全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 16期 2016年 8月

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白芷香豆素类化合物与 P-糖蛋白体外亲和作用研究
董 伟，管雪静，廖正根，卢雪萍，梁新丽*，朱卫丰
江西中医药大学 现代中药制剂教育部重点实验室，江西 南昌 330004
摘 要：目的 研究白芷香豆素类化合物（欧前胡素、异欧前胡素、佛手柑内酯、氧化前胡素）在体外对 P-糖蛋白（P-gp）
三磷酸腺苷（ATP）酶活性的影响，进而探讨白芷香豆素类成分影响 P-gp介导药物转运的机制。方法 采用 ATP酶活性测
试法判断白芷香豆素类化合物是否为 P-gp的底物。结果 欧前胡素和氧化前胡素各质量浓度组平均荧光强度值（ΔRLUTC）
均大于基础平均荧光强度值（ΔRLUbasal）；异欧前胡素中、低质量浓度组及佛手柑内酯高、低质量浓度组 ΔRLUTC 小于
ΔRLUbasal。结论 欧前胡素和氧化前胡素为非浓度依赖的 P-gp ATP酶抑制剂，异欧前胡素、佛手柑内酯在低质量浓度时可
抑制 ATP酶活性，对 P-gp具有抑制作用；在高质量浓度时可诱导 ATP酶活性，对 P-gp具有诱导作用。
关键词：白芷；香豆素类；P-糖蛋白；亲和力；欧前胡素；异欧前胡素；佛手柑内酯；氧化前胡素
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)16 - 2893 - 04
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.16.020
In vitro study on affinity of coumarins in Angelicae Dahuricae Radix and P-gp
DONG Wei, GUAN Xue-jing, LIAO Zheng-gen, LU Xue-ping, LIANG Xin-li, ZHU Wei-feng
Key Laboratory of Modern Preparation of Traditional Chinese Medicine (TCM), Ministry of Education, Jiangxi University of TCM,
Nanchang 330004, China
Abstract: Objective To study the effects of coumarins in Angelicae Dahuricae Radix (imperatorin, isoimperatorin, bergapten, and
oxypeucedanin) on the activities of adenosine triphosphate (ATPase) in P-glycoprotein (P-gp) in vitro and to investigate the P-gp
mediated meschanism in transport of drug. Methods The ATPase activity assay was used to identify whether the coumarins in
Angelicae Dahuricae Radix were P-gp substrates or not. Results The average fluorescent values (ΔRLUTC) of imperation and
oxypeucedanin at each concentration were greater than average basic fluorescence value (ΔRLUbasal). The average fluorescent values
(ΔRLUTC) in medium and low concentration of isoimperatorin and bergapten groups were lower than average basic fluorescence value
(ΔRLUbasal). Conclusion Imperation and oxypeucedanun are non-concentration dependent P-gp ATP inhibitors. Isoimperatorin and
bergamot lactones could inhibit the ATPase activity at low concentration and have the inhibitory effect on P-gp. At high concentration,
the activity of ATPase can be induced so as to induce P-gp.
Key words: Angelicae Dahuricae Radix; coumarins; P-plycoprotein; affinity; imperatorin; isoimperatorin; bergapten; oxypeucedanin

P-糖蛋白（P-glycoprtein，P-gp）为 20世纪 80
年代发现的由人体多药耐药基因 1（MDR1）基因
编码的跨膜转运蛋白[1]，其能在 ATP酶水解释放出
能量的驱动下将异源性物质“泵”出细胞外（外排
功能），从而降低细胞内的药物浓度[2-3]。白芷为我
国大宗常用中药材品种之一，具有祛风散寒、燥湿
排脓、止痛等功效[4]。而其中含有的香豆素类化合
物是一类重要的有效成分，具有抗肿瘤、抗病毒、
抗凝血、止血、平喘、保护血管和抗骨质疏松等作
用[5]。本课题组前期研究了白芷香豆素类化合物（欧
前胡素、异欧前胡素、佛手柑内酯、氧化前胡素）
在 Caco-2细胞的跨膜转运，结果表明欧前胡素、异
欧前胡素、氧化前胡素能促进长春新碱透过 Caco-2
细胞单层转运，佛手柑内酯对长春新碱透过 Caco-2
细胞单层转运有抑制作用[6]。本研究通过研究白芷
香豆素类化合物对 ATP 酶活性的影响，进而探讨

