增产
物为 β-actin。反应程序为预变性 95 ℃、10 min，
然后 95 ℃、10 s，55 ℃、10 s，72 ℃、15 s，共
40 个循环；熔解曲线：65～95 ℃，扩增 0.5 ℃、
5 s。应用 Delta-delta C1 法进行 caspase-3 和
caspase-8 基因的表达分析。
2.7 统计学处理
数据用 SPSS 17.0 统计软件处理，用 ±x s 表
示，组间两两比较采用方差分析；采用一般线性模
型的 Univariate 程序进行正交试验结果的分析。
3 结果
3.1 形态学观察结果
原代细胞培养瓶中，分离、获得的微血管段形
态各异，在 37 ℃、5% CO2 培养箱中培养 3 d 后，
可见少量内皮细胞呈散在性生长，细胞呈长梭型或
多角形；培养 7～8 d 后，细胞长成“铺路石”样致
密单层铺满瓶底。其生长特点和形态与大多数文献
报道相似[7-8]，兔抗鼠 VIII 因子鉴定结果显示所培
养的细胞存在兔抗鼠 VIII 因子相关抗原，可鉴定培
养细胞为内皮细胞。
造模结束后，在倒置显微镜（×100）下观察细
胞形态，对照组 rBMVECs 呈梭形或多角形，形态饱
满，生长旺盛成铺路石状。模型组细胞轮廓不清，细
胞体积缩小，出现较多的凋亡与坏死细胞。给药各组
均能有效减轻缺氧对细胞形态的损伤。结果见图 1。


对照 模型 给药组（第 18 组）
图 1 rBMVECs 细胞形态学观察结果
Fig. 1 Cell morphological observation of rBMVECs
3.2 MTT 法确定各有效成分给药质量浓度及各组
成分配比情况
经 MTT 法测定川芎、黄芪各活性成分的细胞
毒性，选取细胞存活率在 80%以上的药物质量浓
度，具体各成分给药的质量浓度分别为黄芪甲苷
（A）：40、20、10 μg/mL，川芎嗪（B）：20、10、5
μg/mL，阿魏酸（C）：20、10、5 μg/mL，毛蕊异黄
酮（D）：20、10、5 μg/mL，藁本内酯（E）：10.0、
5.0、2.5 μg/mL。按照正交设计表 L18(35) 设计的药
物分组及各组成分配比情况见表 1。
3.3 各组细胞 SOD 活性比较
与对照组相比，模型组细胞 SOD 活性明显降
低（P＜0.01）；而各给药组 SOD 活性较模型组增加，
2、3、4、5、6、9、10、12、13、16、17、18 作用
较显著（P＜0.01）。结果见表 2。
3.4 各组细胞凋亡率及细胞周期比较
与对照组相比，模型组细胞早期凋亡率、G1
期细胞比例明显增高（P＜0.01），S、G2 期细胞比
例显著减少（P＜0.01），各给药组细胞较模型组细
表 1 18 个给药组成分配比情况
Table 1 Composition in 18 administration groups
ρ/(μg·mL−1)
组号
A B C D E
1 10（1） 5（1） 5（1） 5（1） 2.5（1）
2 10（1） 10（2） 10（2） 10（2） 5.0（2）
3 10（1） 20（3） 20（3） 20（3） 10.0（3）
4 20（2） 5（1） 5（1） 5（1） 2.5（1）
5 20（2） 10（2） 10（2） 20（3） 10.0（3）
6 20（2） 20（3） 20（3） 5（1） 2.5（1）
7 40（3） 5（1） 10（2） 5（1） 10.0（3）
8 40（3） 10（2） 20（3） 10（2） 2.5（1）
9 40（3） 20（3） 5（1） 20（3） 5.0（2）
10 10（1） 5（1） 20（3） 20（3） 5.0（2）
11 10（1） 10（2） 5（1） 5（1） 10.0（3）
12 10（1） 20（3） 10（2） 10（2） 2.5（1）
13 20（2） 5（1） 10（2） 20（3） 2.5（1）
14 20（2） 10（2） 20（3） 5（1） 5.0（2）
15 20（2） 20（3） 5（1） 10（2） 10.0（3）
16 40（3） 5（1） 20（3） 10（2） 10.0（3）
17 40（3） 10（2） 5（1） 20（3） 2.5（1）
18 40（3） 20（3） 10（2） 5（1） 5.0（2）
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表 2 各组细胞 SOD 活性 ( ± = 6x s , n )
Table 2 Activity of SOD in cells of each group ( ± = 6x s , n )
组号 SOD/(U·mg−1) 组号 SOD/(U·mg−1)
对照 65.17±6.64 9 57.29±7.59**
模型 22.82±2.10△△ 10 59.15±6.23**
1 24.61±1.20 11 38.55±0.14
2 59.91±6.66** 12 48.42±2.96**
3 58.18±7.69** 13 43.73±1.11**
4 59.74±5.21** 14 37.36±0.57
5 47.05±2.64** 15 36.69±1.39
6 50.87±1.25** 16 55.56±5.96**
7 36.32±2.21 17 53.93±4.99**
8 30.05±1.26 18 57.21±3.73**
与对照组比较：△△P＜0.01；与模型组比较：**P＜0.01，下同
△△P < 0.01 vs control group; **P < 0.01 vs model group, same as below
胞早期凋亡率、G1 期细胞比例明显下降，S 期细胞
比例明显增加。2、3、4、5、6、9、17、18 组细胞
凋亡率及细胞周期变化较模型组均显著（P＜0.01）。
结果见表 3。
3.5 各组细胞 caspase-3 和 caspase-8 基因表达
实时荧光定量 PCR 法 β-actin、caspase-3 和
caspase-8 基因的扩增曲线为“S”型，熔解曲线呈
单一峰，熔解温度分别为 87.0、83.5、85.0 ℃。用
Delta-delta C1 法对各基因表达水平进行相对定量
分析结果表明，模型组相对于对照组的 caspase-3
和 caspase-8 基因表达增加显著（P＜0.01），各给药
组细胞相对于模型组细胞 caspase-3 和 caspase-8
基因表达降低，4、5、8、10、11、12、13 组细
胞 caspase-3 和 caspase-8 基因表达下降较显著（P＜
0.01）。结果见表 4。
表 3 各组细胞早期凋亡率及细胞周期比较 ( ± = 3x s , n )
Table 3 Comparison on early apoptosis rates and condition of cell cycle of cells in each group ( ± = 3x s , n )
细胞周期比例/% 组号 细胞凋亡率/%
G1期 S 期 G2期
对照 4.18±2.98 75.62±1.41 16.63±2.14 7.75±0.96
模型 43.97±1.47△△ 84.33±5.98△△ 9.89±1.59△△ 5.78±1.07△△
1 39.17±2.77 79.59±6.23 13.01±1.82 7.40±2.43
2 20.42±4.12** 77.18±3.56** 15.83±2.67** 6.99±5.87
3 5.72±1.18** 79.04±2.43** 14.06±1.03** 6.90±2.52
4 10.65±3.67** 76.35±5.37** 16.42±0.54** 7.23±1.89
5 32.08±0.42** 78.46±1.91** 14.65±4.19** 6.89±0.77
6 30.73±1.10** 78.10±5.66** 14.88±2.57** 7.02±1.52
7 37.19±1.82 79.00±0.39** 14.54±1.04** 6.46±1.67
8 37.59±3.71 78.16±1.26** 15.05±0.93** 6.79±1.49
9 26.46±1.93** 77.46±2.83** 15.35±2.71** 7.19±2.69
10 25.03±2.11** 79.50±2.02 13.65±1.20 6.85±1.93
11 35.69±1.12 77.72±5.09** 15.01±1.51** 7.27±0.65
12 31.04±2.68** 79.35±1.55** 13.66±1.96 6.99±1.39
13 33.64±1.62 79.59±3.58 14.05±2.66 6.36±0.81
14 36.24±1.82 79.76±5.02 14.27±3.50** 5.97±2.57
15 36.46±1.54 79.86±3.84 13.79±2.88 6.35±1.44
16 28.74±1.53** 78.83±1.47** 13.97±1.75 7.20±2.09
17 29.76±2.36** 78.90±1.84** 14.30±5.18** 6.80±1.13
18 25.96±1.15** 79.16±3.61** 14.95±1.05** 5.89±1.43

3.6 正交试验结果极差分析
3.6.1 直观分析法 由表 5 可知，有效成分对 SOD
活性的影响按大小顺序排列为 E＞D＞B＞C＞A，较
优方案是 E2D3B3C2A3；对细胞凋亡率的影响按大小
顺序为 E＞D＞B＞A＞C，较优方案是 E2D3B3A1C3；
对 G1 期细胞比例的影响按大小顺序为 E＞D＞C＞
B＞A，较优方案是 E2D2C1B2A3；对 S 期细胞比例
的影响按大小顺序为 E＞B＞A＞D＞C，较优方案