收稿日期：2016-03-29
基金项目：江西省青年科学基金资助项目（20161ACB21020）；江西省青年科学家培养对象资助项目（20153BCB23019）；国家青年自然科学
基金资助项目（81303237）；中国博士后基金（2016M590606）
作者简介 董 伟，讲师，主要从事中药药效物质基础研究。E-mail: sober96@foxmail.com
*通信作者 梁新丽 Tel: (0791)87118 658 E-mail: paln7@163.com
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其对 P-gp 功能的影响，为阐明白芷香豆素类化合
物与其他药物的相互作用提供依据。
1 材料
多功能酶标仪（VariosKan Flash，Thermo Fisher
Scinentific，美国）；未经处理的 96 孔板（美国
Corning公司）；P-gp-GloTM检测体系（由 P-gp膜、
ATP检测基质、ATP检测缓冲液、P-gp检测缓冲液、
维拉帕米、Mg-ATP、矾酸钠等组成，均来自美国
Promega公司）；二甲基亚砜（北京索来宝科技有限
公司）；佛手柑内酯对照品（上海亿欣生物科技有
限公司，批号 10042131）；氧化前胡素对照品（上
海融禾医药科技发展有限公司，批号 100420）；欧
前胡素对照品（批号 110826-200712）、异欧前胡素
对照品（批号 110827-200407），中国食品药品检定
研究院，以上各对照品质量分数均≥98%。
2 方法
2.1 ATP酶标准曲线的建立
制备Mg-ATP标准液，将Mg-ATP溶解于 P-gp
检测缓冲液中，使Mg-ATP标准液系列浓度分别为
30、15、7.5、3.75 mmol/L，各取 10 μL加入 96孔
板。在检测前加入 ATP酶检测液，使终浓度分别为
3、1.5、0.75、0.375 mmol/L。最后用多功能酶标仪
测得其荧光强度值，将荧光强度值与 ATP浓度进行
线性回归分析，绘制 ATP标准曲线。
2.2 工作液的制备
用 P-gp 检测缓冲液稀释维拉帕米、矾酸钠、
Mg-ATP与 P-gp膜，使最终浓度分别为 0.5、0.25、
25、1.25 mmol/L。
将待测药物溶解于 P-gp 检测缓冲液中，制备
2.5倍浓度。在检测荧光前加入 ATP 检测液，使各
药物终质量浓度分别为欧前胡素 10、5、1 μg/mL；
异欧前胡素 10、5、1 μg/mL；佛手柑内酯 10、5、
1 μg/mL；氧化前胡素 20、5、1 μg/mL；以上药物
质量浓度均依据MTT实验结果确定。
2.3 ATP活性检测
（1）添加 20 μL P-gp检测缓冲液到标有“NT”
的孔中（空白）；（2）添加 20 μL 0.5 mmol/L矾酸钠
到标有“矾酸钠”和“ATP标准”的孔中；（3）将
0.25 mmol/L 维拉帕米添加到标有“Ver”的孔中；
（4）添加 2.5倍浓度的各测试化合物 20 μL至标有
“TC”的孔中；（5）添加 1.25 mmol/L P-gp膜 20 μL
至各孔，在 37 ℃孵育 5 min；（6）除“ATP标准”
孔外，其他孔加入 25 mmol/L Mg-ATP各 10 μL，
37 ℃孵育 40 min；（7）在下一步操作的 2 min前，
添加 Mg-ATP 标准液至“ATP 标准”相应的孔中；
（8）从 37 ℃孵育箱中取出 96孔板，停止反应，每
孔添加 ATP检测试剂各 50 μL；（9）将 96孔板放在
振动筛上混合，在室温孵育 20 min，使之产生荧光
信号；（10）使用酶标仪检测，读取荧光强度值。
2.4 数据处理[7]
计算矾酸钠组平均荧光强度值（RLU 矾酸钠）与空白
组平均荧光强度值（RLUNT）的差值，得到ΔRLUbasal，
反映基础 P-gp ATP酶活性。计算RLU 矾酸钠与测试化合
物组平均荧光强度值（RLUTC）的差值，得到
ΔRLUTC，反映存在受试化合物的情况下 P-gp ATP
酶的活性。
如果 RLUTC＜RLUNT，则受试化合物可诱导
P-gp ATP酶活性；如果RLUNT＜RLUTC≤RLU 矾酸钠，
则受试化合物可抑制 P-gp ATP酶活性；如果RLUTC＝