·1330· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 9 期 2015 年 5 月

表 4 各组细胞 caspase-3 和 caspase-8 基因的表达分析 ( ± = 3x s , n )
Table 4 Analysis on gene expression of caspase-3 and caspase-8 of cells in each group ( ± = 3x s , n )
基因相对表达量 基因相对表达量 组号
caspase-3 caspase-8
组号
caspase-3 caspase-8
对照 1.00±0.63 1.00±1.11 9 1.02±0.26** 3.31±0.69
模型 9.84±1.10△△ 6.88±1.42△△ 10 1.73±0.63** 1.21±1.27**
1 4.30±1.31** 3.16±0.67 11 1.53±1.31** 1.45±0.68**
2 1.10±1.03** 3.44±1.14 12 1.19±0.66** 1.95±0.49**
3 1.14±0.96** 4.33±0.86 13 4.79±0.91** 1.19±1.64**
4 1.20±0.62** 1.34±1.11** 14 6.26±1.60 1.39±1.23**
5 2.37±1.25** 1.84±1.07** 15 5.61±1.83 3.23±0.49
6 1.68±1.74** 3.79±0.29 16 5.73±1.35 2.49±0.66**
7 1.43±0.92** 4.57±0.95 17 7.32±0.92 1.83±1.21**
8 1.08±1.43** 2.15±1.19** 18 6.89±0.43 1.76±0.93**

表 5 正交设计极差分析结果
Table 5 Orthogonal design and range analysis results
SOD/(U·mg−1) 细胞凋亡率/% G1期细胞比例/% S期细胞比例/% caspase-3 caspase-8 因素 水平
均值 极差 均值 极差 均值 极差 均值 极差 均值 极差 均值 极差
A 1 48.14 2.49 26.18 4.77 78.73 0.15 14.20 0.49 1.83 2.08 2.59 0.56
2 45.91 29.97 78.69 14.68 3.65 2.13
3 48.39 30.95 78.59 14.69 3.91 2.69
B 1 46.52 6.97 29.07 5.90 78.81 0.47 14.27 0.58 3.20 0.36 2.33 1.05
2 44.48 31.96 78.36 14.85 3.28 2.02
3 51.44 26.06 78.83 14.45 2.92 3.06
C 1 45.14 3.64 29.70 2.71 78.31 0.59 14.65 0.33 3.50 0.56 2.39 0.17
2 48.88 30.06 78.79 14.61 2.96 2.46
3 48.53 27.34 78.90 14.31 2.94 2.56
D 1 40.82 12.40 34.16 8.72 78.89 0.60 14.44 0.44 3.68 1.03 2.69 0.40
2 48.40 27.48 78.29 14.79 2.65 2.43
3 53.22 25.45 78.83 14.34 3.06 2.29
E 1 41.94 13.18 33.66 9.53 78.95 0.71 14.16 0.92 3.39 0.43 2.35 0.91
2 55.11 24.13 78.24 15.08 3.03 2.08
3 45.39 29.31 78.82 14.34 2.97 2.99
是 E2B2A3D2C1；对 caspase-3 基因表达的影响按大
小顺序为 A ＞ D ＞ C ＞ E ＞ B ，较优方案是
A1D2C3E3B3；对 caspase-8 基因表达的影响按大小
顺序为 B＞E＞A＞D＞C，较优方案是 B2E2A2D3C1。
3.6.2 综合平衡法 藁本内酯（E）对各指标的影
响：从表 5 看出，对 SOD、细胞凋亡率、G1 期细
胞比例、S 期细胞比例 4 个指标来讲，藁本内酯的
极差均最大，也就是说藁本内酯是影响最大的因
素，且以取 E2 水平为最好；对 caspase-3 和 caspase-8
来讲，藁本内酯的极差不是最大，但取 E2 水平也不
是太差。总的来说，对 7 个指标来讲，藁本内酯以
取 E2 水平为最好。
川芎嗪（B）对各指标的影响：从表 5 看出，对
SOD 和细胞凋亡率来说，取 B3水平为好。但是，对
caspase-8 和 S 期细胞比例来说，川芎嗪都是影响较
大的因素。对 6 个指标综合考虑，选取 B2为好。