RLUNT，则受试化合物对 P-gp ATP酶无作用。
如果 ΔRLUTC＞ΔRLUbasal，则受试化合物为 P-gp
ATP 酶活性刺激物；如果 ΔRLUTC＝ΔRLUbasal，则受
试化合物对 P-gp ATP酶活性无影响；如果ΔRLUTC＜
ΔRLUbasal，则受试化合物是 P-gp ATP酶活性抑制剂。
采用 SPSS 19.0软件进行统计分析，数据以荧
光强度值表示，组间采用配对样本 t检验分析。
3 结果
3.1 ATP标准曲线
ATP标准曲线为 Y＝5.665 847 11×106 X＋1.75×
106，R2＝0.993 2。结果表明，荧光强度值与 ATP
浓度呈线性关系，且相关性较好。如果反应消耗
ATP，将会产生较弱的信号，反映 ATP的浓度相对
较低；如果不消耗 ATP，荧光信号将相对较强。
3.2 各对照组荧光强度
本实验的空白组、阳性对照组（维拉帕米）及
阴性对照组（矾酸钠）的荧光强度值如图 1所示。
空白组的荧光强度比矾酸钠组的低，反映了 P-gp
ATP酶活性的基础水平。矾酸钠是一种 P-gp选择性
抑制剂，经矾酸钠处理的样品没有 P-gp ATP 酶活
性，所以矾酸钠处理组被选为阴性对照。维拉帕米
是 P-gp的底物，可以激活 P-gp ATP酶活性，所以
被选为阳性对照底物。维拉帕米组的荧光强度值小
于矾酸钠组，即维拉帕米可激活 P-gp ATP酶活性。
3.3 测试药物组的荧光强度
不同质量浓度测试药物组的荧光强度值结果
见表 1。
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图 1 各对照组的荧光强度值 ( x±s, n = 3)
Fig. 1 Fluorescence intensity of each control group ( x±s, n = 3)
3.4 受试物对 P-gp ATP酶活性的影响以及与基础
荧光强度值的比较
各受试物对 P-gp ATP 酶活性的影响通过
ΔRLUTC与 ΔRLUbasal的比较来反映，结果见图 2。欧
前胡素和氧化前胡素 ΔRLUTC均大于 ΔRLUbasal，推
测这2种化合物对P-gp有诱导作用；且这2组的RLU
值都小于维拉帕米组，由此推测在反应过程中消耗
的ATP较少，与 P-gp的亲和力较弱；每种化合物的
高、中、低 3个质量浓度的 RLU值均无明显差异，
可推测其对 P-gp的诱导作用无浓度依赖性。中、低
质量浓度异欧前胡素及高、低质量浓度佛手柑内酯
ΔRLUTC均小于 ΔRLUbasal，推测其可能是ATP酶抑制
剂，能够抑制 P-gp的活性；可推测其对 P-gp的抑制
作用为浓度依赖型。经典的 P-gp 抑制剂维拉帕米与
表 1 不同质量浓度测试化合物的荧光强度值 ( x±s, n = 3)
Table 1 Fluorescence intensity of tested compounds at
different concentration ( x±s, n = 3)
组别 ρ/(μg·mL−1) 荧光强度值
空白 — 1 214 386± 51 511
矾酸钠 35.5 1 253 684± 92 967
维拉帕米 227.3 1 203 105± 81 863
欧前胡素 10 1 165 897± 97 342
5 1 196 193±104 735
1 1 186 906±105 541
异欧前胡素 10 1 048 454± 88 899**
5 1 234 199± 52 311
1 1 335 866± 47 809
佛手柑内酯 10 1 214 204± 67 440
5 1 189 106± 80 124
1 1 323 520±119 697
氧化前胡素 20 1 194 671± 93 275
5 1 248 320±102 735
1 1 192 608± 84 344
与空白组比较：**P＜0.01
**P < 0.01 vs blank group
P-gp 的亲和力较高，与 P-gp 结合时消耗 ATP，所
以使得剩余 ATP的量较少，测得荧光强度较弱。另
外，高质量浓度的异欧前胡素、中质量浓度的佛手
柑内酯，其 ΔRLUTC大于 ΔRLUbasal，由此可推测出
这 2种化合物在此质量浓度时对 P-gp有诱导作用。






图 2 各待测化合物对 P-gp ATP酶活性的影响及与基础荧光值的比较
Fig. 2 Effects of tested compounds on P-gp ATPase activity and their comparison with basal fluorescence value
空白 矾酸钠 维拉帕米
1.4
1.3
1.2
1.1
1.0



荧
光
强
度
值
×
10
5
10 5 1 basal
欧前胡素/(μg·mL−1)
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0



Δ
RL
U
×
10
5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
−0.5
−1.0



20 5 1 basal
氧化前胡素/(μg·mL−1)
10 5 1 basal
佛手柑内酯/(μg·mL−1)
10 5 1 basal
异欧前胡素/(μg·mL−1)
Δ
RL
U
×
10
5
Δ
RL
U
×
10
4
Δ
RL
U
×
10
5
8.0
6.0
4.0
2.0
0
−2.0
−4.0
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0



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4 讨论
P-gp是一种能量依赖性转运蛋白，能利用 ATP
水解释放的能量主动地将疏水亲脂性药物转运至
细胞外，分布于人体很多正常组织，如肠道、肝、
肾、胎盘屏障的上皮细胞，其对药物的吸收、分布、
代谢、排泄均有重要影响。在药物的相互作用和多
药耐药的产生中发挥着重要作用。
P-gp 可使细胞内药物浓度低于起效浓度而产生
多药耐药，降低药物疗效。为了逆转 P-gp引起的多
药耐药，目前已开发出许多 P-gp调节剂（如维拉帕
米、环孢菌素 A、他莫昔芬等）。而中医临床及实验
研究表明，中医方药可增加化疗的治疗效果，中药
及其单体成分可逆转肿瘤的多药耐药性，如广泛存
在于植物中的黄酮类成分槲皮素是 P-gp的底物，可
竞争 P-gp，从而影响ATP发挥作用，进而抑制 P-gp
的外排功能[8]。因此，充分了解药物之间在 P-gp 环
节可能产生的相互作用，对于寻找促进药物的转运
和吸收的手段，提高药物疗效具有重要意义。
在本实验中，采用 ATP 酶活性测试法，基于
ATP产生的荧光信号强度，通过考察待测试药物对
ATP酶的活性的影响来确定其是否通过干扰ATP酶
活性而阻断了 P-gp 的功能。P-gp 依赖的荧光信号
的降低反映了 P-gp 对 ATP 的消耗，信号强度降低
的程度越大，P-gp的活性越强。
体外实验显示，P-gp介导的底物转运需要依靠
ATP水解释放能量形成底物的浓度梯度。P-gp与底
物结合后，ATP酶的活性可提高 3～4倍，甚至 20
倍[9]。底物所致 ATP酶活性的改变是双向性的，有
一些物质在高浓度时起抑制作用，却在低浓度时可
以增强 ATP 酶的活性，而另一些药物对 ATP 酶的
增强作用存在浓度依赖性。对 P-gp ATP酶活性的诱
导与抑制作用都是化合物与 P-gp相互作用的指标。
本研究结果表明，欧前胡素、异欧前胡素、佛手柑
内酯和氧化前胡素均为 P-gp底物，其中，欧前胡素
及氧化前胡素为非浓度依赖性的 ATP酶诱导剂；异
欧前胡素和佛手柑内酯为浓度依赖的 ATP 酶双向
调节因子，高质量浓度的异欧前胡素、中质量浓度
的佛手柑内酯可诱导 ATP 酶活性，对 P-gp 具有诱
导作用，中、低质量浓度的异欧前胡素及高、低质
量浓度的佛手柑内酯对 P-gp具有抑制作用。
参考文献
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