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 9 期 2015 年 5 月 ·1331·

阿魏酸（C）对各指标的影响：从表 5 看出，
对 6 个指标来说，阿魏酸的极差都不是最大的，也
就是说阿魏酸不是影响最大的因素。对 G1 期细胞
比例和 caspase-3 来说，阿魏酸是影响较大的因素，
且对 caspase-8、S 期细胞比例和细胞凋亡率来说，
它的影响都是最小的。对 6 个指标综合考虑，阿魏
酸取 C3 水平为好。
毛蕊异黄酮（D）对各指标的影响：从表 5 看
出，对 G1 期细胞比例、S 期细胞比例和 caspase-3
表达来讲，毛蕊异黄酮取 D2 最好；对 SOD 活性、
细胞凋亡率和 caspase-8 来讲，毛蕊异黄酮取 D3最
好，D2 次之。对 7 个指标综合考虑，毛蕊异黄酮取
D2 水平为好。
黄芪甲苷（A）对各指标的影响：从表 5 看出，
对细胞凋亡率和 caspase-3 表达来说，黄芪甲苷都是
以取到 A1 水平为最好，且对 caspase-3 表达来说，
黄芪甲苷为影响最大的因素；对 SOD 活性、G1 期
细胞比例和 S 期细胞比例来讲，黄芪甲苷都不是影
响最大的因素；而且对 SOD 活性和 G1 期细胞比例
来讲，黄芪甲苷是最次要的影响因素，取 A1 水平
也不是太差。对 7 个指标综合考虑，黄芪甲苷取
A1 水平为好。
通过各因素对各指标影响的综合分析，得出较
好的试验方案是 E2B2C3D2A1，即藁本内酯 5 μg/mL、
川芎嗪 10 μg/mL、阿魏酸 20 μg/mL、毛蕊异黄酮
10 μg/mL、黄芪甲苷 10 μg/mL。
4 讨论
脑血管病的发病从病理学角度主要涉及血流
动力学、血液理化特性及血管壁完整性的改变，而
血管壁的结构破坏是脑血管病的基础，rBMVECs
的损伤是脑缺血损伤最直接的原因[9]。因此，对
rBMVECs 损伤机制[10]及保护措施进行深入研究有
重要的临床意义。
鉴于“肾阴亏虚，气血不足影响脑功能及其他
脏腑功能，因虚致实，实邪瘀阻脑络则发为中风”
的病机认识，提出了“益气活血”改善中风之症。
“药对”在中医方剂配伍中占有非常重要的地位，
较之用单味药简单堆砌可以成倍提高。临床中常用
黄芪、川芎配伍治疗中风。黄芪为补气要药，为“气
中血药”，川芎辛散温通，既能活血，又能行气，
为“血中气药”，重用可引药上达巅顶，旁通四肢。
二者配伍，使补而不滞，从而消散血瘀。近年来有
很多对黄芪、川芎各有效成分对脑缺血内皮细胞的
研究报道[11-12]，但对于配伍组合[5,13]的研究较少，
本实验研究了黄芪、川芎的有效成分正交组合对缺
氧 rBMVECs 的保护作用。
脑缺血缺氧时，能量代谢障碍，导致大量 Na+
内流，K+外流，细胞膜电位下降，产生去极化，引
发大量 Ca+内流引起脑细胞损伤，血脑屏障破坏，产
生大量氧自由基可使生物膜中的多不饱和脂肪酸发
生过氧化反应，引起细胞损伤，诱导细胞凋亡[14]。
SOD 是机体内一种清除氧自由基的特异酶，有抗氧
化作用，SOD 活性的高低间接反映了机体清除氧自
由基的能力。细胞凋亡是由多因素引起的，研究显
示 caspase 底物的切割是细胞凋亡过程中最关键的
事件，其中 caspase-3 作为主要的效应 caspase，经
过活化后作用于胞内多种的蛋白质和酶类，产生多
种凋亡信号来切割某些蛋白质，诱导细胞凋亡[15]。
Caspase-8 作为启动型发挥作用，作为执行型参与细
胞凋亡[16]。
本实验研究表明，模型组较对照组 SOD 活性、
细胞早期凋亡率、细胞周期、caspase-3 和 caspase-8
基因的表达有显著差异（P＜0.01），与模型组相比，
给药组明显增强了细胞内 SOD 活性，改善了细胞能
量代谢，有效抑制了细胞 G1/S 期阻滞以及 caspase-3
和 caspase-8 基因的表达，抑制了细胞早期凋亡。在
保护 rBMVECs 缺氧损伤作用时，不同给药组在不同
的保护机制差异较显著（P＜0.01），通过用极差分
析法分析正交试验结果，最终选出 E2B2C3D2A1（即
藁本内酯 5 μg/mL、川芎嗪 10 μg/mL、阿魏酸 20
μg/mL、毛蕊异黄酮 10 μg/mL、黄芪甲苷 10 μg/mL）
为较优组合。综上所述，黄芪、川芎的有效成分配
伍对 SD 乳鼠 rBMVECs 缺氧损伤有显著的保护作
用，其机制可能与保护细胞膜稳定性，提高氧自由
基清除能力，抑制细胞凋亡有关。
本研究初步探讨了黄芪、川芎药对中主要成分配
伍对 rBMVECs 缺氧损伤的保护作用及机制，并初步
确定了各成分配伍的较优比例，为黄芪、川芎临床用
药配伍应用提供了依据，但具体组方比例仍需深入研
究确定，配伍组方的药理作用也需体内实验验证。
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